一种高效提取微生物油脂的方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效提取微生物油脂的方法。具体而言，本发明在混合油脂提取溶剂与微生物、破壁后添加水或低碳链醇水溶液，由此可简单、高效地提取油脂。
【专利说明】一种高效提取微生物油脂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物油脂提取领域，具体涉及提取微生物油脂的方法。
【背景技术】
[0002]通过培养收获的微生物细胞一般存在于水相体系中，颗粒细小，含油量高，具有坚韧的细胞壁。因此传统的植物油提油工艺不适用于微生物油脂的制备。一般微生物油脂的制备包括4个步骤:1.在发酵罐中利用适当培养基对微生物进行培养；2.收获微生物的生物质并加以处理(如洗涤/脱水或干燥);3.细胞破壁，包括物理处理(蒸煮、蒸汽爆破)、化学(热碱、螯合剂)、机械(压榨、均质、研磨)等手段；4.从细胞碎片中提取微生物油脂(如溶剂萃取、直接离心分离)。
[0003]US 006166231A提出在水相环境下对微生物细胞进行破壁，然后进行液液萃取操作。该方法的缺点是:1.水相中的微生物油脂含量较低，萃取过程溶剂耗量大；2.含有细胞碎片的水相体系粘度很高，在与溶剂混合的过程中极易乳化，后续分离较为困难；3.水相和溶剂相传质效率较低，往往需要多次重复萃取以提高回收率。
[0004]CN 01806424.8提出了无溶剂提取微生物油脂的方法。在水相环境下对微生物细胞进行破壁，然采用多次水洗、离心的方法，提取微生物油脂。该方法的缺点是:1.水相体系的破碎细胞混合物粘度较高，极易乳化，直接进行离心分离较为困难；2.通过水洗可以降低混合物粘度，但是也容易夹带微生物油脂，油脂提取率偏低；3.多次水洗还会产生大量的工业污水。
[0005]US 20090156694A1提出了一种较为新颖的微生物油脂提取方法。将载体油与微生物干物质混合，一同经过机械破壁处理，再固液分离、过滤，得到含有微生物油脂的混合油月旨。该方法的缺点较为明显，所获得的油脂为混合油脂，目标产物(如ARA、DHA)含量低。
`[0006]Antonio Ramirez Fajardo 等(Lipid extraction from the microalgaPhaeodactylum tricornutum, Eur.J.Lipid Sc1.Technol.109 (2007) 120 - 126)公开了分别使用到高纯度乙醇(96%)、和水/正己烷两种溶剂体系进行两步提取的方法，经过连续四次正己烷/水醇溶液体系萃取，油脂回收率才能达到80%。另外，96%乙醇对油脂溶解性不强，需要长时间萃取；乙醇提取，单次提取率很低，所以柏还需要重复萃取。因此，该文献公开的方法油脂回收率低，需反复萃取，耗时长。
[0007]因此，本领域仍需一种能简单、高效地其它微生物油脂的方法。
【发明内容】
[0008]本发明人发现，在混合油脂提取溶剂(例如6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚、丙酮等常规油脂提取溶剂)与微生物、破壁后添加水或低碳链醇水溶液可简单、高效地提取油月旨，由此完成本发明。
[0009]因此，本发明的目的在于提供一种提取微生物油脂的方法，所述方法包括预分散、破壁、添加低碳链醇溶液、固液分离和混合油脱溶等步骤。[0010]更具体而言，本发明提取微生物油脂的方法包括:
[0011](1)将油脂提取溶剂与微生物细胞混合，获得混合物；
[0012](2)对步骤(1)所获得的混合物实施破壁处理，获得破壁后的混合物料；和
[0013](3)将水、低碳链醇水溶液、或水与无水低碳链醇添加到步骤(2)所获得的混合物料中；
[0014]从而对微生物油脂进行提取。
[0015]在一些优选的具体实施例中，该方法还可包括:
[0016](4)对步骤(3)所得的混合物实施固液分离，获得含有微生物油脂和溶剂的混合油；优选的，所述固液分离通过离心分离或自然沉降分离；和
[0017](5)脱除所述混合油中的溶剂，获得微生物油脂。
[0018]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，用于提取油脂的溶剂包括但不限于6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚、丙酮等常规油脂提取溶剂，优选正己烷。
[0019]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，油脂提取溶剂与微生物细胞的混合比例是10:1~1:2 (w/w),优选5:1~1:1 (w/w)。
[0020]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，步骤(3)中加入水和无水低碳链醇，加入顺序不限。
[0021]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，步骤(3)中加入的水或低碳链醇水溶液的量是微生物细胞重量的0.1~10倍，优选1-5倍。
[0022]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的低碳链醇选自含有I 一6个碳原子的一元醇或多元醇，优选含有I 一 6个碳原子的一元醇或二元醇，更优选使用的低碳链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇和丁醇中的一种或多种。
[0023]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量I~5倍的浓度为30%~50%的乙醇水溶液。
[0024]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量I~3倍的浓度为30%~50%的异丙醇水溶液。
[0025]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量I~3倍的浓度为50%~70%的甲醇水溶液。
[0026]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，采用常规粉、液分散设备，如IKA CMS2000固、液混合设备，混合溶剂和微生物细胞。
[0027]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，采用机械设备破壁。适用于本发明的机械设备包括但不限于砂磨机、高压均质机、高速剪切机、胶体磨等。可采用其中的一种或几种串联，处理上述混合物，破坏微生物细胞的细胞壁。优选采用砂磨机。根据物料情况，可选择循环操作，以提高破壁率和提油率。
[0028]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，在步骤(1)之前还包括提供干燥的微生物细胞的步骤。
[0029]在分别采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为产油脂的微藻，优选的，油脂为含有胆固醇，植物留醇，链留醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素，叶黄素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素和/或脂肪酸的油脂，优选的脂肪酸为亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，双高Y -亚麻酸和Y -亚麻酸或它们的混合物，优选含多不饱和脂肪酸的油脂，更优选为含二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，和十八碳四烯酸或它们的混合物的油脂。
[0030]在分别釆用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物选自:绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa),普通小球藻(Chlorellavulgaris),捕圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)， Chlorella emersonii， Chlorellasorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，微小小球藻(Chlorellaminutissima)，Chlorella protothecoides,小球藻(Chlorella zofingiensis),绿藻门中的 Brachiomonas submarina, Chlamydobonas reinhardtii， Chlamydomonas acidophila，雨生红球藻(Haematococcus pluvial is)，湖泊红球藻(Haematococcus lacustris )，斜生極藻(Scenedesmus obliquus)，Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica,扁藻(Tetraselmis chuii),四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)，Tetraselmisverrucosa,微芒藻(Micractinium pusillum);娃藻门的筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)， Nitzschia laevis, Nitzschia alba, Nitzschia fonticola， Naviculaincerta,羽纹娃藻(Navicula pelliculosa);蓝藻门的多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis);金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ;甲藻门的前环藻(Amphidiniumcarterae)，寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii);裸藻门的 Euglena gricilis ;红藻门的单细胞红藻(Galdieria sulphuraria)，以及它们的混合物。
[0031]在分别釆用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属(Mortierella)的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium 属的微生物、Labyrinthula 属的微生物、Labyrinthuloides 属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属(Phaeodactylum)的微生物，微绿球藻属(Nanochloropsi s)的微生物，裸藻属(Euglena)的微生物，四膜虫属(Tetrahymena)的微生物，螺旋藻属(Spirulina)的微生物，和吾肯氏壶藻属(Ulkenia)的微生物，隐甲藻属(甲藻)(Crypthecodinium(Dinofagellates))的微生物，以及它们的混合物，优选使用的微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属(甲藻)的微生物，以及它们的混合物。
[0032]在分别釆用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为Schizochytrium sp.。
[0033]在采用采用前述方法的一些优选的具体实施例中，使用的微生物为ATCC20888和/ 或 SR21。
[0034]本发明通过添加水或低碳链醇水溶液，可显著提高微生物油脂的单次提取率。如表1所示，通过加入少量的乙醇水溶液，即可达到并超过普通萃取方法3次萃取后的总回收率。这将极大简化提取步骤，减少重复提取的能耗和设备投入。
[0035]表1:添加乙醇水溶液对单次萃取回收率的影响。
[0036]
【权利要求】
1.一种提取微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)将油脂提取溶剂与微生物细胞混合，获得混合物； (2)对步骤(1)所获得的混合物实施破壁处理，获得破壁后的混合物料；和 (3)将水、低碳链醇水溶液、或水与无水低碳链醇添加到步骤(2)所获得的混合物料中； 从而对微生物油脂进行提取。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: (4)对步骤(3)所得的混合物实施固液分离，获得含有微生物油脂和溶剂的混合油；优选的，所述固液分离通过离心分离或自然沉降分离；和 (5)脱除所述混合油中的溶剂，获得微生物油脂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂选自以下溶剂组成的组:6#溶剂油、正己烷、石油醚、乙醚和丙酮。
4.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂与所述微生物细胞的混合比例是10:1~1:2 (w/w)。
5.如权利要求4所述 的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂与所述微生物细胞的混合比例是5:1~1:1 (w/w)。
6.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入的水或低碳链醇水溶液的量是微生物细胞重量的0.1~10倍。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入的水或低碳链醇水溶液的量是微生物细胞重量的1-5倍。
8.如权利要求书I一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述低碳链醇选自含有I 一6个碳原子的一元醇或多元醇，优选含有I 一 6个碳原子的一元醇或二元醇。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述低碳链醇选自:甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇和丁醇中的一种或多种。
10.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量I~5倍的浓度为30%~50%的乙醇水溶液。
11.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量I~3倍的浓度为30%~50%的异丙醇水溶液。
12.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述油脂提取溶剂是正己烷，加入占微生物细胞重量I~3倍的浓度为50%~70%的甲醇水溶液。
13.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，采用砂磨机、高压均质机、高速剪切机、胶体磨中的一种或多种实施机械破壁处理。
14.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(1)之前还包括提供干燥的微生物细胞的步骤。
15.如权利要求1一 3中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为产油脂的微藻。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述油脂为含有胆固醇，植物留醇，链甾醇，生育三烯酚，生育酚，泛醌，类胡萝卜素，叶黄素，黄体素，番茄红素，虾青素，玉米黄质，角黄素和/或脂肪酸的油脂；优选的脂肪酸为亚油酸，ω-3和ω-6高不饱和脂肪酸，双高Y-亚麻酸和Y-亚麻酸或它们的混合物；优选含多不饱和脂肪酸的油脂；更优选为含二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸，花生四烯酸，和十八碳四烯酸或它们的混合物的油脂。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述微生物选自:绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorellavulgaris),捕圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)， Chlorella emersonii， Chlorellasorokiniana，Chlorella saccharophila，Chlorella regularis，微小小球藻(Chlorellaminutissima)，ChloreIlaprotothecoides,小球藻(Chlorella zofingiensis),绿藻门中的 Brachiomonas submarina, Chlamydobonas reinhardtii，Chlanydomonasacidophila,雨生红球藻(Haematococcus pluvial is)，湖泊红球藻(Haematococcus Iacustris )，斜生極藻(Scenedesmus obliquus)，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，扁藻(Tetraselmis chuii)，四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathele)，Tetraselmisverrucosa,微芒藻(Micractinium pusillum);娃藻门的筒柱藻(Cylindrothecafusiformis)， Nitzschia laevis， Nitzschia alba, Nitzschia fonticola， Naviculaincerta，羽纹娃藻(Navicula pelliculosa);蓝藻门的多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis);金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ;甲藻门的前环藻(Amphidiniumcarterae)，寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii);裸藻门的 Euglena gricilis ;和红藻门的单细胞红藻(Galdieria sulphuraria)，以及它们的混合物。
18.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述微生物为选自破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微生物、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微生物、被孢霉属(Mortierella)的微生物、Althornia属的微生物、Aplanochytrium属的微生物、Japonochytrium 属的微生物、Labyrinthula 属的微生物、Labyrinthuloides 属的微生物、Crypthecodinium属的微生物，褐指藻属(Phaeodactylum)的微生物，微绿球藻属(Nanochloropsis)的微生物，裸藻属(Euglena)的微生物，四膜虫属(Tetrahymena)的微生物，螺旋藻属(Spirulina)的微生物，和吾肯氏壶藻属(Ulkenia)的微生物，隐甲藻属(Crypthecodinium(Dinofagellates))的微生物，以及它们的混合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述微生物选自破囊壶菌属的微生物、裂殖壶菌属的微生物、隐甲藻属(甲藻)的微生物，以及它们的混合物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述微生物为Schizochytriumsp.。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述微生物为ATCC20888和/或SR21。
【文档编号】C11B1/02GK103589503SQ201210287434
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月13日 优先权日:2012年8月13日
【发明者】洪丰, 王勇, 姜元荣, 邹滢, 张敏 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司