组合使用脂壳寡糖和/或壳寡糖与解磷微生物促植物生长的制作方法

组合使用脂壳寡糖和/或壳寡糖与解磷微生物促植物生长的制作方法
【专利摘要】公开了加强植物生长的方法，包括：a)用有效量的至少一种解磷微生物处理植物种子，该解磷微生物可以包括青霉属真菌的菌株，以及b)用有效量的至少一种脂壳寡糖(LCO)和/或至少一种壳寡糖(CO)处理该种子或从该种子萌发的植物，其中在收获时，该植物与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比，表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根部数量、增加的根部长度、增加的根部质量、增加的根部体积和增加的叶面积中的至少一种。
【专利说明】组合使用脂壳寡糖和/或壳寡糖与解磷微生物促植物生长
[0001 ]本申请是2012年9月14日提交的发明名称为"组合使用脂壳寡糖和/或壳寡糖与解 磷微生物促植物生长"、申请号为"201280044903.9"的发明专利申请的分案申请。
【背景技术】
[0002] 革兰氏阴性土壤菌根瘤菌属（Rhizobiaceae)和慢生根瘤菌属 (Bradyrhizobiaceae)与豆科植物例如大豆的共生关系有较多文献记载。这些关系的生化 基础包括分子信号传导的交换，其中，植物对细菌的信号化合物包括黄酮、异黄酮和黄烷酮 类，而细菌对植物的信号化合物称为脂壳寡糖(LC0)，其包括慢生根瘤菌和根瘤菌nod基因 表达的终产物。这些细菌与豆科植物之间的共生使得豆科类能够固定大气中的氮以用于植 物生长，由此免去对氮肥的需求。由于氮肥会显著增加作物的成本，并且与许多污染效应相 关，农产业继续努力运用这种生物关系并开发新的用于提高植物产量而不增加氮类肥料的 使用的作用剂和方法。
[0003] 美国专利第6,979,664号教导了增强植物作物的种子萌发或出苗的方法，包括以 下步骤:提供包含有效量的至少一种脂壳寡糖和农业上适用的载体的组合物，以及在种子 或幼苗的紧邻处以相较于未经处理的种子或幼苗能增强种子萌发或出苗的有效量施用该 组合物。
[0004] 关于该概念的进一步拓展在W0 2005/062899中有过教导，其涉及至少一种植物诱 导剂（即LC0)与杀真菌剂、杀虫剂或其组合的结合，以增强植物特性如植物占地面积、生长、 强健度和/或产量。教导称这些组合物和方法适用于豆科植物和非豆科植物，并且可以用于 处理种子(临播种前）、苗、根或植物。
[0005] 相似地，W0 2008/085958教导了用于在豆科和非豆科中增强植物生长和作物产量 的组合物，其包含LC0与另一种活性剂如几丁质或壳聚糖、类黄酮化合物、或除草剂的组合， 其可以同时或相继地应用于种子和/或植物。与在'899公开中的情况一样，'958公开教导了 在临播种前对种子进行处理。
[0006] 最近，Halford，"Smoke Signals"，Chem.Eng.News(2010年4月 12 日）第37~38页报 道，在森林起火后，烟中所含的karrikin或丁烯羟酸内酯起到生长刺激剂的作用并促使种 子萌发，并且能滋补已储存的种子如玉米、西红柿、莴苣和洋葱。这些分子是美国专利第7， 576,213号的主题。
[0007] 为保持健康生长，植物还必须从其生长的土壤中提取多种元素。这些元素包括磷 和所谓的微量营养素(例如，铜、铁和锌），但许多土壤缺乏这些元素，或者它们仅以植物不 易摄取的形式含有这些元素(通常认为植物不易摄取这些必需元素，除非必需元素以溶解 的形式存在于土壤中）。
[0008] 为抵消这些缺乏，通常将缺乏元素源施用于土壤，以提高生长速度以及作物产出。 例如，磷酸盐经常被加至土壤中，以消除有效磷的匮乏。作为商用肥料而加至土壤的磷酸盐 (例如，磷酸二氢铵或重过磷酸^(triple-super phosphate))容易被植物利用，但又快速 地在土壤中转化成相对不可用的形式。据估计，在施用的当年，仅10~30%的磷酸盐肥料被 植物利用，三分之一至一半的所施用磷酸盐肥料可能从未被植物回收。
[0009] 美国专利第5,026,417号描述了拜赖青霉(？6111(^111111111^1&1 &6)的分离菌株，当 将其施用至土壤时，能够改善植物对磷的摄取。
[0010] 然而，对于改进或增强植物生长的体系仍存在需求。

【发明内容】

[0011] 本发明的第一个方面涉及一种包，包含第一容器和第二容器，其中，第一容器包含 至少一种解磷微生物和第一农艺学上可接受的载体，且其中第二容器包含至少一种脂壳寡 糖(LC0)和/或至少一种壳寡糖(C0)以及第二农艺学上可接受的载体，其中，第一农艺学上 可接受的载体和第二农艺学上可接受的载体可以相同的或不同的，且其中至少一种解磷微 生物和至少一种LC0和/或至少一种⑶各自以在施用至植物或其种子时与未经处理的植物 或其种子相比能有效增强植物生长的量分别存在于第一容器和第二容器中。本文所使用的 术语"未经处理的"是指种子或植物未经任一活性物质（即，解磷微生物、LC0或C0)处理。
[0012] 本发明的另一方面涉及一种包，包含第一容器和第二容器，其中第一容器包含至 少一种包括青霉属(Penici Ilium)真菌菌株的解磷微生物和第一农艺学上可接受的载体， 且其中第二容器包含至少一种脂壳寡糖(LC0)和/或至少一种壳寡糖(C0)以及第二农艺学 上可接受的载体，其中第一农艺学上可接受的载体和第二农艺学上可接受的载体可以是相 同的或不同的，且其中至少一种解磷微生物和至少一种LC0和/或至少一种C0各自以在施用 至植物或其种子时与未经处理的植物或其种子相比能有效增强植物生长的量分别存在于 第一容器和第二容器中。
[0013] 本发明的另一方面涉及一种用于处理植物或其种子的农艺学组合物，包含(a)至 少一种解磷微生物和(b)至少一种脂壳寡糖(LC0)和/或至少一种壳寡糖(C0)，其各自以在 施用至植物或其种子时与未经处理的植物或其种子相比能有效增强植物生长的量存在。
[0014] 本发明的相关方面涉及用于处理植物或其种子的农艺学组合物，包含(a)至少一 种包括青霉属真菌菌株的解磷微生物和(b)至少一种LC0和/或至少一种C0、以及(c)农艺学 上可接受的载体，其中至少一种解磷微生物和至少一种LC0和/或至少一种C0各自以在施用 至植物或其种子时与未经处理的植物或其种子相比能有效增强植物生长的量存在。
[0015] 本发明的另一相关方面涉及用(a)至少一种解磷微生物、和(b)至少一种LC0和/或 至少一种C0处理(例如，涂覆于其上或布置于其上）的植物种子，其中该至少一种解磷微生 物以及至少一种LC0和/或至少一种⑶各自以在施用至种子时与未经处理的种子相比能增 强植物生长的量进行使用。解磷微生物以及LC0和/或C0可以经由相同或不同的组合物施用 至种子。还提供含有该植物种子的包。
[0016] 本发明的另一相关方面涉及用(a)至少一种包括青霉属真菌菌株的解磷微生物和 (b)至少一种LC0和/或至少一种C0进行处理(例如，涂覆于其上或布置于其上）的植物种子， 其中该至少一种解磷微生物以及至少一种LC0和/或至少一种C0各自以在施用至种子时与 未经处理的种子相比能有效增强植物生长的量进行使用。解磷微生物以及LC0和/或C0可以 通过相同的或不同的组合物施用至种子。还提供含有该植物种子的包。
[0017] 本发明的另一方面涉及增强植物生长的方法，包括a)用有效量的至少一种解磷微 生物处理(例如，施用至)植物种子，以及b)用有效量的至少一种LC0和/或至少一种⑶处理 该种子或处理(例如，施用至)从该种子萌发的植物，其中在收获时，该植物与未经处理的植 物或从未经处理的种子收获的植物相比，表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增 加的根部数量、增加的根部长度、增加的根部质量、增加的根部体积和增加的叶面积中的至 少一种。
[0018] 本发明的另一方面涉及增强植物生长的方法，包括a)用有效量的至少一种包括青 霉属真菌菌株的解磷微生物处理(例如，施用至)植物种子，以及b)用有效量的至少一种LC0 和/或至少一种C0处理该种子或处理(例如，施用至)从该种子萌发的植物，其中在收获时， 该植物与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比，表现出按蒲式耳/英亩测 量的增加的植物产量、增加的根部数量、增加的根部长度、增加的根部质量、增加的根部体 积和增加的叶面积中的至少一种。
[0019] 在一些实施方式中，种子的处理包括将至少一种解磷微生物以及至少一种LC0和/ 或至少一种C0(统称为"活性物"）直接施用至种子，该种子随后可以进行种植或在种植前储 存一段时间。种子的处理还可以包括间接处理，例如通过将活性物引入至土壤中（领域内已 知为犁沟施用）。活性物可以在单一组合物中一起使用，或者可以配制在分开的组合物中以 用于同时或相继的处理。在其他实施方式中，至少一种LC0和/或至少一种⑶可以直接地或 间接地施用至从种子萌发的植物，且至少一种解磷微生物直接地或间接地施用至该种子。 在一些实施方式中，种子用活性物之一处理，然后储存，其他活性物在种植时对种子进行处 理。在其他实施方式中，种子用至少一种解磷微生物处理，然后储存，且从该种子萌发的植 物用至少一种LC0和/或至少一种⑶处理。组合物和方法还可以包括其他植物信号分子和/ 或其他农艺学上有益的作用剂的使用。
[0020]本发明的方法同样适用于显科植物和非显科植物。在一些实施方式中，显科种子 是大豆种子。在一些其他实施方式中，经过处理的种子是非豆科种子，例如大田作物种子， 例如，诸如玉米的谷物或诸如土豆的蔬菜作物种子。
【附图说明】
[0021] 图1和图2示出可用于本发明实践中的脂壳寡糖化合物(LC0)的化学结构。
【具体实施方式】
[0022] 本文所使用的"解磷微生物"是能够增加植物可利用的磷量的微生物。解磷微生物 包括真菌菌株和细菌菌株。在实施方式中，解磷微生物是产孢子微生物。
[0023]解磷微生物的非限制性实例包括选自不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属 (Arthrobacter)、节丛抱属（Arthrobotrys)、曲霉属（Aspergillus)、固氮螺菌属 (Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、假丝酵母属 (Candida)、金色单胞菌属（Chryseomonas)、肠杆菌属（Enterobacter)、正青霉属 (Eupenicillium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克吕沃尔 菌属(Kluyvera)、微杆菌属(Microbacterium)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyces)、 类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、青霉属(PeniciIlium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷 氏菌属（Serratia)、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas)、链霉菌属（Streptomyces)、链抱囊 菌属（Streptosporangium)、Swaminathania属、硫杆菌属（Thiobaci 1 lus)、抱圆酵母属 (Torulospora)、弧菌属（Vibrio)、黄色杆菌属（Xanthobacter)和黄单胞菌属 (Xanthomonas)的菌种。
[0024] 解磷微生物的非限制性实例选自乙酸|丐不动杆菌（A c i n e t 〇 b a c t e r 0&1(30306七；!_(3118)、不动杆菌(六(3；!_116七(^3(^6『8口.）、节杆菌(六1^111'(^3(^618口.）、少抱节丛 抱菌（Arthrobotrys oligospora)、黑曲霉（Aspergillus niger)、曲霉菌（Aspergillus sp.)、Azospirillum halopraeferans、角军淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、 萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)、环状芽抱杆菌(Bacillus circulans)、地衣芽抱杆 菌(Bacillus lichen if ormis)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is)、洋葱伯克霍尔德菌 (Burkholderia cepacia)、越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis)、克瑞斯假 丝酵母（Candida krissii)、浅黄金色单胞菌（Chryseomonas luteola)、产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae)、肠杆菌 (Enterobacter sp.)、泰洛肠杆菌（Enterobacter taylorae)、微细正青霉（Eupenicillium parvum)、微小杆菌(Exiguobacterium sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、栖冷克吕沃尔 菌（Kluyvera cryocrescens)、微杆菌（Microbacterium sp.)、多枝毛霉（Mu cor ramosissimus)、蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepialid)、马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii)、浸麻类芽抱杆菌（Paenibacillus macerans)、胶质类芽抱杆菌 (Paenibac i llus mucilaginosus)、成团泛菌（Pantoea agio me r an s)、扩展青霉 (Penicillium expansum)、Pseudomonas corrugate、焚光假单胞菌（Pseudomonas f luorescens)、Pseudomonas lutea、草假单胞菌（Pseudomonas poae)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)、斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)、平凡假单胞菌 (Pseudomonas trivial is)、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)、链霉菌（Streptomyces sp·)、链抱囊菌 (Streptosporangium sp·)、Swamina than i a salitolerans、氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillus ferrooxidans)、球有抱圆酵母（Torulospora globosa)、解蛋白弧菌 (Vibrio proteolyticus)、敏捷黄色杆菌(Xanthobacter agilis)和野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris)〇
[0025] 在具体的实施方式中，解磷微生物是青霉属真菌的菌株。可用于本发明实践中的 青霉属真菌的菌株包括拜赖青霉(早先称为P.bilaii)、微白青霉(P.albidum)、桔灰青霉 (P · aurantiogriseum)、产黄青霉（P · chrysogenum)、黄暗青霉(P · citreonigrum)、桔青霉 (P · citrinum)、指状青霉（P · digitatum)、常现青霉（P · frequentas)、褐青霉（P · fuscum)、 P.gaestrivorus、光孢青霉（P. glabrum)、灰黄青霉（P.griseofulvum)、纠缠青霉 (P . impl icatum)、微紫青霉（P.janthinellum)、淡紫青霉（P.l i lacinum)、微黄青霉 (卩.111；!_11；!_〇11^611111)、蒙大拿青霉（？.11101^&1161186)、黑青霉（？.11181'；!_0&118)、草酸青霉 (P.oxalicum)、P.pinetorum、嗜松青霉（P.pinophilum)、产紫青霉（P.purpurogenum)、 P.radicans、放射青霉(P.radicum)、雷斯青霉(P.raistrickii)、皱糟青霉(P.rugulosum)、 简青霉(P · simplicissimum)、离生青霉(P · solitum)、变幻青霉(P · variabile)、毯毛青霉 (P. velutinum)、鲜绿青霉(P · viridicatum)、灰绿青霉(P. glaucum)、P · fussiporus和扩展 青霉（P. expansum) 〇
[0026] 在一个具体的实施方式中，青霉属菌种是拜赖青霉。在另一【具体实施方式】中，拜赖 青霉菌株选自ATCC 20851、NRRL 50169、ATCC 22348、ATCC 18309、NRRL 50162(Wakelin等 人，2004.13;[01?61'1:;[130;[1840:36-43)。在另一【具体实施方式】中，青霉属菌种是 P.gaestrivorus，例如，NRRL 50170(参见，Wake 1 in，同上）。
[0027] 在一些实施方式中，使用多于一种的解磷微生物，例如，至少两种、至少三种、至少 四种、至少五种、至少六种，包括不动杆菌属、节杆菌属、节丛孢属、曲霉属、固氮螺菌属、芽 孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、假丝酵母属、金色单胞菌属、肠杆菌属、正青霉属、微小杆菌 属、克雷伯氏困属、克吕沃尔困属、微杆困属、毛霉属、拟青霉属、类牙抱杆困属、青霉属、假 单胞菌属、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、链霉菌属、链孢囊菌属、Swaminathania属、硫杆菌 属、孢圆酵母属、弧菌属、黄色杆菌属和黄单胞菌属的任意组合，包括选自乙酸钙不动杆菌、 不动杆菌、节杆菌、少孢节丛孢菌、黑曲霉、曲霉菌、Azospirillum halopraeferans、解淀粉 芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德 菌、越南伯克霍尔德菌、克瑞斯假丝酵母、浅黄金色单胞菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、肠杆 菌、泰洛肠杆菌、微细正青霉、微小杆菌、克雷伯氏菌、栖冷克吕沃尔菌、微杆菌、多枝毛霉、 蝙蝠蛾拟青霉、马昆德拟青霉、浸麻类芽孢杆菌、胶质类芽孢杆菌、成团泛菌、扩展青霉、 Pseudomonas corrugate、焚光假单胞菌、Pseudomonas lutea、草假单胞菌、恶臭假单胞菌、 斯氏假单胞菌、平凡假单胞菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、链霉菌、链孢囊菌、 Swaminathania salito 1 erans、氧化亚铁硫杆菌、球有孢圆酵母、解蛋白弧菌、敏捷黄色杆 菌和野油菜黄单胞菌的一种菌种。
[0028] 在一些实施方式中，相同菌种的两个不同菌株也可以组合，例如，使用青霉属的至 少两个不同菌株。至少两个不同的青霉属菌株的组合使用具有以下优点。当施用至已经含 有不溶性(或难溶性)磷酸盐的土壤时，与仅使用一个青霉属菌株相比，组合真菌菌株的使 用将引起植物可摄取的磷的量的增加。反过来，与单独使用单个菌株相比，这可以引起磷酸 盐摄取的增加和/或土壤中生长的植物的产量的增加。菌株的组合还能使不溶性磷酸石用 作可用于有效磷量不足的土壤中的有效肥料。因此，在一些实施方式中，使用拜赖青霉的一 个株菌和P. gaestrivorus的一个株菌。在其他实施方式中，两个菌株为NRRL 50169和NRRL 50162。在另外的实施方式中，至少两个菌株为NRRL 50169和NRRL 50170。在另外的实施方 式中，至少两个菌株为NRRL 50162和NRRL 50170。
[0029] 解磷微生物可以使用本领域技术人员已知的任何适合方法进行制备，例如，使用 适当碳源的固态或液体发酵。解磷微生物优选以稳定孢子的形式进行制备。
[0030] 在一个实施方式中，解磷微生物是青霉属真菌。根据本发明的青霉属真菌可以使 用固态或液体发酵以及适当的碳源而生长。青霉属分离株可以使用本领域技术人员已知的 任何合适方法而生长。例如，真菌可以在例如马铃薯右旋糖琼脂或麦芽汁琼脂的固体生长 介质上、或在含有合适的液体介质例如Czapek-Dox培养基或马铃薯右旋糖肉汤的摇瓶中进 行培养。这些培养方法可以用在青霉菌接种物的制备中，该接种物用于处理(例如，涂覆)种 子和/或应用至将要施用于土壤的农艺学上可接受的载体。本说明书中使用的术语"接种 物"意在指代任意形式的解磷微生物（真菌细胞、菌丝体或真菌孢子、细菌细胞或细菌孢 子），其能够在温度、湿度等条件有利于真菌生长时在土壤上或土壤中增殖。
[0031] 青霉属孢子的固态生产可以例如通过接种固体介质例如泥炭或輕石类基质或谷 物而实现，谷物包括但不限于燕麦、小麦、大麦或稻。对灭菌的介质(通过高压灭菌或辐照而 实现)接种适当青霉菌的孢子悬浮液（lxl〇2~lxl〇7cfu/ml)，并依据基质将湿度调节至20~ 50%。将材料在室温下孵育2~8周。孢子也可以通过液体发酵而产生（Cunningham等人， 1990. Can J Bot. 68:2270-2274)。液体生产可以通过在能够根据本领域标准步骤而确定的 适当pH和温度条件下在任何合适的介质例如马铃薯右旋糖肉汤或蔗糖酵母提取物培养基 中培养真菌而实现。
[0032] 可以直接使用所得材料，或者可以收获孢子，经离心浓缩，配制并然后使用空气干 燥、冷冻干燥、或流化床干燥技术进行干燥（Friesen等人，2005, Appi Microbiol Biotechnol 68:397-404)，以生产可润湿的粉末。然后将可润湿的粉末悬浮于水中，施用至 种子的表面，并使其在种植前干燥。可润湿的粉末可以与其他种子处理组合使用，其他种子 处理例如但不限于，化学种子处理、载体(例如，滑石、粘土、高岭土、硅胶、高岭石)或聚合物 (例如，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)处理。或者，合适的青霉菌的孢子悬浮液可以应用至 合适的与土壤相容的载体(例如，泥炭类粉末或颗粒），达到适当的最终含水量。材料可以在 使用前在室温下孵育，通常为约1天至约8周。
[0033] 除用于培养解磷微生物的成分(包括例如以上在青霉属培养中提及的成分)外，解 磷微生物可以使用其他农艺学上可接受的载体进行配制。在本文中与"载体"关联使用的术 语"农艺学上可接受的"是指，任何可以用于将活性物递送至种子、土壤或植物的材料，并且 优选载体能够添加(至种子、土壤或植物)而对植物生长、土壤结构、土壤排水等没有不利影 响。合适的载体包括但不限于，小麦壳、糠、地面麦杆、泥炭类粉末或颗粒、石膏类颗粒和粘 土 (例如，高岭土、斑脱土、蒙脱石）。当将孢子加至土壤时，颗粒制剂将是优选的。作为液体、 泥炭或可润湿粉末的制剂将适合于涂覆种子。当用于涂覆种子时，材料可以与水混合，应用 至种子并使其干燥。其他载体的实例包括湿的糠，将其干燥、过筛并施用至事先涂覆有粘合 剂如阿拉伯树胶的种子。在需要单一组合物形式的活性物制剂的实施方式中，农艺学上可 接受的载体可以是水性的。
[0034] 至少一种解磷微生物的含量可以有效增强生长，从而在收获时，植物与未经(任一 活性物)处理的植物或从未经(任一活性物)处理的种子收获的植物相比，表现出按蒲式耳/ 英亩测量的增加的植物产量、增加的根部数量、增加的根部长度、增加的根部质量、增加的 根部体积和增加的叶面积中的至少一种。合适的施用量根据种子或土壤的类型、作物植物 的类型、土壤中存在的或加至其中的磷源和/或微量营养素源的量等而变化。合适的施用量 可以通过针对各个特定情形的简单试验和错误实验而确定。通常，例如，对于青霉属，施用 量落入每公顷0.001~l.OKg真菌孢子和菌丝体(鲜重）的范围、或每个种子（当使用包衣种 子时）10 2~106个菌落形成单位(cfu)的范围，或者在颗粒载体上施用每公顷lxlO6~lxlO 11 个菌落成单位。例如孢子形式的真菌细胞和载体可以添加至根高度处的土壤中的种子行， 或者可以用于在种植之前涂覆种子，如以下更具体描述的。
[0035] 在例如需要使用至少两个解磷微生物菌株，例如两个青霉菌株的实施方式中，商 用肥料可以添加至土壤以替代(或者甚至连同）天然磷酸石。磷源可以含有对于土壤为天然 的磷源。在其他实施方式中，磷源可以添加至土壤中。在一个实施方式中，磷源是磷酸石。在 另一实施方式中，磷源是制造的肥料。市售可得的制造的磷酸盐肥料有许多类型。一些常见 类型为，含有磷酸二氢铵(MAP)、三重磷酸钙(TSP)、磷酸氢二铵、普通过磷酸盐和聚磷酸铵 的肥料。所有这些肥料通过在大规模肥料制造设施中对不溶性天然磷酸石进行化学加工而 产生，产品昂贵。通过本发明的方式，可以降低这些肥料施用至土壤的量并仍然维持从土壤 中摄取的相同量的磷。
[0036] 在另一实施方式中，磷源是有机的。有机肥料是指从天然来源获得的土壤改良剂， 其至少保障最低限百分比的氮、磷酸盐和碳酸钾。实例包括植物和动物副产品、岩石粉末、 海草、接种物和调理物。具体的代表性实例包括骨粉、肉粉、动物粪肥、堆肥、污水污泥或海
[0037] 其他肥料例如氮源、或其他土壤改良剂当然也可以在与解磷微生物大约相同的时 间或在其他时间添加至土壤，只要该其他材料对真菌无毒性。
[0038]在领域内也称为共生Nod信号或Nod因子的脂壳寡糖化合物(LC0)由在非还原性端 缩合有N-连接的脂酰链的β-l，4_连接的N-乙酰基-D-葡糖胺（"GlcNAc"）残基的寡糖骨架构 成。LC0在骨架中GlcNAc残基的数量、脂酰链的长度和饱和度、以及还原和非还原糖残基的 取代方面会有不同。LC0的实例在以下呈现为式I:
[0040]其中：
[0041] G是己糖胺，其可以例如在氮上被乙酰基取代，在氧上被硫酸根、乙酰基和/或醚基 取代，
[0042] h、R2、R3、Rs、R6和R7可以相同或不同，为Η、CH3C0-、C xHy⑶一(其中X是0~17的整 数，且y是1~35的整数）、或任何其他酰基例如氨甲酰基，
[0043] R4为含有至少12个碳原子的单、二或三不饱和脂肪链，且η是1~4的整数。
[0044] LC0可以从例如根瘤菌的细菌，诸如根瘤菌（Rhizobium sp.)、慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium sp ·)、中华根瘤菌（Sinorhizobium sp ·)和固氮根瘤菌(Azorhizobium sp.)中获得(分离的和/或纯化的）ICO结构对于各个这些细菌物种是特有的，并且各个菌 株可以产生多种具有不同结构的LC0。例如，来自苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)的具体LC0 已记载于美国专利第5，549，718号中，具有式II:
[0046] 其中，R为Η或CH3C0-，且η等于2或3。
[0047] 更具体的1X0包括如(11?^〇(11^-1川〇(11?1-3。当被乙酰化时（1? = 〇^0--)，它们分 别成为AcNodRM-Ι和AcNodRM-3 (美国专利第5，545，718号）。
[0048] 来自大?慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)的LC0记载于美国专利第5， 175,149和5,321，011号中。广泛而言，它们是包括甲基岩藻糖的五糖植物激素。大量的这些 大豆慢生根瘤菌来源的 LC0 被记载:BjNod-V(C18:1);BjNod-V(Ac，C 18:1)、BjNod-V(C16:1);和 BjN〇d-V(Ac，C16:Q)，其中"V"表示存在五个N-乙酰基葡糖胺；"Ac"表示乙酰化；"C"后面的数 字表明脂肪酸侧链中碳的数量;且":"后面的数字表示双键的数量。
[0049] 在本发明实施方式中使用的LC0可以从生产LC0的细菌菌株，例如固氮根瘤菌属、 慢生根瘤菌属(包括大豆慢生根瘤菌）、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、根瘤菌属(包括 豌豆根瘤菌(R. leguminosarum))、中华根瘤菌属(包括苜蓿中华根瘤菌）的菌株以及遗传工 程改造为生产LC0的细菌菌株中获得(即，分离和/或纯化的）。
[0050] 1X0是豆科植物共生中的宿主特异性的主要决定因子（Diaz等人，Mol. Plant-Microbe Interactions 13:268-276(2000)) 。 由此 ，在豆科中，根瘤菌的特定属和种与特定 的豆科宿主发展出共生的固氮关系。这些植物-宿主/细菌组合记载于Hungria等人，Soil Biol.Biochem. 29:819-830(1997)。这些细菌/豆科共生伙伴关系的实例包括苜蓿中华根瘤 菌/苜蓿和草木樨;豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(R.leguminosarum biovar viciae)/豌豆 和小扁豆；豌豆根瘤菌菜豆生物变异型（R.leguminosarum biovar phaseoli)/菜豆；大豆 慢生根瘤菌/大豆；以及豌豆根瘤菌三叶草生物变异型（R. leguminosarum biovar 1：1^;^1;[;0/红三叶草。!1111^1^3也列举了有效的根瘤菌菌种的类黄酮1'10(1基因诱导物，和由 不同根瘤菌菌种产生的具体LCO结构。然而，LCO特异性仅需用来在豆科植物中建立结瘤。在 本发明的实践中，既定LC0的用途并不限于对其共生豆科伙伴的种子进行处理，以实现与由 未经处理的种子收获的植物相比，或与由使用信号分子在临种植前或在种植的一周内或不 到一周内处理的种子收获的植物相比，按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根部 数量、增加的根部长度、增加的根部质量、增加的根部体积和增加的叶面积。由此，通过实例 的方式，从大豆慢生根瘤菌得到的LC0可以用于处理大豆以外的豆科种子和非豆科种子例 如玉米。作为另一实例，在图1中示出的可从豌豆根瘤菌中得到的豌豆LC0(命名为LC0-V (C18:1)，SP104)可以用于处理非豌豆的豆科种子还有非豆科。
[005? ]本发明还包括，从菌根真菌例如球囊菌(Glomerocycota)的真菌(如丛枝菌根真菌 (Glomus intraradicus))中得到（即，分离和/或纯化的）的LC0的用途。从这些真菌得到的 代表性LC0的结构记载于W0 2010/049751和WO 2010/049751(本文记载的LC0也称为"Myc因 子"）。
[0052] 本发明还包括，合成型LC0化合物例如记载于W0 2005/063784中的那些、以及通过 遗传工程生产的重组LC0的用途。基本的天然出现的LC0结构可以含有在天然出现的LC0中 发现的修饰或取代，例如记载于 Spaink，Crit. Rev .Plant Sci. 54:257-288(2000)和 D' Haeze等人，Glycobiology 12 : 79R_105R(2002)中的那些。用于构建LCO的前体寡糖分子 (C0,在以下说明，也可以用作本发明中的植物信号分子)也可以通过遗传工程生物体来合 成，例如，如Samain等人，Carb .Res · 302:35-42( 1997); Samain等人，J.Biotechnol · 72: 33-47(1999)中所述。
[0053] LC0可以以多种纯度形式进行利用，并且可以单独使用或以LC0产生细菌或真菌的 培养物的形式进行使用。例如，OPTIMIZE? (从Novozymes BioAg Limited市售可得)含 有产生图2中所示的LCO(LC0-V(Cl8:1，MeFuc)，M0R116)的大豆慢生根瘤菌的培养物。提供 基本纯的LC0的方法包括，简单地从LC0与微生物的混合物中去除微生物细胞，或通过LC0溶 剂相分离以及之后的HPLC色谱而继续分离并纯化LC0分子，例如在美国专利第5，549，718号 中记载的。纯化可以通过反复的HPLC而增进，且纯化的LC0分子可以冻干以长期存储。
[0054] 如上所述的壳寡糖(C0)可以用作生产合成型LC0的起始材料。C0在领域内已知是 被识别为几丁质寡聚体的β-1-4连接的N乙酰基葡糖胺结构，也已知是N-乙酰基壳寡糖。C0 具有独特且不同的侧链修饰，这使其不同于几丁质分子[(C 8H13N05)n，CAS No . 1398-61-4] 和壳聚糖分子[(C5HnN04)n，CAS No.9012-76-4]。描述⑶的结构和生产的代表性文献如下 所不：Van der Holst等人，Current Opinion in Structural Biology,11:608-616 (2001); Robina等人，Tetrahedron58 : 521-530(2002) ;Hanel等人，Planta 232: 787-806 (20 1 0 ) ; Rouge 等人 Chapter 27，〃The Molecular Immunology of Comp lex Carbohydrates"，Advances in Experimental Medicine and Biology,Springer Science;Wan等人，Plant Cell 21:1053-69(2009) ;PCT/F100/00803(9/21/2000);以及 Demont-Caulet等人，Plant Physiol · 120( 1): 83-92( 1999)。两种适用于本发明的CO可以容 易地从图1和图2所示的LC0衍生得到(减去脂肪酸链）。0)可以是合成的或者重组的。制备重 组⑶的方法在领域内已知。参见，例如，Samain等人（同上）；Cottaz等人，Meth.Eng. 7(4): 311-7(2005)和 Samain,等人J.Biotechnol. 72:33-47( 1999)。
[0055] LC0和C0可以单独使用，或组合使用。因此，在一些实施方式中，本发明涉及LC0和 CO的使用。
[0056] 种子可以用LC0和/或C0以多种方式例如喷洒或滴液进行处理。喷洒和滴液处理可 以通过在通常为水性性质的农业上可接受的载体中配制有效量的LC0或C0,并通过连续处 理系统（其已校准为以预定速率与种子的连续流成比例地施加处理)例如卧筒式处理器将 组合物喷洒或滴到种子上而进行。这些方法有利地采用相对少量的载体，从而使经过处理 的种子相对快速地干燥。按照这样方式，大量的种子可以被有效处理。也可以采用分批系 统，其中将预定批量的种子和信号分子组合物输送至混合器。用于进行这些工序的系统和 装置可以商购自许多供应商，例如Bayer CropScience(Gustafson)。
[0057] 在另一实施方式中，处理涉及涂覆种子。一种这样的工序涉及用组合物涂覆圆形 容器的内壁，添加种子，然后转动容器以使种子与内壁和组合物接触，在领域内称为"容器 涂覆"的工序。种子可以通过涂覆方法的组合进行涂覆。浸泡通常需要使用含有植物生长增 强剂的水溶液。例如，种子可以浸泡约1分钟至约24小时（例如，至少lmin、5min、lOmin、 20min、40min、80min、3hr、6hr、12hr、24hr)。一些类型的种子(例如，大豆种子)趋向于对湿 度敏感。因此，将这些种子浸泡延长的时间段可能并不可取，在这种情况下，浸泡通常执行 约1分钟至约20分钟。
[0058] 在涉及种子在LC0或C0施用后进行储存的那些实施方式中，在储存期间的任意部 分时间内，LC0或C0对种子的附着并不是关键性的。不期望受任何特定操作理论的束缚，申 请人认为，即使处理可能不会使植物信号分子在处理后和任意储存时段保持与种子表面接 触，LC0或C0也可以通过称为种子记忆或种子感知的现象而实现其预期效果。参见， Macchiavelli等人 J.Exp.Bot. 55(408) :1635-40(2004)。
【申请人】还认为，在处理后，LC0或 C0朝着发育中的幼根扩散，并激活共生和发育基因，引起植物根构型的改变。尽管如此，在 期望的程度上，含有LC0或C0的组合物还可以包含粘着剂或涂覆剂。出于美观的目的，组合 物还可以含有涂覆聚合物和/或着色剂。
[0059] 至少一种LC0和/或至少一种C0的量能有效增强生长，从而在收获时，该植物与未 经(任一活性物)处理的植物或从未经(任一活性物)处理的种子收获的植物相比，表现出按 蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根部数量、增加的根部长度、增加的根部质量、 增加的根部体积和增加的叶面积中的至少一种。用于处理种子的LC0或C0的有效量，以浓度 单位表示，通常为约10- 5至约10-14Μ(摩尔浓度），在一些实施方式中为约10-5至约10- ηΜ，在 一些其他实施方式中为约10-7至约10-8Μ。以重量单位表示，有效量通常为约1至约400yg/英 担(cwt)种子，在一些实施方式中为约2至约70yg/cwt种子，在一些其他实施方式中为约2.5 至约3. Oyg/cwt种子。
[0060] 出于间接处理种子即犁沟处理的目的，1X0或C0的有效量通常为lyg/英亩至约70μ g/英亩，在一些实施方式中为约50yg/英亩至约60yg/英亩。出于施用至植物的目的，1X0或 C0的有效量通常为lyg/英亩至约3〇yg/英亩，在一些实施方式中为约llyg/英亩至约2〇yg/ 英亩。
[0061] 种子可以用至少一种解磷微生物(例如，青霉属）以及至少一种LC0和/或至少一种 C0在临种植前或在种植时进行处理。在种植时的处理可以包括如上所述的直接施用至种 子，或者在一些其他实施方式中通过将活性物引入至土壤中（领域内已知为犁沟处理）。在 需要处理种子之后进行储存的那些实施方式中，种子可以根据标准技术包装在例如50-lb 或100-lb袋或散装袋或容器中。种子可以在领域内已知的适当储存条件下储存至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，甚至更长，例如，13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个月或甚至更长。大豆种子可能需要在接下来的 季节中种植，而玉米种子可以储存长得多的时间段，包括3年以上。
[0062] 本发明还可以包括用LC0或C0以外的植物信号分子处理种子或植物。出于本发明 的目的，与"植物生长增强剂"互换使用的术语"植物信号分子"广泛地指代任何在植物或微 生物中天然出现的和合成的（其可以是非天然出现的）作用剂，其直接或间接地激活植物生 化通路，与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比，引起增加的植物生长，这 至少在以下至少一方面是可度量的：按蒲式耳/英亩测量的增加的产量、增加的根部数量、 增加的根部长度、增加的根部质量、增加的根部体积和增加的叶面积。可以用于本发明实践 中的植物信号分子的代表性实例包括几丁质化合物(非⑶）、类黄酮、茉莉酸、亚油酸和亚麻 酸及其衍生物、以及karrikin。
[0063] 作为真菌细胞壁以及昆虫和甲壳类动物的外骨骼的主成分的几丁质和壳聚糖也 由GlcNAc残基构成。几丁质化合物包括几丁质（IUPAC:N-[5-[[3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基）四氢吡喃-2基]甲氧基甲基]_2-[ [5-乙酰氨基-4,6-二羟基-2-(羟甲基）四氢吡 喃-3-基]甲氧基甲基]-4-羟基-6-(羟甲基）四氢吡喃-3-基]乙酰胺）、和壳聚糖（IUPAC: 5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4,6-二羟基_2(羟甲基）四氢吡喃-3-基]氧-4-羟基-2-(羟甲 基）四氢吡喃-3-基]氧_2(轻甲基）四氢吡喃-3,4-二醇）。这些化合物可以商购自例如 Sigma-Aldrich，或者可以从昆虫、甲壳类动物的壳或真菌细胞壁制得。制备几丁质和壳聚 糖的方法为领域内已知，并已记载于例如美国专利第4,536,207号(从甲壳纲动物壳制备）、 Pochanavanich等人，Lett .Appl .Microbiol · 35:17-21 (2002)(从真菌细胞壁制备）和美国 专利第5,965,545号中（从蟹壳以及市售壳聚糖的水解中进行制备）。去乙酰化的几丁质和 壳聚糖可以以小于35 %至大于90 %的去乙酰化获得，且涵盖较广范围的分子量，例如小于 15kD的低分子量壳聚糖寡聚体和0.5~2kD的几丁质寡聚体；分子量为约15kD的"试剂级 (practical grade)"壳聚糖;和高至70kD的高分子量壳聚糖。配制用于种子处理的几丁质 和壳聚糖组合物也市售可得。市售产品包括，例如ELEXA?(Plant Defense Boosters, Inc·)和BEY0ND?(Agrihouse，Inc·)〇
[0064] 类黄酮是具有两个芳族环由三碳桥连接的一般结构的酚类化合物。类黄酮由植物 产生并具有多种功能，例如，作为有益的信号通路分子，以及作为对抗昆虫、动物、真菌和细 菌的保护物质。类黄酮的分类包括查耳酮、花青素、香豆素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮和 异黄酮。参见，Jain 等人，J.P1 ant Biochem. &Bio techno 1.11:1-10(2002); Shaw 等人， Environmental Microbiol.11:1867-80(2006)〇
[0065] 可以用于本发明操作中的代表性类黄酮包括染料木黄酮、大豆黄酮、芒柄花素、柚 皮素、橙皮素、木樨草素和芹菜素。类黄酮化合物可以从例如Natland International Corp.,Research Triangle Park,NC；MP Biomedicals , Irvine,CA；LC Laboratories , Woburn MA商购得到。类黄酮化合物可以从植物或种子中分离，例如，如在美国专利第5， 702，752; 5，990，291;和6，146，668号中所记载。类黄酮化合物也可以通过遗传工程生物体 例如酵母来生产，如Ralston等人，Plant Physiologyl37:1375-88(2005)中所记载。
[0066]茉莉酸(弘，[11?-[1€[，2扒2)]]-3-氧代-2-(戊烯基)环戊烷乙酸)及其衍生物、亚油 酸（（2,2)-9，12-十八碳二烯酸)及其衍生物、和亚麻酸（（2,2,2)-9，12，15-十八碳三烯酸） 及其衍生物可以用于本发明的实践。茉莉酸及其甲酯（茉莉酸甲酯(MeJA))(统称为茉莉酮 酸酯)是在植物中天然出现的十八烧(octadecanoid)类化合物。茉莉酸由小麦幼苗的根部 产生，以及通过真菌微生物例如可可球二孢菌(13〇1：巧0(11卩1〇(1131：116〇131'01]^6)和藤仓赤霉 (Gibbrella fu jikuroi)、酵母(酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))以及大肠杆菌 (Escherichia coli)的致病性菌株和非致病性菌株产生。亚油酸和亚麻酸在茉莉酸的生物 合成过程中产生。茉莉酸酮酯、亚油酸和亚麻酸(及其衍生物)被报道为根瘤菌nod基因表达 或LC0生产的诱导物。参见，例如Mabood，Fazli，Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum,May 17,2001;和Mabood,Fazli,"Linoleic and linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum，"USDA3,May 17,2001。
[0067]亚油酸、亚麻酸和茉莉酸的可以用于本发明实践中的有用衍生物包括酯、酰胺、糖 苷和盐。代表性的酯是其中亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的羧基已被--C0R基团取代的化合物， 其中R是--0R1基，且其中R 1为:烷基，例如&~(：8无支链或支链的烷基，如甲基、乙基或丙基； 烯基，例如C 2~C8无支链或支链的烯基;炔基，例如C2~C8无支链或支链的炔基;具有例如6 ~10个碳原子的芳基;或具有例如4~9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是 例如Ν、0、Ρ或S。代表性的酰胺是其中亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的羧基已被一C0R基取代的化 合物，其中R是NR 2R3基，且其中R2和R3独立地为:氢;烷基，例如&~(： 8无支链或支链的烷基， 如甲基、乙基或丙基;烯基，例如C2~C8无支链或支链的烯基;炔基，例如C 2~C8无支链或支 链的炔基;具有例如6~10个碳原子的芳基;或者具有例如4~9个碳原子的杂芳基，其中杂 芳基中的杂原子可以是例如N、0、P或S。酯可以通过已知方法进行制备，例如酸催化的亲核 加成，其中羧酸与醇在催化量的无机酸的存在下进行反应。酰胺也可以通过已知方法进行 制备，例如通过使羧酸与合适的胺于中性条件下在偶联剂比如二环己基碳二亚胺(DCC)的 存在下进行反应。亚油酸、亚麻酸和茉莉酸的合适的盐包括，例如碱加成盐。可以用作制备 这些化合物的代谢上可接受的碱盐的试剂的碱包括衍生自阳离子例如碱金属阳离子(例如 钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的那些。这些盐可以通过将亚油酸、亚麻酸或茉莉 酸的溶液与碱溶液混合在一起而容易地制备。盐可以从溶液中沉淀出，并通过过滤收集或 可以通过其他方法例如通过溶剂蒸发而回收。
[0068] Karrikin是插烯4H-吡喃酮，例如2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物及 类似物。这些化合物的实例由以下结构表示：
[0070] 其中：Z是0、S或NR5; Ri、R2、R3和R4各自独立地为Η、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、羟 基、羟烷基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、CN、COR6、COOR =、卤素、NR6R7或N〇2;且R5、R6和R7各自独 立地为H、烷基或烯基；或这些化合物的生物学可接受的盐。这些化合物的生物学可接受的 盐的实例可以包括与生物学可接受的酸形成的酸加成盐，其实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫 酸盐或硫酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳 酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐；甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸。其他生物学可接 受的金属盐可以包括与碱形成的碱金属盐，其实例包括钠盐和钾盐。该结构所包含的且可 以适用于本发明的化合物的实例包括以下：3_甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中心 =01 3，此、1?3、1?4 = 1〇、2!1-呋喃并[2,3-(3]吡喃-2-酮(其中1?1、1?2、1?3、1?4 = !〇、7-甲基-2!1-呋喃 并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中仏、1?2、1?4 = 11，1?3 = 013)、5-甲基-2!1-呋喃并[2,3-(3]吡喃-2-酮(其 中办、1?2、1?3 = 11，1?4 = 013)、3,7-二甲基-2!1-呋喃并[2,3-(3]吡喃-2-酮（其中1?1、1? 3 = 013，1?2、1?4 = H)、3,5-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中 1^、1?4 = 〇13，1?2、1?3 = !0、3,5,7-三甲 基-2H-呋喃并[2，3-c]吡喃-2-酮(其中R!、R3、R4 = CH3，R2 = H)、5-甲氧基甲基-3-甲基-2H-呋 喃并[2，3-c ]吡喃-2-酮（其中R! = CH3，R2、R3 = H，R4 = CH2OCH3)、4-溴-3，7-二甲基-2H-呋喃 并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中 R1、R3 = CH3，R2 = Br，R4 = H)、3-甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(3H)-酮(其中Z=NH，R1=CH3，R 2、R3、R4=H)、3,6-二甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(6H)-酮(其中Z= 1〇1 3，1?1 = (：!13，1?2、1?3、1?4 = 10。参见，美国专利第7,576,213号。这些分子也称为1?^41^11。参 见，Halford,同上。
[0071] 本发明还可以包括使用农业上/农艺学上有益的作用剂来处理种子或从种子萌发 的植物。如本文和本领域所使用的术语，"农业上或农艺学上有益的"是指在施用至种子时 引起植物特性例如植物占地面积、生长、强健度或产量在与未经处理的种子相比时有所增 强(其可以是统计学上显著的）的作用剂。可以用于本发明实践中的这些作用剂的代表性实 例包括除草剂、杀真菌剂和杀虫剂。
[0072] 适当的除草剂包括苯达松、氟锁草醚、氯嘧磺隆、乳氟禾草灵、广灭灵、吡氟禾草 灵、草铵膦、草甘膦、稀禾定、咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟、氟磺胺草醚、氟烯草酸、灭草喹、和烯 草酮。含有这些化合物中的每一种的市售产品容易可得。组合物中除草剂的浓度将通常与 所标记的对于特定除草剂的使用量相对应。
[0073] 本文和本领域所用的"杀真菌剂"是杀灭或抑制真菌生长的作用剂。如果相对于未 经处理的群，使用杀真菌剂的处理引起(例如，土壤中的）真菌群的杀灭或真菌群的生长抑 制，则本文所用的杀真菌剂针对特定真菌物种"表现出活性"。根据本发明的有效杀真菌剂 将适当地针对较广范围的病原体表现出活性，这些病原体包括但不限于疫霉属 (Phytophthora)、丝核菌属（Rhizoctonia)、镰孢菌属(Fusarium)、腐霉菌属（Pythium)、拟 莖点霉属(Phomopsis)或核盘菌属(Selerotinia)和层锈菌属(Phakopsora)及其组合。
[0074] 市售杀真菌剂可适用于本发明。适当的市售可得的杀真菌剂包括ρκοτ?ο?、 RIVAL或ALLEGIANCE FL或LS(Gustafson，Plano，TX)、WARDEN RTA(Agrilance，St·Paul， MN)、APR0N XL、APR0N MAXX RTA或RFC、MAXm 4FS或XL(Syngenta,Wilmington，DE)、CAPTAN (Arvesta，Guelph，Ontario)和PROTREAT(Nitragin Argentina，Buenos Ares，Argentina)〇 在这些和其他市售杀真菌剂中的活性成分包括，但不限于，咯菌腈、精甲霜灵、嘧菌酯和甲 霜林。市售杀真菌剂最适合根据制造商的说明在推荐的浓度进行使用。
[0075]如果相对于未经处理的群，使用杀虫剂的处理引起昆虫群的杀灭或抑制，则本文 所用的杀虫剂针对特定昆虫物种"表现出活性"。根据本发明的有效杀虫剂将适当地针对较 广范围的昆虫表现出活性，包括但不限于，线虫、切根虫、蛴螬、玉米根虫、种蝇、跳甲、麦长 蝽、蚜虫、叶壳、和椿象。
[0076] 市售杀虫剂可适用于本发明。合适的市售可得的杀虫剂包括CRUISER(Syngenta， Wi lmington，DE)、GAUCH0和P0NCH0(Gustaf son，Plano，TX)。在这些和其他市售杀虫剂中的 活性成分包括噻虫嗪、噻虫胺、和吡虫啉。市售杀虫剂最适合根据制造商的说明以推荐浓度 进行使用。
[0077] 本发明的方法适用于豆科种子，其代表性实例包括大豆、苜蓿、花生、豌豆、小扁 豆、菜豆和三叶草。本发明的方法也适用于非豆科种子，例如禾本科（Poaceae)、萌芦科 (Cucurbitaceae)、锦奏科（Malvaceae)、菊科（Asteraceae)、薬科（Chenopodiaceae)和前科 (Solonaceae)。非豆科种子的代表性实例包括大田作物例如玉米、稻、燕麦、黑麦、大麦和小 麦、棉花和油菜，以及蔬菜作物例如土豆、西红柿、黄瓜、甜菜、萬苣和哈密瓜。
[0078] 在本说明书中引用的所有专利和非专利公开物均显示为本发明所属领域的技术 人员的技术水平。所有这些公开物通过引用的方式合并入本文，其程度等同于各个单独公 开物或专利申请均具体而独立地表明通过引用方式并入。
[0079]尽管在此已参照【具体实施方式】描述了本发明，但应当理解，这些实施方式仅仅用 来示例说明本发明的原理和应用。因此，应当理解的是，可以在不背离由所附权利要求限定 的本发明的精神和范围的情况下对示例性的实施方式做出多种修改并可以提出其他布置。
【主权项】
1. 一种包，包含第一容器和第二容器，其中所述第一容器包含至少一种青霉属解磷微 生物和第一农艺学上可接受的载体，且其中所述第二容器包含至少一种脂壳寡糖(LCO)和/ 或至少一种壳寡糖(C0)以及第二农艺学上可接受的载体，其中所述第一农艺学上可接受的 载体和所述第二农艺学上可接受的载体是相同的或不同的，且其中在所述第一容器和所述 第二容器中分别存在的所述至少一种解磷微生物和所述至少一种LCO和/或所述至少一种 C0的量使得：当所述包被施用到植物种子和/或从所述种子萌发的植物时，在收获时所述植 物与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比，表现出按蒲式耳/英亩测量的 增加的植物产量、增加的根部数量、增加的根部长度、增加的根部质量、增加的根部体积和 增加的叶面积中的至少一种。2. 如权利要求1所述的包，其中所述第一农艺学上可接受的载体是粉末。3. 如权利要求1所述的包，其中所述第一农艺学上可接受的载体是泥炭类粉末或颗粒。4. 如权利要求1所述的包，其中所述第一农艺学上可接受的载体包含粘着剂。5. 如权利要求1所述的包，其中所述第一农艺学上可接受的载体是液体。6. 如权利要求1所述的包，其中所述第二农艺学上可接受的载体是液体。7. 如权利要求1所述的包，其中所述第二农艺学上可接受的载体是水性的。8. 如权利要求1所述的包，其中所述第二农艺学上可接受的载体包含LCO生产细菌的培 养物。9. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括至少一种几丁质化合物。10. 如权利要求9所述的包，其中所述至少一种几丁质化合物包含一种或多种几丁质 和/或一种或多种壳聚糖。11. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括至少一种类黄酮。12. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括茉莉酸或其衍生物。13. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括亚油酸或其衍生物。14. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括亚麻酸或其衍生物。15. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括至少一种karrikin。16. 如权利要求1所述的包，其中所述包还包括至少一种除草剂、杀虫剂和/或杀真菌 剂。17. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含拜赖青霉(Penici Ilium bilaiae)菌株。18. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含NRRL 50162、NRRL 50169、ATCC 20851、ATCC 22348和/或ATCC18309。19. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含以等于或大于lxl07cfU/ 克的量存在的拜赖青霉(P.bilaiae)菌株。20. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含P.gaestrivorus的菌 株。21. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含NRRL 50170。22. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物至少包含不同的解磷微生物 菌株。23. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含两种或更多拜赖青霉 (P.bilaiae)菌株。24. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含至少一种 P.gaestrivorus的菌株和至少一种拜赖青霉(P.bilaiae)菌株。25. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种解磷微生物包含NRRL 5016 2、NRRL 50169和/或顺此50170。26. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LC0和/或至少一种C0包含至少一种如下 式所示的LC0:其中R为H或CH3C0-，且n等于2或3。27. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LC0和/或至少一种C0包含如下式所示的 LC0：28. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LC0和/或至少一种C0包含如下式所示的 LC0：29. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LCO和/或至少一种CO包含至少一种从下 述根瘤菌物种中获得的LC0:根瘤菌(Rhizobium sp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、 中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)和固氮根瘤菌(Azorhizobium sp.)〇30. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LCO和/或至少一种CO包含至少一种来自 大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)的LC0〇31. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LCO和/或至少一种CO包含至少一种来自 菌根真菌(mycorrhizal fungus)的LC0。32. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LCO和/或至少一种CO包含至少一种含量 为约1(T5到约1(T 14M的LC0。33. 如权利要求1所述的包，其中所述至少一种LC0和/或至少一种⑶包含至少一种LC0 和至少一种C0。34. 如权利要求33所述的包，其中所述至少一种解磷微生物、至少一种LC0和至少一种 C0各自以在施用至种子时与未经处理的种子相比能有效增强植物生长的量存在。35. 如权利要求1所述的包，其中所述植物是豆科的。36. 如权利要求35所述的包，其中所述豆科植物是大豆。37. 如权利要求1所述的包，其中所述植物是非豆科的。38. 如权利要求37所述的包，其中所述非豆科植物是大田作物植物。39. 如权利要求38所述的包，其中所述大田作物植物是玉米。40. 如权利要求37所述的包，其中所述非豆科植物是蔬菜作物植物。
【文档编号】A01N63/00GK106045588SQ201610421032
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2012年9月14日
【发明人】M·弗罗迪马, S·西蒙斯, R·S·史密斯, 康耀卫
【申请人】诺维信生物农业公司