专利名称：一株具有荧蒽降解能力的产吲哚乙酸耐盐节杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，涉及一株具有荧蒽降解能力的产吲哚乙酸耐盐节杆菌及其应用。
背景技术：
在土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质，将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量。植物促生菌(Plant Growth PromotingBacteria,简称PGPB)被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐碱、重金属和有机污染物毒害。但现在大部分植物促生菌还未被驯化成能有效提高植物各种抗逆性的菌株，因此从植物根际土中分离得到能有效提高植物各种抗逆性的植物促生菌成为热点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供具有荧蒽降解能力的产吲哚乙酸耐盐节杆菌。本发明的另一目的是提供该节杆菌的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现:一种耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens ZZ21), 2013 年 3 月 15 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中`心保藏，分类名为耐盐节杆菌(Arthrobacterpascens)，保藏号 CGMCC N0.7325。所述耐盐节杆菌菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列。所述耐盐节杆菌的生理生化特性是:革兰氏阳性，兼性好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阴性。本发明所述的耐盐节杆菌培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、谷氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁。本发明的蜡状芽孢杆菌发酵可在20 35°C，pH6 10的环境下进行。所述的节杆菌(Arthrobacter pascens) ZZ21在降解突蒽中的应用。所述的节杆菌(Arthrobacter pascens) ZZ21在制备生物肥料中的应用。本发明所述的耐盐节杆菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力强，在30°C、180r/min摇床培养条件下24h其转化IAA能力达78.39ug* mL'吲哚乙酸是植物激素的一种，能够促进根的发育。产吲哚乙酸的菌种，往往附着在植物根系或叶表面，利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA3等植物激素来影响植物的生理过程和形态变化。表现为直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质的接触的机会；可提高植物体内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗旱等抗逆性。作为本发明的优化方案，所述耐盐节杆菌的发酵在温度为28°C、pH6 10下进行，该环境下产IAA量最高。作为本发明的进一步优化，所述耐盐节杆菌采用的碳源为甘露醇，采用的氮源为酵母粉或蛋白胨或两者的组合。利用上述碳源和氮源制得的培养基，培育出的耐盐节杆菌产IAA的量最高。本发明所述的耐盐节杆菌可以在高盐碱度条件下进行生长并产IAA。在实验室摇瓶条件下，所述蜡状芽孢杆菌可以在pH为10的条件下生长且产IAA，并可以在LB培养基含盐度为7%的条件下生长，在含盐度为3%时可产IAA。本发明所述的耐盐节杆菌以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，所述耐盐节杆菌对磷酸三钙的转化量达120.86mg L'相对于空白对照的结果，所述耐盐节杆菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出83.43mg吨一1。本发明所述的耐盐节杆菌对多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果。在实验室摇瓶条件下，所述蜡状芽孢杆菌在荧蒽初始浓度为50mg L—1的无机盐培养基条件下培养7d后降解率为21.29%，有一定的降解效果。有益效果:本发明的一种耐盐节杆菌能能高产吲哚乙酸并能在高盐碱条件生长且能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并对多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果，可用于制备生物肥料。
图1是本发 明菌株ZZ21的菌落图；图2表示ZZ21菌株对难溶性磷的利用情况；图3表示不同装液量对菌株ZZ21产IAA的影响；图4表示不同初始pH对ZZ21菌株产IAA的影响；图5表示不同碳源对菌株ZZ21产IAA的影响；图6表示不同氮源对ZZ21菌株产IAA的影响；图7表示不同含盐度对ZZ21菌株产IAA的影响；图8表示ZZ21菌株对多环芳烃荧蒽的降解效果；生物材料保藏信息节杆菌ZZ21,分类命名为Arthrobacter pascens,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年3月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC N0.7325。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。实施例1首先准备以下三种培养基。
LB培养基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121°C灭菌，20min。LB液体培养基:不加琼脂，其它条件同上。无机磷细菌培养基(PK0培养基):磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠
0.3g，七水合硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸锰0.03g,七水合硫酸亚铁0.03g, pH7.0琼脂20g，蒸馏水 1000ml, pH7.0 7.2。121°C灭菌，20min。无机盐培养基:硫酸铵2.0g ;磷酸二氢钠0.5g ;磷酸氢二钾0.5g ;七水硫酸镁
0.2g ;二水氯化钙 0.lg，蒸馏水 IOOOmL, pH7.0，121°C灭菌，20min。将从南京紫金山脚采取的植物根际土挑根过筛后称取IOg置于盛有IOOml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30°C，150r mirT1振荡20min，静置lOmin，得到土壤悬浮液。该土壤悬浮液中含有若干种促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于300C，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4°C保存在LB斜面待用。下面再通过定性测定和定量测定筛选出可分泌吲哚乙酸的细菌。定性测定:将分离纯化后的细菌接种于采用含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液体培养基，30°C，180r mirT1摇床培养Id。取50 y L菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50 y LSalkowski 比色液(50mL35%HC104+lmL0.5M FeCl3X 将加入 50 y L50mg/L 吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。 定量测定:对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD6tltl值，然后将菌悬液以IOOOOr mirT1离心IOmin取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD53tl值。计算菌浓度OD6tltl值为I时，单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。把得到的产IAA菌进行溶磷情况的筛选测定，将供试菌株接种于盛有30mL无机磷细菌液体培养基的150mL三角瓶，30°C，180r ^mirT1培养4d后，将培养液装入离心管4°C下IOOOOr mirT1离心，15min。取上清液用钥蓝比色法测定有效磷含量。通过以上测定即筛选出一株高产吲哚乙酸且溶磷能力强的菌株，如图1所示，该菌株形成的菌落为较小白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，株型命名为ZZ21。该菌株在实验室摇瓶条件下，所述耐盐节杆菌对磷酸三钙的转化量达120.86mg L'相对于空白对照的结果，所述蜡状芽孢杆菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出 83.43mg L-1 (图 2)。将上述方法筛选分离出的菌株，经上海英俊生物工程有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncb1.nlm.nih.gov在线查询分析,利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与ZZ21的序列用MEGAversion3软件构建ZZ21的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens),同源性为99%。将该菌株于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC N0.7325。实施例2好氧性试验
把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的ZZ21(CGMCC N0.7325)，穿刺接种到上述培养基中(必须穿刺到管底)。30°C培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。过氧化氢酶的测定在干净载玻片上滴I滴3%H202，取18 24h的LB斜面培养物I环，在H2O2中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。甲基红试验(M.R试验)a.培养基及试剂:蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化钠5g,蒸懼水IOOOmL,调节pH7.0
7.2，分装试管，每管装4 5mL，121°C灭菌20min。试剂:甲基红0.1g, 95%酒精300mL，蒸馏水200mL。b.菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30°C培养I 2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性(甲基红变色范围
4.4红色 6.0黄色)。乙酞甲基甲醇试验(VP试验)a.培养基培养基同甲基红试验。b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液(约2mL)和等量的40%Na0H相混合，加少量肌酸，充分振荡2 5min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。淀粉水解试验a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121°C灭菌20min备用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化钾2g，先用少量(3 5mL)蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。b.菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30°C培养2 4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。明胶水解试验a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2 7.4，分装试管，培养基高度约为4 5cm，121°C灭菌20min。b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30°C温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。硝酸盐还原试验a.培养基及试剂蛋白胨10g, KNO3Ig,蒸馏水IOOOmL, pH7.0 7.4。格里斯氏(Gries)试剂:A液:对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液:蔡胺0.lg，蒸馏水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺试剂:二苯胺0.5g溶于IOOmL浓硫酸中，用2OmL蒸馏水稀释。b.菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30°C培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴I滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰 红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。柠檬酸盐的利用a.培养基及试剂柠檬酸钠 2g，NaC15g, MgSO4 7H200.2g，(NH4)2 HPO4Ig, 1% 澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH6.8-7.0，121°C灭菌20min。b.菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30°C培养3-7天，培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者则为阴性。表I节杆菌ZZ21的生理生化性质
权利要求
1.一株具有焚蒽降解能力的产卩引哚乙酸耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens)ZZ21，于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens)，保藏号 CGMCC N0.7325。
2.权利要求1所述的节杆菌(Arthrobacterpascens) ZZ21在降解焚蒽中的应用。
3.权利要求1所述的节·杆菌(Arthrobacterpascens)ZZ21在制备生物肥料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株具有荧蒽降解能力的产吲哚乙酸耐盐节杆菌及其应用，属于微生物领域，该耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens ZZ21)，于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为耐盐节杆菌(Arthrobacter pascens)，保藏号CGMCC No.7325。该菌株能高产吲哚乙酸并能耐盐碱生长且能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并对多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果。
文档编号C05G3/00GK103243059SQ20131020133
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者徐莉, 张振, 李辉信, 陈雄, 李伟明, 李方卉, 焦加国, 刘满强, 陈小云, 胡锋 申请人:南京农业大学