氨基酸衍生物的制作方法

氨基酸衍生物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了可用于生物偶联过程中的式(X)、(I)、(II)、(V)、(VI)、(VII)和(VIII)的吡咯赖氨酸类似物，其中a、b、d、X、Y、Z、FG、R、R1、R2和R3是如权利要求书中所定义的；以及含有这些吡咯赖氨酸类似物的突变体蛋白。
【专利说明】氨基酸衍生物
[0001] 本发明涉及用于生物偶联过程中的氨基酸衍生物。
[0002] 盟直
[0003] 吡咯赖氨酸是由琥珀密码子可靠地指定的唯一一种天然氨基酸。其使用天然进化 成正交于所有其他氨基酸和tRNA的第21个氨基酰基-tRNA合成酶(PylRS)。布莱特(Blight) 等人，2004显示在大肠杆菌(E. coli)中，Py 1RS和其对应部分tRNA(tRNApy 1)可在琥珀密码 子处纳入吡咯赖氨酸。其还表明wt PylRS是天然混杂的且可纳入赖氨酸的类似物。
[0004] 横山（Yokoyama)等人(EP 1911840)展示，PylRS/tRNApyl系统在真核细胞中是正 交的，且显示在细菌细胞中将若干非天然氨基酸(nnAA)纳入由琥珀密码子编码的靶蛋白 中。这些作者还鉴定了pylRS中形成氨基酸结合口袋且起到相对于其他典型氨基酸选择吡 咯赖氨酸的作用的关键氨基酸残基。此位点处的突变生成能够识别tRNApyl且用AzZ-lys将 tRNApyl氨基酰化的突变体(柳泽(Yanagisawa)，2008)。
[0005] 这种正交性延伸到细菌和真核细胞。
[0006] PylRS是天然混杂的合成酶，其已经天然进化以排除赖氨酸，但将在不突变的情况 下纳入赖氨酸类似物，包括叠氮化物、炔烃和烯烃(柳泽等人，2008;诺伊曼(Neumann)等人， 2008;向井(Mukai)等人，2008;阮（Nguyen)等人，2009)。这种特异性的基础取决于在pylRS 结合口袋的氨基酸残基之间的疏水性相互作用，其中吡咯赖氨酸的吡咯环使该氨基酸稳定 并且将该氨基酸正确地定位在该合成酶的活性位点中（卡佛兰(Kavran)等人，2007)。此RS/ tRNA对已通过瞬时转染引入细菌、酵母和哺乳动物细胞中，且已显示可有效地将多种非天 然氨基酸纳入靶蛋白中。
[0007] 例如，EP 1911840展示在大肠杆菌细胞中将Ν-ε-boc-赖氨酸纳入靶蛋白中。
[0008] 在过去几年中，例如费克纳(Fekner)等人(费克纳、李(Li)和成(Chan)，2010)和刘 (Liu)等人已揭示并综述吡咯赖氨酸类似物，其定义为由天然或以遗传方式进化的PylRS识 别且在琥珀密码子位点处纳入蛋白质中的氨基酸衍生物。具有官能团或翻译后修饰的类似 物已使用pylRS-tRNApyl系统以位点特异性方式纳入蛋白质中。若干研究(参见例如柳泽等 人)关注PylRS酶内的突变以适应其中N6取代基为结合口袋吡咯赖氨酸内的芳香族环的类 似物。其他研究（例如阮等人(也在W0 2010/139948中）和李等人(也在W0 2011/044255中）） 关注不携载庞大N6取代基的吡咯赖氨酸类似物的鉴定，其中结果是获得将易于合成且与天 然pylRS/tRNApyl对相互作用的较简单类似物。此外，秦(Chin)等人研发出两种具有末端炔 和叠氮化物基团的类似物，其适用于通过铜催化的点击化学(CUAAC)进行蛋白质标记。
[0009] 业内仍需要研发出其他吡咯赖氨酸类似物。尽管迄今为止所制得的吡咯赖氨酸类 似物限于从赖氨酸骨架演变来的那些，但本
【发明人】已成功地自多种氨基酸结构开始利用天 然pylRS/tRNApyl对生成纳入蛋白质中的吡咯赖氨酸类似物

【发明内容】
：
[0010] 本发明提供如本文所述式I至VIII的吡咯赖氨酸类似物。
[0011] 本发明还提供含有作为非天然氨基酸的一种或多种(例如一种)如本文所述式I至 VIII的吡咯赖氨酸类似物的突变体蛋白。
[0012] 本发明还提供如前所述的突变体蛋白，其通过一种或多种(例如一种)非天然氨基 酸偶联至一个或多个(例如一个)选自蛋白质、细胞毒性剂、药物和聚合物的部分。
[0013] 本发明还提供使用如前所述的吡咯赖氨酸类似物制造含有一种或多种非天然氨 基酸的突变体蛋白。
[0014] 本发明所述的氨基酸类似物是新颖且有用的，且其在容易纳入蛋白质（在适当使 用时通常不损失生物活性）中并提供有用的生物偶联方式方面具有直接制备的优势。
[0015] 图式简单说明
[0016] 图1:含有叠氮化物的单克隆抗体的聚乙二醇化。泳道1:含有纳入重链中且经受聚 乙二醇化条件的式IA.1类似物的抗体;泳道2:含有纳入重链中且经受聚乙二醇化条件的式 III. 1类似物的抗体。
[0017] 序列表简单说明
[0018] SEQ ID No 1 :PylRS马氏甲烧八叠球菌(Methanosarcina mazei)WT核昔酸序列
[0019] SEQ ID No 2:PylRS马氏甲烷八叠球菌WT氨基酸序列
[0020] SEQ ID No 3:PylRS马氏甲烷八叠球菌Y384F突变体核苷酸序列 [0021] SEQ ID No 4:PylRS马氏甲烷八叠球菌Y384F突变体氨基酸序列
[0022] SEQ ID No 5:tRNApyl马氏甲烷八叠球菌Gol
[0023] SEQ ID No 6:U6snRNA启动子
[0024] SEQ ID No 7:U6-tRNApyl构建体
[0025] SEQ ID No 8:GFP核苷酸序列
[0026] SEQ ID No 9:GFP氨基酸序列
[0027] SEQ ID No 10:GFPY40核苷酸序列
[0028] SEQ ID No 11:GFPY40氨基酸序列
[0029] SEQ ID No 12:抗Her2(4D5) γ 核苷酸序列
[0030] SEQ ID No 13:抗Her2(4D5) γ 氨基酸序列
[0031] SEQ ID No 14:抗Her2(4D5) γ_Κ274琥珀核苷酸序列
[0032] SEQ ID No 15:抗Her2(4D5) γ_Κ274琥珀氨基酸序列
[0033] SEQ ID No 16:抗Her2(4D5)K核苷酸序列
[0034] SEQ ID No 17:抗Her2(4D5)K氨基酸序列
[0035] 实施方式
[0036] 定义
[0037]术语"酰胺"是指_C( = 0)-ΝΗ-键。
[0038] 术语"氨基甲酸酯"是指-0_C(=0)-NH-键。
[0039] 术语"酯"是指-C-C ( = 0) -0-C 键。
[0040] 术语"烷基"是指通常含有1至6个、例如1至4个碳原子且可为直链或具支链的脂肪 族键或取代基。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。
[0041] 术语"烷氧基"是指基团-0-烷基。
[0042] 术语"烯基"、"烯烃"或"烯烃"是指通常含有2至6个、例如2至4个碳原子且可为直 链或具支链并因含有至少一个C = C部分而为不饱和的脂肪族键或取代基。实例包括乙烯 基、丙烯-1-基、丙烯-2-基和2-甲基-丙烯-2-基。烯基可任选地经例如一个或多个(例如1 个)诸如卤素(例如C1)或醚基(例如-0-&-6烷基)等取代基取代，但适宜地其不经取代。
[0043] 术语"炔基"或"炔经"是指通常含有2至6个、例如2至4个碳原子且可为直链或具支 链并因含有至少一个C=C部分而为不饱和的脂肪族键或取代基。实例包括-C=CH和-c=c-CH 3。炔基可任选地经例如一个或多个(例如1个)诸如卤素(例如Cl)或醚基(例如-O-Ci-6烷 基)等取代基取代，但适宜地其不经取代。
[0044] 术语"环烷基"是指通常含有3至8个环碳原子的脂环族不饱和化合物。环烷基可含 有支链。碳原子总数通常将为3至10。实例性基团包括环丙基、环丁基、环戊基、3-甲基-环丙 基和环己基。
[0045] 术语"环烯基"是指通常含有5至8个环碳原子且含有至少一个C = C部分的脂环族 化合物。环烯基可含有支链。
[0046] 碳原子总数通常将为5至10。实例性基团包括环戊烯基、3-甲基-环丙烯基和环己 烯基。
[0047]术语"杂环基"是指其中环含有一个或多个(例如一个、两个或三个，例如一个或两 个，尤其一个)选自〇、N和S的杂原子的环烷基或环烯基部分。实例包括氮杂环丁烷、吡咯烷、 哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪、吗啉和硫吗啉。
[0048]术语"芳基""是指可为键的一部分或取代基的一部分的芳香族环结构。芳基部分 可含有一个环(例如苯基)或两个环(例如萘基）。芳基可经例如一个或多个(例如一个或两 个，例如一个)选自以下的取代基取代:烷基、烯基、炔基、氣烷基、卤素、烷氧基、硝基和氛 基。实例性芳基是苯基。
[0049]术语"杂芳基"是指可为键的一部分或取代基的一部分的杂芳香族环结构。杂芳香 族环可含有1至4个(更通常1至3个，例如一个或两个)选自0、N和S的杂原子。杂芳基部分可 含有一个环或两个环。含有一个6元环的实例基团包括吡啶和嘧啶。含有一个5元环的实例 基团包括吡咯、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、二唑、噻二唑和四唑。含有两个环的杂芳基部分可在 一个或两个环中含有杂原子。实例包括喹啉和异喹啉。杂芳基可经例如一个或多个(例如一 个或两个，例如一个)选自以下的取代基取代:烷基、烯基、炔基、氟烷基、卤素、烷氧基、硝基 和氰基。
[0050] 术语"芳香族卤化物"是指经至少一个(例如一个)诸如氟、氯、溴或碘等卤基取代 的芳香族环(通常苯基）。所述芳香族环可含有其他取代基，例如针对芳基所提到的那些。
[0051] 术语"叠氮化物"和"叠氮基"是指N=N( + )=N(_)官能团。
[0052]术语"环炔经"是指包括环结构中所捕获的碳-碳三键的碳原子的环状排列(通常6 至9元，尤其8至9元）。实例包括环辛炔和环壬炔。另一实例是苯炔。环炔烃基团可含有支链。 碳原子总数通常将为6至12,例如6至10。
[0053] 术语"酮"是指C-C(=0)-C键。
[0054] 术语"吡咯赖氨酸类似物"意指由天然或以遗传方式进化的PylRS识别且在琥珀密 码子位点处纳入蛋白质中的氨基酸衍生物。
[0055]表述"20种天然氨基酸中的一者的侧链"是指与通过其单一字母代码A、C、D、E、F、 G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y已知的20种天然氨基酸相关的式H00C-CHR-NH2中的基 团R。预期L或D立体化学(或其混合物），但L立体化学是优选的。
[0056] 本发明揭示吡咯赖氨酸类似物。
[0057] 本发明的一些吡咯赖氨酸类似物具有式I的结构：
[0059] 其中
[0060] Z =键、CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0、S或CH-NH2;
[0061 ] a是整数3至7;
[0062] b是0或整数1至7;且
[0063] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃。
[0064]已知某些式（I)化合物。
[0065] 因此，式（I)化合物（其中a表示4，Z表示0且_(CH2) b-FG表示-〇12_(^〇1、-〇12012-N3、-CH 2-CH=CH2和-CH2-Ph)揭示于TO 2012/032181中。其他式（I)化合物(其中a表示4，Z表 示0且-(CH2) b-FG表示-CH2CH2CH2-C (= 0) CH3和-CH2CH2CH2-CH=CH2)揭示于W0 2010/139948 中。
[0066] 式（I)化合物(其中a表示4，Z表示键，b表示0且-(CH2)b-FG表示-C(=0)Bn和-C( = 0)Me)揭示于W0 2012/032181中。此外，式（I)化合物(其中a表示4，Z表示键且-(CH2)b_FG表 示-CH 2CH2-CeCH)揭示于TO 2010/139948中。
[0067]在本发明的一个实施例中，式I化合物具有a = 4，从而产生通式IA化合物：
[0069]在本发明的一个替代性实施例中，a = 3,从而产生通式IB化合物：
[0071] 在式I、IA和IB的一个实施例中，Z是键，例如，Z是键，b是0且FG是C( =0)-芳基或C (=0)-烷基。
[0072]在式 I、IA和 IB 的一个实施例中，Z是CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0、S或CH-NH2。例如，Z可 表示〇。替代地，Z可表示NH。替代地，Z可表示CH2、CH-NH2、CH-OH、S或CH-NH2。
[0073] 在一个实施例中，b是1至4。
[0074]在一个实施例中，FG是叠氮化物。
[0075]在一个实施例中，FG是炔烃(例如乙炔基)或环炔烃。
[0076] 在一个实施例中，FG是烯烃，例如乙烯基。
[0077] 在式I、IA和IB中，当FG表示芳基时，一个实例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例 如4-碘苯基。
[0078]实例性式IA化合物是以下各项：
[0079] (2S)-2_氨基-6-{[(2_叠氮基乙氧基)羰基]氨基}己酸
[00811 (2S)-2_氨基_6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸
[0083] (2S)-2_氨基_6-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}己酸
[0085] (2S)-2_氨基-6-{[(2_叠氮基乙基)氨甲酰基]氨基}己酸
[0087] (2S) -2-氨基-6- {[(丙-2-烯-1 -基)氨甲酰基]氨基}己酸
[0089] (2S)-2_氨基-6-{[(3_叠氮基丙氧基)羰基]氨基}己酸
[0091 ] (2S) -2-氨基-6-[ (2S) -2-氨基-4-叠氮基丁酰胺基]己酸
[0093] (2S)-2-氨基-6-({[ (4-碘苯基）甲氧基]羰基}氨基)己酸
[0095] (2S) -2-氨基-6-( 4-叠氮基丁酰胺基）己酸
[0097]以下化合物是式IB化合物的实例：
[0098] (2S)-2_氨基-5-{[(2_叠氮基乙氧基)羰基]氨基}戊酸
[0100] (2S)-2_氨基_5-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}戊酸
[0102] (2S)_2_氨基_5_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}戊酸
[0104]本发明的替代性吡咯赖氨酸类似物具有式II的结构：
[0106] 其中
[0107] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0108] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0109] a =整数3或5至7;且 [0110] b =整数 1 至4。
[0111] 在一个实施例中，FG是叠氮化物。在一个实施例中，FG是炔烃，例如乙炔基或环炔 烃。在一个实施例中，FG是烯烃，例如乙烯基。在一个实施例中，Z表示NH。在一个实施例中，b 表示1或2。在一个实施例中，Z (CH2) bFG表示NH (CH2) 2N3或NHCH2C ^ CH。
[0112] 在式II中，当FG表示芳基时，一个实例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0113] 部分Z(CH2)bFG可表示例如C0-芳基，例如C0-苯基或-C0烷基，例如-COMe。
[0114] 本发明的其他吡咯赖氨酸类似物具有式III的结构：
[0116] 其中
[0117] Y = CH2、NH、0或 S;
[0118] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0119] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0120] a =整数 1 至7;
[0121 ] b =整数1至7，只是当Z是ΝΗ、0或S时，则b是整数2至7;
[0122] 条件是a+b介于2至8范围内；
[0123] 且
[0124] d =整数 1 至4。
[0125] 在一个实施例中，a+b介于3至6范围内，例如3至4。
[0126] 在一个实施例中，a是1。
[0127] 在一个实施例中，b是2。在另一实施例中，b是3。
[0128] 在一个实施例中，FG是叠氮化物。
[0129] 在一个实施例中，FG是炔烃(例如乙炔基)或环炔烃。
[0130] 在一个实施例中，FG是烯烃，例如乙烯基。
[0131] 在式III中，当FG表示芳基时，一个实例是芳香族卤化物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0132] 实例性式III化合物是：
[0133] (2S)-2_氨基-3-[(2-{[(2_叠氮基乙氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0135] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_块-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0137] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙-2-稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0139] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{ [ (2-叠氮基乙基)氨甲酰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0141 ] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_块-1-基)氨甲酰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0143] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0145] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{ [ (2-叠氮基乙基)氨甲酰基]氧基}乙基)硫烷基]丙酸
[0147] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_块-1-基)氨甲酰基]氧基}乙基)硫烷基]丙酸
[0149] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]氧基}乙基)硫烷基]丙酸
[0151] (2S)-2_氨基-3-({3_[(2-叠氮基乙基)氨甲酰基]丙基}硫烷基)丙酸
[0153] (2S)_2_氨基_3_( {3-[(丙_2_块-1-基)氨甲酰基]丙基}硫烷基)丙酸
[0155] (2S)_2_氨基_3_( {3-[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]丙基}硫烷基)丙酸
[0157] (2S)-2_氨基-3-({3-[(2_叠氮基乙基)氨甲酰基]丙基}硫烷基)丙酸
[0159]其他吡咯赖氨酸类似物具有式IV的结构：
[0161] 其中
[0162] Y = CH2、NH、0或 S;
[0163] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0164] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0165] a =整数 1 至7;
[0166] b =整数1至7，只是当Z是ΝΗ、0或S时，则b是整数2至7;
[0167] 条件是a+b介于2至8范围内；
[0168] 且d =整数1至4。
[0169] 在一个实施例中，a+b介于3至6范围内，例如3至4。
[0170] 在一个实施例中，a是1。
[0171] 在一个实施例中，b是2。在另一实施例中，b是3。
[0172] 在一个实施例中，Y是NH且Z是0。在一个实施例中，Y是NH且Z是NH。
[0173] 在一个实施例中，Y是0且Z是0。在一个实施例中，Y是CH2且Z是NH。
[0174] 在一个实施例中，FG是叠氮化物。
[0175] 在一个实施例中，FG是炔烃(例如乙炔基)或环炔烃。
[0176] 在一个实施例中，FG是烯烃，例如乙烯基。
[0177] 在式IV中，当FG表示芳基时，一个实例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0178] 更通常来说，式III和IV化合物称为式X化合物：
[0180] 其中X表示0或S，且所有其他变量如针对式III或IV化合物所定义。
[0181] 实例性化式IV合物如下：
[0182] (2S)_2_氨基_3_(2_{ [ (2_叠氮基乙氧基)幾基]氨基}乙氧基)丙酸
[0184] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_块-1-基氧基)幾基]氨基}乙氧基)丙酸
[0186] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙氧基)丙酸
[0188] (2S)-2_氨基-3-(2-{[(2_叠氮基乙基)氨甲酰基]氨基}乙氧基)丙酸
[0190] (2S)-2-氨基-3-(2-{[(丙-2-炔-1-基)氨甲酰基]氨基}乙氧基)丙酸
[0192] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]氨基}乙氧基)丙酸
[0194] (2S)-2_氨基-3-(2-{[(2_叠氮基乙基)氨甲酰基]氧基}乙氧基)丙酸
[0196] (2S)-2_氨基_3-(2-{[(丙-2-炔-1-基)氨甲酰基]氧基}乙氧基)丙酸
[0198] (2S)-2_氨基_3-(2-{[(丙-2-烯-1-基)氨甲酰基]氧基}乙氧基)丙酸
[0200] (2S)-2-氨基-3-{3-[(2-叠氮基乙基)氨甲酰基]丙氧基}丙酸
[0202] (2S)-2-氨基-3-{3-[(丙-2-炔-1-基)氨甲酰基]丙氧基}丙酸
[0204] (2S)-2-氨基-3-{3-[(丙-2-烯-卜基)氨甲酰基]丙氧基}丙酸
[0206]其他吡咯赖氨酸类似物具有式V的结构：
[0208] 其中
[0209] R = 20种天然氨基酸中的一者的侧链；
[0210] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0211] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0212] a = l;且
[0213] b =整数 1 至4。
[0214] 在一个实施例中，Z是0。
[0215] 在一个实施例中，FG是叠氮化物。
[0216] 在一个实施例中，FG是炔烃(例如乙炔基)或环炔烃。
[0217] 在一个实施例中，FG是稀烃，例如乙烯基。
[0218] 在式V中，当FG表示芳基时，一个实例是芳香族卤化物，例如4-卤苯基，例如4-碘苯 基。
[0219] 实例性式V化合物如下：
[0220] (2S)_2_氨基_3_(2_{ [ (2_叠氮基乙氧基)幾基]氨基}乙酰胺基)丙酸
[0222] (2S)_2_氨基_3-(2-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)丙酸
[0224] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙酰胺基)丙酸
[0226]其他吡咯赖氨酸类似物具有式VI的结构：
[0228] 其中
[0229] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0和 S;
[0230] FG =叠氮化物、稀烃、炔经、酮、酯、芳基和环炔烃；
[0231] a = 4 或 5;且
[0232] b =整数 1 至 4;
[0233] 在一个实施例中，Z是NH。
[0234] 在一个实施例中，a是5。
[0235] 在一个实施例中，FG是叠氮化物。
[0236] 在一个实施例中，FG是炔烃(例如乙炔基)或环炔烃。
[0237] 在一个实施例中，FG是烯烃，例如乙烯基。
[0238] 在式VI中，当FG表示芳基时，一个实例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0239] 以下是实例性式VI化合物：
[0240] (2S)-2_氨基-7-[(2_叠氮基乙基)氨甲酰基]庚酸
[0242 ] (2S) -2-氨基-7-[(丙-2-炔-!-基)氨甲酰基]庚酸
[0244] (2S)-2_氨基-7-[(丙-2-烯-1-基)氨甲酰基]庚酸
[0246]替代性吡咯赖氨酸类似物具有式VII的结构
[0248] 其中
[0249] R =烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
[0250] a =整数1至7;且
[0251] b =整数 1 至3。
[0252] 在一些优选实施例中，a = 4。
[0253] 优选的式VII化合物是(2S)-2_氨基-6-(2-叠氮基戊酰胺基)己酸
[0255]替代性吡咯赖氨酸类似物具有式(VIII)的结构
[0257] 其中
[0258] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0259] = H、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基；
[0260] R2 =烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基；
[0261] R3 = H、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基;且
[0262] a = 1 〇
[0263] 适宜地表示Η或烷基，例如Η或甲基，尤其Η。
[0264] 适宜地R3表示Η或烷基，例如Η或甲基，尤其Η。
[0265] 适宜地Ζ表示0。
[0266] R2可表示例如C3-4烯基(例如CH2CH=CH2)或&-4烷基(例如正丙基或叔丁基）。
[0267] 实例性式VIII化合物如下：
[0268] (2S)-2-氨基-3-(4-叠氮基-2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基} 丁酰胺基)丙酸
[0270] (2S)_2_氨基-3-{4_叠氮基_2_[(丙氧基羰基)氨基]丁酰胺基}丙酸
[0272] (2S)-2_氨基-3-{4-叠氮基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰胺基}丙酸
[0274] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示烯烃时，其适宜地表示_CH=CH2或-CH=CH_CH 3， 优选地-01=012。-(012)广卩6 和-(CH2)d-FG 的实例是-CH2-CH=CH2 和-CH2-CH2-CH=CH2。
[0275] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示炔烃时，其适宜地表示_C = CH或-C = C_CH3,优 选地-C Ξ CH。- (CH2) b-FG和-(CH2) d-FG 的一个实例是-CH2-C Ξ CH 〇
[0276] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示酮时，其适宜地表示_C( =0)-CH3或_C( =0)-CH2-CH3，优选地 _C (= 0) -CH3。
[0277] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示酯时，其适宜地表示_C( =0)-0烷基，例如_C( = 〇)-〇甲基。
[0278] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示芳基时，其适宜地表示经卤素、尤其碘取代的苯 基(例如4-碘-苯基）。
[0279] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示环炔烃时，其适宜地表示环辛炔，例如环辛-4， 5_炔。
[0280] 在式I至VI和X的结构中，当FG表示叠氮化物时，-(CH2)b-FG或-(CH 2)d_FG的一个实 例是_(CH2)2_N3。
[0281] 在式VII和VIII的结构中，当R、R\R2和R3表示芳基时，其适宜地表示苯基。
[0282] 本文所揭示的吡咯赖氨酸类似物可使用多种方法来制备。反应条件通常可由所属 领域技术人员来决定。
[0283] 式I类似物容易地通过以下方式来制备:将活化羰基(例如氯甲酸酯、活化羧酸酯、 异氰酸酯、活化碳酸酯或磺酰卤）添加至类型1的单保护二氨基底物中，其中α-氨基被保护 基团（"PG"）（例如8〇〇、0?、了?4、乙酰基或?111〇(3基团）保护(参见方案1)。偶合产物3可经历其 他修饰，例如用叠氮基亲核试剂置换卤化物以布置所需官能性。另外，对中间体3脱保护以 去除α_氨基酸遮蔽基团以获得所需式1类似物。
[0284]方案 1:
[0286]式VII类似物容易地通过以下方式来制备:首先制备所需α_叠氮基前体。实现此的 一个策略是用叠氮化钠置换离去基团（LG)(例如卤离子(Cl、Br或I)或烷基磺酸根（甲苯磺 酸根、甲磺酸根、三氟甲磺酸根））以获得α-叠氮基酸6。然后可通过用诸如HBTU、DCC和NHS或 CDI等基团活化羧酸将此偶合至类型7的单保护二氨基底物。通过去除遮蔽α-氨基的保护基 团获得产物8。保护基团可依照方案1来使用。参见方案2:
[0288]式II类似物是通过以下方式来制备:用活化羰基(例如羧酸酯、异氰酸酯、酰氯、活 化碳酸酯或磺酰卤10)将羟基氨基酸9偶联至底物。偶合产物11可经历其他修饰，例如通过 置换离去基团（例如卤离子或活化醇)布置叠氮化物官能团。通过最终脱保护去除氨基酸 遮蔽基团来获得所需氨基酸类似物12。保护基团可依照方案1来使用。参见方案3:
[0290] 含有硫醚键的式III类似物容易地通过关键S-烷基化步骤来制备。用所需官能化 烷基化剂14处理硫代氨基酸(例如半胱氨酸13)以影响S-烷基化。然后进行额外官能化以将 氨基酸固定在其最终形式(例如，布置叠氮化物基团）。视需要最终脱保护显露所需氨基酸 16。保护基团可依照方案1来使用。
[0291] 参见方案4:
[0293]式IV类似物可以与半胱氨酸类似物类似的方式制备，其中醚键是通过羟基烷基化 来制备。用烷基化剂18处理经保护的羟基氨基酸(例如丝氨酸17)以影响0-烷基化。然后进 行额外官能化以将氨基酸固定在其最终形式(例如，布置叠氮化物基团）。视需要最终脱保 护显露所需氨基酸20。保护基团可依照方案1来使用。参见方案5:
[0295]式V类似物是以直接方式通过与单保护二氨基衍生物24的关键肽偶合来制备。该 过程开始于将双官能胺(例如α或β氨基酸21)偶合至活化羰基（例如羧酸酯、异氰酸酯、酰 氯、活化碳酸酯或磺酰卤）以获得中间体23。然后用诸如HBTU、DCC和NHS或CDI等试剂或试剂 的组合来活化23的羧酸且将其用于酰化单保护二胺(例如二氨基丙酸24)以获得肽25。对中 间体25脱保护或在即将脱保护成所需氨基酸26之前进一步官能化(例如，叠氮基化）。保护 基团可依照方案1来使用。参见方案6:
[0297]式VI类似物可通过烷基化甘氨酸等效物的α-中心来制备。在此序列中，在碱性条 件下用烷基化剂（例如28)处理经保护的甘氨酸等效物(例如乙酰胺基丙二酸二乙酯27)以 实现甘氨酸衍生物的位置处的烷基化。在酸性或碱性条件下的后续脱保护提供所需氨基 酸30。
[0299]式VIII类似物是通过将叠氮基高丙氨酸衍生物偶合至双官能胺(例如24)的侧链 胺来制备。该过程开始于偶合叠氮基高丙氨酸31与活化羰基(例如羧酸酯、异氰酸酯、酰氯、 活化碳酸酯或磺酰卤）以获得中间体33。然后用诸如HBTU、DCC和NHS或CDI等试剂或试剂的 组合来活化33的羧酸且将其用于酰化单保护二胺(例如二氨基丙酸24)以获得肽34。对中间 体34脱保护以获得35。保护基团可依照方案1来使用。
[0300] 参见方案8:
[0302]将非天然氨基酸纳入蛋白质中
[0303]本文所揭示的吡咯赖氨酸类似物可纳入重组蛋白中。具体来说，可通过琥珀阻抑 将类似物位点特异性纳入重组蛋白中，其中将无义(琥珀)密码子在欲插入吡咯赖氨酸类似 物的位点处插入编码重组蛋白的核苷酸序列内。将突变核苷酸序列以及一个或多个编码 Py 1RS和tRNApy 1的质粒插入无细胞表达系统的细胞中。
[0304]宿主细胞可为经包含如上述DNA构建体的载体转化的真核细胞系。
[0305] 替代地，提供无细胞表达系统，其中自宿主细胞获得的合成反应裂解物包含至少 一种合成多肽所需的组份。自细菌或真核细胞获得合成反应裂解物。
[0306] 优选地自真核细胞、更优选地自兔网状细胞或小麦胚芽获得合成反应裂解物。 [0307]优选地，无细胞表达系统能够表达本发明的WT PylRS和tRNApyl，其中使用本发明 的DNA构建体将tRNApy 1引入所用细胞中以获得合成反应裂解物。
[0308] 适用于本发明中的无细胞表达系统描述于例如WO 201008110、W0 2010081111、TO 2010083148中，这些专利的全文均以引用方式并入本文中。
[0309] 当将吡咯赖氨酸类似物添加至细胞或表达系统中时，所述类似物在指定位置处纳 入重组蛋白中。通过pylRS使nnAA与tRNApyl结合且随后用nnAA将tRNApyl氨酰化。含有琥?白 反密码子的此tRNApyl释放至胞液中，其中响应于琥泊终止密码子该tRNApyl可与核糖体和 所释放的rmAA相互作用以与正生长的多肽链形成肽键。
[0310] 经修饰以纳入本发明吡咯赖氨酸类似物的重组蛋白包括适于位点特异性翻译后 修饰的所有重组蛋白，例如治疗性蛋白质，例如细胞因子、抗体和抗体衍生物(例如Fab片段 或单链抗体，例如单链可变片段(scfv))、肽、酶、融合蛋白、诱饵受体、蛋白质疫苗、蛋白质 激素（例如胰岛素、生长因子(例如人类生长激素、1^、1^5?、1^!1、^^))。可经本发明的 吡咯赖氨酸类似物修饰的其他蛋白质包括诊断标记、成像试剂。
[0311 ]适宜地，蛋白质可经位点特异性修饰以纳入本发明的一或一个以上nnAA(P比略赖 氨酸类似物）。例如，抗体可在重链上或轻链上或在轻链和重链二者上纳入本发明nnAA。
[0312] 蛋白质与所纳入非天然氨基酸的位点特异性偶联
[0313] 已纳入本发明吡咯赖氨酸类似物的蛋白质可用于制备官能化蛋白质偶联物。可偶 联至已纳入非天然氨基酸的蛋白质的分子包括（i)其他蛋白质，例如抗体、尤其单克隆抗 体；（ii)聚合物，例如PEG基团或可使在系统中的半衰期延长的其他基团；（iv)细胞毒性剂， 例如奥里斯他汀(Auristatin)F;和(v)药物部分，例如多柔比星(doxorubicin)和含有放射 性同位素的部分。此外，这些经修饰蛋白质可偶联至药物或核苷酸用于靶向递送这些强效 化合物。
[0314] 下文于抗体药物偶联物的论述中给出某些实施例的更多细节。
[0315] 吡咯赖氨酸类似物可方便地含有独特的化学基团，此容许以靶向方式偶联而无与 其他氨基酸发生副反应的风险。例如，非天然氨基酸可含有叠氮化物或炔基团，此容许利用 胡伊斯根(Hui Sgen)l，3-偶极环加成反应与含有相应炔烃或叠氮化物基团的欲偶联分子反 应。
[0316]本发明的优选偶联化学包括正交于20种天然氨基酸的反应。所述反应并不与20种 天然氨基酸相互作用或引起与其的副反应，其特异性针对与该反应相关的官能团。适宜地， 所需官能团通过本发明的吡咯赖氨酸类似物纳入靶蛋白中。
[0317]此外，所述反应是在以下条件下进行：不破坏蛋白质，例如水性溶剂，且pH范围为 蛋白质所接受且维持其溶解度，在不对蛋白质产生有害作用的温度下。
[0318]增加蛋白质与连接体之间的附接部分的稳定性可能有利。常规方法通过与马来酰 亚胺反应偶联至半胱氨酸的硫醇基团形成硫醇醚。硫醇醚可经历逆反应，自抗体释放连接 体药物衍生物。在本发明的一个实施例中，在叠氮化物与炔烃之间采用的偶联化学产生显 著更稳定且不易于可逆的芳香族三唑。
[0319]此外，反应产物、蛋白质与有效负载之间的键应稳定，稳定性等于或大于与常规键 (酰胺、硫醇醚)相关的稳定性。尽管并不妨碍偶联，但若可在天然条件下进行偶联反应则通 常有利，这是因为此将消除额外重折叠处理步骤。
[0320] 用于产生本发明偶联物的优选化学偶联包括:3+2炔烃-叠氮化物环加成;3+2偶极 环加成；胡伊斯根3+2环加成;铜促进的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC);钌促进的叠氮化物 炔烃环加成(RAAC);金属促进的叠氮化物炔烃环加成(MAAC);应变促进的叠氮化物炔烃环 加成（SPAAC);基于钯的偶合，包括赫克反应(Heck reaction)、菌头反应（Sonogashira reaction)、铃木反应（Suzuki reaction)、斯蒂尔偶合（Stille coupling)、桧山/丹麦反应 (Hiyama/Denmark reaction)、稀经复分解、狄尔斯-阿尔德反应(Diels-alder reaction)、 羰基与肼、酰肼、烷氧基胺或羟基胺的缩合;应变促进的与腈和腈氧化物的环加成；电子促 进的环加成;片段挤出环加成;烯烃环加成、然后β-消除反应。
[0321] 根据一个优选实施例，所纳入的氨基酸含有叠氮化物或炔基团，且化学修饰的工 艺包含使所述叠氮化物或炔基团与包含炔或叠氮化物基团的试剂反应。所设想的反应是胡 伊斯根1，3_偶极环加成反应，其可产生三唑键。包含炔烃或叠氮化物基团的试剂可为任选 地通过连接体携载炔烃或叠氮化物基团的蛋白质（例如抗体)或细胞毒性剂或药物或适于 延长半衰期的物质（例如PEG基团）。
[0322] 所纳入nnAA与靶有效负载之间的位点特异性偶联可使用完全折叠的蛋白质(例如 抗体、抗体片段和细胞因子)来进行。替代地，可在变性剂(例如十二烷基硫酸钠和尿素)存 在下对变性蛋白质进行偶联。可在变性剂和还原剂(例如二硫苏糖醇和2-巯基乙醇)存在下 进行铜催化的叠氮化物炔加成。
[0323] 当将一种以上的nnAA纳入靶蛋白（例如抗体）中时，化学修饰可相同或不同。例如， 若纳入两种nnAA，则一者可经修饰以偶联至药物部分，且一者可经修饰以偶联至PEG部分。
[0324] 方便地，在纳入一种以上具有不同但互补的反应基团的本发明nnAA后，所述nnAA 可彼此反应生成分子内键。
[0325] 在一个实施例中，本发明的偶联化学用于制备抗体药物偶联物。偶联化学还可用 于组装抗体-蛋白质偶联物、蛋白质蛋白质偶联物，例如由抗体片段构成的双特异性抗体。 偶联化学还可用于将聚合物键结的药物偶联物偶联至靶向剂，例如抗体和抗体片段。偶联 化学还可用于将聚合物(例如PEG)附接至蛋白质以操纵药物代谢动力学性质。
[0326] PEG 部分
[0327] 靶蛋白可偶联至PEG部分。PEG部分可纳入抗体药物偶联物中。PEG部分通常可具有 介于5kDa与40kDa之间的分子量，更优选地，PEG部分可具有约20kDa的分子量。PEG部分可为 直链或具支链。
[0328] 抗体药物偶联物(ADC)
[0329] 本发明的吡咯赖氨酸类似物尤其可用于制造具有同源性质的抗体药物偶联物(通 过合成连接体共价结合至给定药物(通常细胞毒性药物或者蛋白质或PEG基团）的重组抗 体），其中每个抗体中药物(或其他偶联分子)的数量和抗体上那些药物的位置明显受控制， 由此获得含有所纳入非天然氨基酸的单克隆抗体且通过正交化学位点特异性偶联至携载 药物部分的连接体(或其他偶联分子）。
[0330] 使用本发明吡咯赖氨酸类似物获得的ADC可遵循以下方法来制造，这些方法包括 以下步骤：
[0331] 1.将一个或多个携载编码全长抗体的DNA序列的质粒引入本发明的稳定细胞系 中，由此在该序列的特定位置处引入终止密码子
[0332] 2.纯化经布置在所需位置处的吡咯赖氨酸类似物(nnAA)修饰的抗体。
[0333] 3.使经修饰以包括与布置在抗体中的nnAA互补的官能团的细胞毒素-连接体衍生 物与通过正交化学含有互补反应基团的经修饰抗体反应
[0334] 4.纯化所得ADC
[0335] 因此，本发明还提供ADC，其中抗体组份已经修饰以在所需位置纳入具有独特反应 性官能团的非天然氨基酸，由此所述官能团允许偶联至药物部分(或蛋白质或PEG基团）。
[0336] 在一个实施例中，本发明提供抗体偶联物，其包含通过包含三唑部分的连接体偶 联至一个或多个(例如一个、两个、三个或四个，优选地一个或两个，尤其一个)选自蛋白质、 药物和PEG部分的部分的抗Her-2抗体。
[0337] 具体来说，三唑部分可通过纳入抗Her-2抗体的序列中的非天然氨基酸的侧链中 的叠氮化物或炔烃部分与附接至蛋白质、药物或PEG部分的炔烃或叠氮化物部分的反应来 形成。
[0338] 在一个实施例中，三唑部分是通过在Cu(I)催化条件下纳入抗Her-2抗体的序列中 的非天然氨基酸的侧链中的叠氮化物或炔烃部分与附接至蛋白质、药物或PEG部分的炔烃 或叠氮化物部分的反应来形成。
[0339] 在一个实施例中，使用叠氮化铜炔烃环加成进行偶联。适宜地，该反应利用具有末 端炔烃的细胞毒性剂，例如奥里斯他汀、蝇蕈素(amanitin)、紫杉酚(taxol)或多柔比星。此 外，该反应采用铜来源，例如硫酸铜、乙酸铜、碘化铜或溴化铜；还原剂，例如抗坏血酸钠、 肼、羟胺、亚硫酸氢钠、二硫苏糖醇、半胱氨酸、b-巯基乙醇；铜螯合配体，例如三[α-苄基-1!1-1，2,3-三唑-4-基）甲基]胺〇8了六)或三(3-羟基丙基三唑基甲基）胺(1'即了六）。适宜地，该 反应可在4°C至50°C下进行。适宜地，反应时间介于0.5hr至48hr范围内。在一个替代性实施 例中，利用应变促进的叠氮化物炔烃环加成进行偶联。适宜地，该反应利用染料、PEG聚合物 或细胞毒性剂(例如具有环辛炔基团的奥里斯他汀）。适宜地，允许将该反应在室温下培育 0·5hr至48hr。
[0340] 盐
[0341] 本文所述的吡咯赖氨酸类似物可任选地以盐形式使用。任何所述盐形成本发明的 一个方面。羧酸盐可包括与1族或2族金属形成的盐，尤其可溶性盐，例如钠盐和钾盐。胺盐 可包括与弱酸和强酸(例如HCl、HBr或乙酸)形成的盐。
[0342] 本发明的实施例
[0343] 本发明的实施例表示如下：
[0344] 1. -种式I的吡咯赖氨酸类似物：
[0346] 其中
[0347] Z =键、CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0、S或CH-NH2;
[0348] a是整数3至7;
[0349] b是0或整数1至7;且
[0350] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃。
[0351] 2.根据实施例1所述的吡咯赖氨酸类似物，其中a是3。
[0352] 3.根据实施例1所述的吡咯赖氨酸类似物，其中a是4。
[0353] 4.根据实施例3所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自
[0355] 5.根据实施例2所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自
[0356] 式 IB.1，
[0358] 6. -种式II的吡咯赖氨酸类似物：
[0360] 其中
[0361] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0362] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0363] a =整数3或5至7;且
[0364] b =整数 1 至4。
[0365] 7. -种式III的吡咯赖氨酸类似物：
[0367] 其中
[0368] Y = CH2、NH、0或 S;
[0369] Z = (?、CH-Mfc、CH-OH、順、0或 S;
[0370] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0371] a =整数 1 至7;
[0372] b =整数1至7，只是当Z是ΝΗ、0或S时，则b是整数2至7;
[0373] 条件是a+b介于2至8范围内；
[0374] 且d =整数1至4。
[0375] 8.根据实施例7所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自
[0376] 式丨 11.1


[0381] 其中
[0382] Y = CH2、NH、0或 S;
[0383] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0384] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0385] a =整数 1 至7;
[0386] b =整数1至7，只是当Z是ΝΗ、0或S时，则b是整数2至7;
[0387] 条件是a+b介于2至8范围内；
[0388] 且
[0389] d =整数 1 至4。
[0390] 10.根据实施例9所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自


[0394] 11. 一种式V的吡咯赖氨酸类似物：
[0396] 其中
[0397] R = 20种天然氨基酸中的一者的侧链；
[0398] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0399] FG =叠氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0400] a = l;且
[0401] b =整数 1 至4。
[0402] 12.根据实施例11所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自
[0404] 13. -种式VI的吡咯赖氨酸类似物：
[0406] 其中
[0407] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0408] FG =叠 氮化物、烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；
[0409] a = 4 或 5;且
[0410] b =整数 1 至 4;
[0411] 14.根据实施例13所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自
[0413] 15 · -种式VII的吡咯赖氨酸类似物：
[0415] 其中
[0416] R =烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
[0417] a =整数1至7;且
[0418] b =整数 1 至3。
[0419] 16.根据实施例15所述的吡咯赖氨酸类似物，其为：
[0420]式 VIU
[0422] 17.-种式VIII的吡咯赖氨酸类似物：
[0424] 其中
[0425] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0426] = H、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基；
[0427] R2 =烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基；
[0428] R3 = H、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环基;且
[0429] a = l〇
[0430] 18.根据实施例17所述的吡咯赖氨酸类似物，其选自
[0432] 19. -种突变体蛋白，其含有作为非天然氨基酸的一种或多种根据实施例1至18中 的任一者所述的吡咯赖氨酸类似物。
[0433] 20.根据技术方案19所述的突变体蛋白，其含有作为非天然氨基酸的一种根据实 施例1至18中的任一者所述的吡咯赖氨酸类似物。
[0434] 21.根据实施例19或实施例20所述的突变体蛋白，其通过一种或多种非天然氨基 酸偶联至一个或多个选自蛋白质、细胞毒性剂、药物和聚合物的部分。
[0435] 22.根据实施例21所述的突变体蛋白，其偶联至PEG部分。
[0436] 23.根据实施例21所述的突变体蛋白，其偶联至抗体部分。
[0437] 24.根据实施例21所述的突变体蛋白，其偶联至细胞毒性剂部分。
[0438] 25.根据实施例21所述的突变体蛋白，其偶联至药物部分。
[0439] 26. -种根据实施例1至18中的任一者所述的吡咯赖氨酸类似物的用途，其用于制 造含有一种或多种非天然氨基酸的突变体蛋白。
[0440] ^lj
[0441 ]实例1.式I和IB类似物的制备
[0442] (2S)-2-氨基-6-[(2S)-2-氨基-4-叠氮基丁酰胺基]己酸(式IA.7)的制备。在具有 磁力搅拌器的20mL小瓶中放置4mL DMF中的N-Boc-叠氮基高丙氨酸（200mg，1当量）和HBTU (31 lmg，1当量）。将混合物搅拌15min，且然后添加 N-Boc-赖氨酸（235mg，1当量)于DMF(3mL) 中的溶液，随后添加三乙胺(228uL)。将小瓶盖上盖且搅拌4h。将混合物分配于250mM梓檬酸 与乙酸乙酯之间。保留有机层且用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干 燥，过滤且浓缩。质谱指示形成所需中间体。通过硅胶色谱实施额外纯化。
[0443] 将经Boc保护的中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(4mL)中。向此中添加盐酸于 二噁烷中的溶液(4N，4mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物冻干。通过离子 交换树脂(Dowex-50)进行额外纯化，提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0444] ((2S)-2_氨基-6-{[(2_叠氮基乙基)氨甲酰基]氨基}己酸(式IA.4)的制备。在具 有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置Boc-N-6-赖氨酸(50mg，l当量)和DMF(lmL)。向此中添加异 氰酸2-氯乙基酯（17.3mg，1.0当量)和吡啶（32.3uL，2当量）。将小瓶盖上盖且允许搅拌4h。 将溶液转移至萃取漏斗，用乙酸乙酯和l〇〇mM柠檬酸稀释。振荡混合物且分离各层。用乙酸 乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用5%氯化锂洗涤，用硫酸钠干燥，过滤且浓缩。通过 质谱鉴定产物且将其直接用于下一步骤中。
[0445] 在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置粗氯代衍生物和DMSO(lmL)。将叠氮化钠 (130mg，5当量)和吡啶（32.3uL，2当量)添加至混合物中且将小瓶盖上盖。在60°C下将混合 物搅拌过夜。将混合物转移至萃取漏斗且用100mM柠檬酸和乙酸乙酯稀释。振荡混合物且分 离各层。用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用5%氯化锂洗涤，用硫酸钠干燥，过 滤且浓缩。通过质谱鉴定中间体且将其用于下一步骤。
[0446] 在20mL小瓶中放置该粗制物和乙腈（2mL)。向此中添加盐酸于二噁烷中的溶液 (4N，2mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物冻干成半固体且用于翻译测试 中。通过质谱确认产物。
[0447] (2S)-2_氨基_6-{[(丙-2-烯-1-基)氨甲酰基]氨基}己酸(式IA.5)的制备。在具有 磁力搅拌器的4mL小瓶中放置Boc-N-6-羟基正亮氨酸(50mg，1当量)和DMF(1 · 5mL)。向此中 添加异氰酸烯丙基酯（18. OuL，1.0当量)和吡啶(32.3uL，2当量）。将小瓶盖上盖且允许搅拌 4h。将溶液转移至萃取漏斗，用乙酸乙酯和lOOmM柠檬酸稀释。振荡混合物且分离各层。用乙 酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用5%氯化锂洗涤，用硫酸钠干燥，过滤且浓缩。通 过质谱鉴定产物且将其直接用于下一步骤中。
[0448]在20mL小瓶中放置乙腈(2mL)中的粗羟基亮氨酸-氨基甲酸烯丙基酯衍生物。向此 中添加盐酸于二噁烷中的溶液(4N，2.5mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物 冻干成半固体且用于翻译测试中。通过质谱确认产物。可利用离子交换色谱(D0WEX-50)进 行额外纯化。
[0449] (2S)-2_氨基-5-{[(2_叠氮基乙氧基)羰基]氨基}戊酸(式IB.1)的制备。在具有磁 力搅拌器的20mL小瓶中放置碳酸钾（1M，2.5mL)和二噁烷(2.5mL)的溶液中的N-Boc-鸟氨酸 (500mg，l当量）。氯甲酸2-氯乙基酯（223uL，l当量)且将小瓶盖上盖并搅拌4h。用1M柠檬酸 将混合物酸化至接近pH 2。将溶液转移至萃取漏斗且用乙酸乙酯（3X )萃取水层。合并有机 层，用硫酸钠干燥且浓缩。LC/MS确认主要产物具有所需质量。粗中间体未经额外纯化即用 于下一步骤。
[0450] 将粗氯化物中间体置于20mL小瓶中且溶解于DMS0(15mL)中。添加叠氮化钠 (625mg，4当量)和吡啶（155uL)且将小瓶盖上盖并在60°C下搅拌过夜。将混合物倾倒至含有 250mM柠檬酸的萃取漏斗中且用乙酸乙酯（3 X)萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥且浓缩。 LC/MS确认形成产物。通过硅胶色谱实施额外纯化。
[0451 ] 将Boc中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(4mL)中。向此中添加盐酸于二噁烷中 的溶液(4N，4mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将浓缩物溶解于水中且施加至离子 交换树脂(Dowex-50)。用水洗涤捕获材料且用碳酸氢铵洗脱。通过TLC鉴定富集有氨基酸的 部分，汇集且冻干以提供所需产物。通过质谱确认产物。
[0452] (2S)_2_氨基_5_{[(丙-2-稀-1-基氧基)羰基]氨基}戊酸(式IB. 3)的制备。在具有 磁力搅拌器的20mL小瓶中放置碳酸钾（1M，2mL)和二噁烷（2mL)的溶液中的N-Boc-鸟氨酸 (300mg，l当量）。添加氯甲酸烯丙基酯（137uL，l当量)且将小瓶盖上盖并搅拌4h。用1M柠檬 酸将混合物酸化至接近pH 2。将溶液转移至萃取漏斗且用乙酸乙酯(3 X)萃取水层。合并有 机层，用硫酸钠干燥且浓缩。LC/MS确认主要产物具有所需质量。通过硅胶色谱进行额外纯 化。
[0453] 将Boc中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(3mL)中。向此中添加盐酸于二噁烷中 的溶液(4N，3mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将浓缩物溶解于水中且施加至离子 交换树脂(Dowex-50)。用水洗涤捕获材料且用碳酸氢铵洗脱。通过TLC鉴定富集有氨基酸的 部分，汇集且冻干以提供所需产物。通过质谱确认产物。
[0454] 实例2.式III化合物的制备
[0455] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{ [ (2_叠氮基乙氧基）幾基]氨基}乙基）硫烷基]丙酸（式 II1.1)的制备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1当量)和碳酸钠溶液 (2.8M，620uL)。向此中添加 DMS0(620uL)中的N-(2-溴乙基)氨基甲酸2-氯乙基酯（99mg，1.0 当量）。将小瓶盖上盖且允许搅拌8h。质谱指示形成所需s-烷基化中间体。确认中间体质量 后，添加叠氮化钠（120mg)和DMSO(lmL)，再次将小瓶盖上盖且将混合物加热60°C过夜。质谱 指示成功形成所需质量。将粗混合物的pH调节至2,冻干成膏糊。将材料悬浮于水中且在离 子交换树脂(D0WEX-50)上捕获，用水洗涤并用氢氧化铵洗脱。汇集所洗脱部分且冻干以提 供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0456] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_块-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸(式 111.2) 的制备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1当量)和碳酸钠溶液 (2.81，620此）。向此中添加二噁烷（62〇111)中的1(2-溴乙基）氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯 (86mg，l.0当量）。将小瓶盖上盖且允许搅拌过夜。质谱指示形成所需S-烷基化产物。将粗混 合物的pH调节至2，冻干成膏糊。将材料悬浮于水中且在离子交换树脂(D0WEX-50)上捕获， 用水洗涤并用氢氧化铵洗脱。汇集所富集部分且冻干以提供所需氨基酸。通过质谱确认产 物。
[0457] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸(式 111.3) 的制备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1当量)和碳酸钠溶液 (2.81，620此）。向此中添加二噁烷（62〇1^)中的1(2-溴乙基）氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯 (88mg，l.0当量）。将小瓶盖上盖且允许搅拌过夜。质谱指示形成所需S-烷基化产物。将粗混 合物的pH调节至2，冻干成膏糊。将材料悬浮于水中且在离子交换树脂(D0WEX-50)上捕获， 用水洗涤并用氢氧化铵洗脱。汇集所富集部分且冻干以提供所需氨基酸。通过质谱确认产 物。
[0458] (25)-2-氨基-3-({3-[(2-叠氮基乙基)氨甲酰基]丙基}硫烷基）丙酸(式111.13) 的制备。在具有磁力搅拌器的20mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1当量)和碳酸氢钠溶液(1M， 1.7mL)。向此中添加二噁烷（1.5mL)中的N-(2-叠氮基乙基)-4-溴丁酰胺(86mg，1.0当量）。 将小瓶盖上盖且允许搅拌8h。质谱指示形成所需S-烷基化产物。将粗混合物的pH调节至2且 施加至离子交换树脂(D0WEX-50)，用水洗涤并用氢氧化铵洗脱。将通过TLC鉴定含有氨基酸 的部分汇集且冻干以提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0459] (2S)_2_氨基_3_( {3-[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]丙基}硫烷基)丙酸(式III. 12) 的制备。在具有磁力搅拌器的20mL小瓶中放置半胱氨酸（285mg，l当量）和碳酸钠溶液 (2.8M，1.2mL)。向此中添加4-溴-N-(丙_2_稀-1-基)丁酰胺（333mg，1.0当量）。将小瓶盖上 盖且允许搅拌过夜。质谱指示形成所需S-烷基化产物。将粗混合物的pH调节至2,冻干成膏 糊。将材料悬浮于水中且在离子交换树脂(D0WEX-50)上捕获，用水洗涤并用氢氧化铵洗脱。 汇集所富集部分且冻干以提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0460]实例3.式V化合物的制备
[0461 ] (2S)_2_氨基_3-(2-{ [ (2-叠氮基乙氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)丙酸(式V. 1)的制 备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的2-{[(2_氯乙氧基)羰基]氨基}乙酸 (5〇11^，1当量）和冊1'1](10511^，1当量）。将混合物搅拌151^11，且然后添加（25)-3-氨基-2-{[(叔丁氧基）羰基]氨基}丙酸（66mg，l当量）于DMF(lmL)中的溶液，随后添加三乙胺 (77uL)。将小瓶盖上盖且搅拌4h。将混合物倾倒至250mM柠檬酸和乙酸乙酯上且振荡。分离 各层且保留有机层。用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤且浓 缩。质谱指示形成所需产物。粗材料未经额外纯化即用于下一步骤中。
[0462] 将氯化物中间体置于20mL小瓶中且溶解于DMS0(5mL)中。添加叠氮化钠（72mg，4当 量)且将小瓶盖上盖并在60 °C下搅拌过夜。将混合物倾倒至250mM柠檬酸和乙酸乙酯上且振 荡。分离各层且保留有机层。用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过 滤且浓缩。质谱指示形成所需产物。可通过硅胶色谱完成额外纯化。
[0463] 通过简单酸化去除boc基团。将Boc-叠氮化物中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙 腈(2mL)中。向此中添加盐酸于二噁烷中的溶液(4N，2mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下 浓缩。将混合物冻干成膏糊。利用离子交换树脂(Dowex-50)进行额外纯化，提供所需氨基 酸。通过质谱确认产物。
[0464] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙酰胺基)丙酸(式V. 3)的 制备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨 基}乙酸（50mg，l当量)和HBTU(120mg，l当量）。将混合物搅拌15min，且然后添加（2S)-3-氨 基-2_{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸(75mg，l当量)于DMF(lmL)中的溶液，随后添加三乙胺 (88uL)。将小瓶盖上盖且搅拌8h。将混合物分配于250mM柠檬酸与乙酸乙酯之间。保留有机 层且用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤且浓缩。质谱指示形 成所需产物。可通过硅胶色谱完成额外纯化。
[0465] 将经Boc保护的中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(2mL)中。向此中添加盐酸于 二噁烷中的溶液(4N，2mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物冻干成膏糊。通 过离子交换树脂(Dowex-50)进行额外纯化，提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0466] (23)-2-氨基-3-(2-{[(丙-2-炔-1_基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)丙酸(式￥.2)的 制备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的2-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨 基}乙酸（50mg，l当量)和HBTU(121mg，l当量）。将混合物搅拌15min，且然后添加（2S)-3-氨 基-2_{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸(76mg，l当量)于DMF(lmL)中的溶液，随后添加三乙胺 (89uL)。将小瓶盖上盖且搅拌8h。将混合物分配于250mM柠檬酸与乙酸乙酯之间。保留有机 层且用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤且浓缩。质谱指示形 成所需产物。可通过硅胶色谱完成额外纯化。
[0467] 将经Boc保护的中间体(2S)-2_{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(2_{[(丙-2-炔-1-基 氧基)羰基]氨基}乙酰胺基）丙酸置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(2mL)中。向此中添加盐酸 于二噁烷中的溶液(4N，2mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物冻干成膏糊。 通过离子交换树脂(Dowex-50)进行额外纯化，提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0468] 实例4.式VII类似物的制备
[0469] (2S)-2_氨基-6-(2-叠氮基戊酰胺基）己酸(式VII. 1)的制备。在具有磁力搅拌器 的20mL小瓶中放置3mL DMF中的2-叠氮基戊酸（100mg，l当量）和HBTU(266mg，l当量）。将混 合物搅拌15min，且然后添加 N-Boc-赖氨酸（200mg，1当量)于DMF( 3mL)中的溶液，随后添加 三乙胺（195uL)。将小瓶盖上盖且搅拌8h。将混合物分配于250mM柠檬酸与乙酸乙酯之间。保 留有机层且用乙酸乙酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤且浓缩。质谱 指示形成所需中间体。通过硅胶色谱实施额外纯化。
[0470] 将中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(2mL)中。向此中添加盐酸于二噁烷中的 溶液（4N，2mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物冻干。通过离子交换树脂 (Dowex-50)进行额外纯化，提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0471 ]实例5.式VIII类似物的制备
[0472] (2S)_2_氨基-3-(4-叠氮基_2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}丁酰胺基)丙酸 (式VIII.1)的制备。在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的（2S)-3-(4-叠氮基-2_{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基} 丁酰胺基)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸(65mg，l 当量)和HBTU(108mg，l当量）。将混合物搅拌15min，且然后添加（2S)-3-氨基-2-{[(叔丁氧 基)羰基]氨基}丙酸(68mg，l当量)于DMF(lmL)中的溶液，随后添加三乙胺(79uL)。将小瓶盖 上盖且搅拌4h。将混合物倾倒至250mM柠檬酸和乙酸乙酯上，振荡且保留有机层。用乙酸乙 酯将水层再萃取两次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤且浓缩。质谱指示形成所需产物。可 通过硅胶色谱完成额外纯化。
[0473] 将经Boc保护的中间体置于20mL小瓶中且悬浮于乙腈(2mL)中。向此中添加盐酸于 二噁烷中的溶液(4N，2mL)。将溶液搅拌2h，且然后在减压下浓缩。将混合物冻干。通过离子 交换树脂(Dowex-50)进行额外纯化，提供所需氨基酸。通过质谱确认产物。
[0474] 实例6.使用GFP分析的翻译测试。
[0475] 研发出基于体外细胞的分析以通过nnAA整合至靶蛋白中和其效率评价pylRS/ tRNA对与本发明吡咯赖氨酸类似物（nnAA)的相容性。为此，使用标准转染方案，用表达 tRNApyl(SEQ ID N0 7)和编码GFPY40的报告子构建体(在氨基酸残基编号40处含有琥珀密 码子而非酪氨酸(其中1是起始子甲硫氨酸））（SEQ ID N0 10和11)的质粒瞬时转染稳定表 达pylRS(SEQ ID N0 4)的HEK293细胞。将经转染细胞与2mM nnAA-起培育2-3天。通过在显 微镜下肉眼检查以定性方式分析GFP产生。通过流式细胞术使用Accur i流式细胞仪量化GFP 荧光，且确定发光细胞的几何平均值。
[0476] 利用此基于细胞的分析来确定不同的nnAA是否是pylRS的适宜底物以及是否允许 其翻译成靶蛋白。在nnAA存在下培育表达PylRS/tRNApyl对且含有编码GFPY40报告基因的 载体的细胞。容易被PylRS/tRNApyl对利用的nnAA支持nnAA翻译成GFP的琥珀位点，且允许 通读产生全长GFP(荧光蛋白）的基因。细胞的荧光强度取决于nnAA纳入的效率。因此，被较 差利用的nnAA产生弱发光或非发光细胞。显微观察鉴定出无法被pylRS利用的nnAA的数量 (表1，阳性GFP)。此外，比较每一样品中的相对表达量与由已知可被pylRS有效利用的底物 生成的那些。式1六.1(]\^1 = 931，289)、式14.2(]\^1 = 1，676,250)和式14.3(]\^1 = 2,250， 〇〇〇)(参见表1)支持高GFP表达量与几何平均值。
[0477] 本
【发明人】发现在所用实验条件下，本发明的类似物式IA.4、IA.5、III.1、III.2、 III.3、III.12、III.13、V.l、V.2、V.3、VII.l纳入GFP报告基因中且产生绿色细胞。其中，在 所测试实验条件下，类似物式111.1(1^1 = 1，989,750)、式111.2(1^1 = 1，847,250)和式 II1.3(MFI = 2，187，000)(参见表2)支持高GFP表达量且代表可被pyIRS/tRNA对有效利用的 类似物。
[0478] 表1:式I类似物GFP结果
[0479] 式 IUPAC名称阳性GFP MFI
[0481 ] 表2:式III类似物GFP结果
[0486] 表4:式VII类似物GFP结果
[0488] 表5:式VIII类似物GFP结果
[0490]实例7.抗体中的吡咯赖氨酸类似物的位点特异性插入以及含有吡咯赖氨酸类似 物残基的抗Her2抗体的偶联构建和表达
[0491] 在哺乳动物细胞中表达含有两种非天然氨基酸(在每一重链中的一者）的全长抗 Her2抗体(4D5-2AZ ab)(SEQ ID N0 15)。将稳定表达编码位置K274处的琥珀位点的Her2抗 体(SEQ ID N0 14)且表达pylRS/tRNA对的CH0细胞暴露于式III.1和式IA.1的nnAA下。在重 链位置K274处纳入含有叠氮化物部分的式III. 1或式ΙΑ. 1的nnAA，且通过亲和色谱使用蛋 白质A树脂(GE医疗(GE Healthcare))或通过IgSelect(GE医疗，17096901)纯化。然后浓缩 经纯化材料且使其经受偶联反应。
[0492] 通过将小鼠抗体4D5的重链和轻链二者的可变区克隆至含有编码人类IgG的基因 的载体中生成针对Her2/neu的细胞外结构域的抗体。使用重叠寡聚物通过基因合成生成 4D5的可变区，且将其克隆至由pFUSE-CHIg-hGl(IgGl重链；y)(SEQ ID N0 12和13)和 pFUSE-CHLIg-hK(轻链;κ;因沃维真（InviVOgen))(SEQ ID NO 16和 17)编码的人类IgGl框 架中，以生成小鼠-人类杂合体。通过位点定向诱变将琥珀密码子引入重链（γ )中的位置 Κ274处（SEQ ID Ν0 14和15)。通过DNA测序鉴定含有琥珀密码子的克隆。为生成整合构建 体，通过PCR扩增重链的启动子和0RF，且通过限值酶消化克隆并连接至pOptivec(生命技术 公司(Life Technologies))中。通过两步PCR方法使用重叠寡聚物连结轻链和单拷贝tRNA， 并将其克隆至可用位点中，进而克隆至含有重链的pOptivec质粒中。然后将构建体转染至 含有pylRS/tRNA对的CH0-DG44细胞系中，且借助使其在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中生 长选择转染子。然后克隆所选细胞，且分离能够将nnAA有效引入琥珀密码子中的高IgG表达 子(表达全长IgG)。使用所选细胞系生成含有上述nnAA的IgG。使细胞在Excel DHFR培养基 (西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich))中生长至1-2 X 106个细胞/mL的密度，且将式III. 1或 式IA.1的nnAA添加至培养物中达到ImM的最终浓度。将细胞培育5天且自生长培养基纯化 IgG。收获上清液且使其经受离心以收集悬浮细胞和其他碎片。然后通过0.22um过滤器过滤 上清液以清除任何颗粒材料，然后施加至色谱柱。使用AKTA色谱系统以l-5mL/min流速将所 过滤上清液施加至lmL-5mL预填充HiTrap蛋白质A Sepharose。用PBS洗涤所结合材料和树 脂以去除松散结合的蛋白质，且用1 OOmM甘氨酸(pH 3.0)以lmL/miη的流速洗脱所结合材 料。用0.1体积分数的1Μ Tri s-HCl (pH 8.0)中和含有靶蛋白的峰部分。在4°C下针对roS将 所有构建体透析16小时至最终磷酸盐缓冲液中。具有式III. 1作为在位置274处纳入其两条 重链中的nnAA的抗体称为"4D5-2AzAb-HC-274-(2S)-2-氨基-3-[ (2-{ [ (2-叠氮基乙氧基） 幾基]氣基}乙基)硫烷基]丙酸。
[0493] 4D5-2AzAb-HC-274-(2S)-2-氨基-3-[ (2-{ [ (2-叠氮基乙氧基）羰基]氨基}乙基） 硫烷基]丙酸的聚乙二醇化
[0494] 在200uL PCR管中放置4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-3-[(2-{[(2-叠氮基乙氧 基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸（式ΠI · 1)的溶液（100uL，0 · 05mg/mL)，然后放置20KPEG 环辛炔的溶液(33.3,60mg/mL)。在涡旋仪上剧烈混合溶液且允许培育过夜。将混合物稀释 至200uL且施加至蛋白质-A磁珠。将混合物祸旋且允许旋转以将珠粒混合90min。固定珠粒 且处置运行通过材料。用PBS(2X)洗涤珠粒，且然后悬浮于还原凝胶缓冲液中。涡旋且然后 加热至95°C并保持3min。将悬浮液直接装载至SDS-PAGE凝胶上。SDS-PAGE凝胶的考马斯染 色(Commassie staining)指示重链的选择性聚乙二醇化(图1，泳道2)。
[0495] 参考文献
[0496] 费克纳，T.、李，X.和成，M.K.( 2010).用于翻译纳入蛋白质中的吡咯赖氨酸类似物 (Pyrrolysine Analogs for Translational Incorporation into Proteins) ·欧洲有机 化学杂志(European Jouranal of Organic Chemistry)，4171_4179〇
[0497] 卡佛兰，J.M.、闪斗拉帕里(Gundllapalli)，S.、0'多诺霍（Donoghue)，P.、恩格勒 特(Englert)，M.、索尔（Soil)，D.和施特尔兹（Steltz)，T.A.(2007).用于遗传密码革新的 一种古细菌酶吡略赖氨酰-tRNA合成酶的结构（Structure of pyrro 1 ysy 1 - tRNA synthetase，an archaeal enzyme for genetic code innovation) ·国家自然科学基金 (Proceedings National Academy of Sciences)，104(27)，11268_11273〇
[0498] 小林(Kobayashi)，T·、柳泽，T.、坂本（Sakamoto)，K.和横山（Yokoyama)，S· (2009) P比略赖氨酰_tRNA合成酶对非a-氨基底物的识别（Recognition of Non-a-amino Substrates by Pyrrolysyl-tRNA Synthetase).分子生物学杂志（J.Mol.Biol.)(1352_ 1360),385〇
[0499] 刘、常(Chang)C和彼得?舒尔茨(Peter G Schultz). "将新化学添加至遗传密码 中（Adding New Chemistries to the Genetic Code)·"生化年评（Annual Review of Biochemistry)，2010:413-444〇
[0500] 成、迈克尔(Michael)K、托马斯费克纳(Tomasz Fekner)、李新(Xin Li)、玛丽安· 李（Marianne Lee)和詹妮弗· J ·奥托（Jennif er J Ottesen) ·国际专利W0 2011/ 044255A1.2011。
[0501] 阮，D.P.、卢希奇（Lusic)，H.、诺依曼，H.K.、代特氏（Deiters)，A.和秦，J.W. (2009).通过吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNAcua对和点击化学对重组蛋白中的脂肪族叠氮 化物和块径进行遗传编码和标记（Genetic Encoding and Labeling of Aliphatic Azides and Alkynes in Recombinant Proteins via a Pyrrolysyl-tRNA Synthetase/ tRNAcua Pair and Click Chemistry) ·美国化学会志（Journal of the American Chemical Society)，8720_8721〇
[0502] 柳泽，T.、石井（Ishii)，R.、福永（Fukunaga)，R.、小林，T.、坂本，K.和横山，S. (2008).对吡咯赖氨酰-tRNA合成酶中的活性位点环的多构象状态的结晶学研究 (Crystallographic Studies on Multiple Conformational States of Active-site loops in Pyrrolysyl-tRNA synthetase).分子生物学杂志，378,634-652。
[0503] 柳泽，T.、石井，R.、福永，R.、小林，T.、坂本，K.和横山，S. (2008).吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的多步改造以遗传编码用于位点特异性蛋白质修饰的Ne-(〇-叠氮基苄基氧基 幾基）赖氨酉爱（Multistep Engineering of Pyrrolysyl-tRNA Synthetase to Genetically Encode Ne-(〇-Azidobenzyloxycarbonyl)lysine for Site Specific Protein Modification).化学与生物学（Chemistry and Biology)，15，1187_1197〇
[0504] 柳泽，T.、墨田（Sumida)，T.、石井，R.和横山，S.(2013).吡咯赖氨酰-tRNA合成酶 的新颖结晶型掲露催化位点中的腺苷酸和氨基酰部分以及天冬酰胺残基的前和后氨基酰-tRNA合成构象状态（A novel crystal fom of pyrrolysyl-tRNA synthetase reveals the pre-and post-aminoacyl-tRNA synthesis conformational states of the adenylate and aminoacyl moieties and an asparagine residue in the catalytic site).结晶学报D辑(Acta Crystallographica Section D)，D69,5_15〇
[0505] 在说明书和随附权利要求书通篇中，除非上下文另有要求，否则应理解，词语'包 含（comprise) '和变化形式(例如'包含（comprises) '和'包含（comprising) '）暗示包括所 述整数、步骤、整数的群组或步骤的群组，但不应理解为排除任何其他整数、步骤、整数的群 组或步骤的群组。
[0506]本文所提到的所有专利和专利申请案的全文均以引用方式并入本文中。
【主权项】
1. 一种式X的化咯赖氨酸类似物：其中 X=0 或 S; Y = CH2、NH、0或 S; Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =叠氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或环烘控； a =整数1至7; b =整数1至7，只是当Z是畑、0或卻寸，贝化是整数2至7; 条件是a+b介于2至8范围内； 且d =整数1至4。2. 根据权利要求1所述的化咯赖氨酸类似物，是式ΠI的化咯赖氨酸类似物：其中3、6、￥、2、(1和。6是如权利要求1中所定义的。3. 根据权利要求2所述的化咯赖氨酸类似物，其选自4. 根据权利要求1所述的化咯赖氨酸类似物，是式IV的化咯赖氨酸类似物：其中3、6、￥、2、(1和。6是如权利要求1中所定义的。5. 根据权利要求4所述的化咯赖氨酸类似物，其选自 式 I V.1為 rV；2其中 Z =键、C出、CH-NH2、CH-OH、畑、ο、S或 CH-NH2; a是整数3至7; b是0或整数1至7;且 FG =叠氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或环烘控； 其前提是： 当a表示4且Z表示0时，-(C此）b-FG不表示-C此-C = CH、-C出CH2-化、-CH2-CH = C出或-C此- Ph； 当a表示4且Z表示0时，-(C出)b-FG不表示-C出C出CH2-C (= 0) C出或-C出CH2C出-CH=CH2; 当a表示4、Z表示键且b表示ο时，-(CH2)b-FG不表示-C( =0)化或-C( =0)Me;且 当a表示4且Z表示键时，-(C出)b-FG不表示-OfcC出-C三CH。7. 根据权利要求6所述的化咯赖氨酸类似物，其中a是3。8. 根据权利要求6所述的化咯赖氨酸类似物，其中a是4。9. 根据权利要求6至化中任一项所述的化咯赖氨酸类似物，其中Z是0。10. 根据权利要求6至化中任一项所述的化咯赖氨酸类似物，其中Z是N。11. 根据权利要求6至化中任一项所述的化咯赖氨酸类似物，其中Z是键。12. 根据权利要求8所述的化咯赖氨酸类似物，其选自13.根据权利要求7所述的化咯赖氨酸类似物，其选自其中 Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =叠氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或环烘控； a =整数3或5至7;且 b =整数1至4。15. -种式V的化咯赖氨酸类似物：其中 R=20种天然氨基酸中的一者的侧链； Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =叠氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或环烘控； a=l;且 b =整数1至4。16.根据权利要求15所述的化咯赖氨酸类似物，其选自其中 Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =叠氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或环烘控； a = 4或5;且 b =整数1至4。18.根据权利要求17所述的化咯赖氨酸类似物，其选自其中 R=烷基、締基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基； a =整数1至7;且 b =整数1至3。20. 根据权利要求19所述的化咯赖氨酸类似物，其是： 式mi21. -种式VIII的化咯赖氨酸类似物：其中 Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、ο或 S; 化=H、烷基、締基、环烷基、环締基、芳基、杂芳基或杂环基； 化=烷基、締基、环烷基、环締基、芳基、杂芳基或杂环基； 化=H、烷基、締基、环烷基、环締基、芳基、杂芳基或杂环基;且 a= 1。22. 根据权利要求21所述的化咯赖氨酸类似物，其选自23. -种突变体蛋白，该突变体蛋白含有作为非天然氨基酸的一种或多种根据权利要 求1到22中任一项所述的化咯赖氨酸类似物。24. 根据权利要求23所述的突变体蛋白，该突变体蛋白含有作为非天然氨基酸的一种 根据权利要求1到22中任一项所述的化咯赖氨酸类似物。25. 根据权利要求23或权利要求24所述的突变体蛋白，该突变体蛋白通过该一种或多 种非天然氨基酸偶联至一个或多个选自蛋白质、细胞毒性剂、药物和聚合物的部分。26. 根据权利要求25所述的突变体蛋白，该突变体蛋白偶联至PEG部分。27. 根据权利要求25所述的突变体蛋白，该突变体蛋白偶联至抗体部分。28. 根据权利要求25所述的突变体蛋白，该突变体蛋白偶联至细胞毒性剂部分。29. 根据权利要求25所述的突变体蛋白，该突变体蛋白偶联至药物部分。30. 根据权利要求1到22中任一项所述的化咯赖氨酸类似物在制造含有一种或多种非 天然氨基酸的突变体蛋白中的用途。
【文档编号】C07C275/10GK105980350SQ201480041770
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年8月4日
【发明人】M·马瑞利, M·V·布伦特, K·H·格拉布斯坦
【申请人】米迪缪尼有限公司