专利名称：：一种植物样品中吲哚乙酸含量的酶传感测定方法
技术领域：
：本发明属于植物激素检测领域，具体涉及一种植物样品中吲哚乙酸含量的酶传感测定方法。
背景技术：
：自1928年发现生长素以来，与植物激素有关的研究几乎已涉及到植物学研究的所有领域，植物激素及其作用机理的研究已成为人们认识和理解植物生命现象的重要途径，为作物遗传改良提供了强有力的理论支撑，在推动"绿色革命"、大幅度提高作物产量和保证国家粮食安全方面发挥了不可替代的作用。近年来，随着植物分子生物学和基因组学的发展，以拟南芥和水稻为代表的模式植物基因组研究不断取得突破，使本身就处于科学前沿的植物激素研究进入了全新的快速发展阶段。与此同时，作为关键支撑技术的植物激素成分分析及检测方法已开始成为开展植物激素研究领域的限制因子之一。吲哚乙酸(Indole-3-AceticAcid，IAA)是第一种被发现的属于生长素类的植物激素，能诱导基因的表达，启动一系列生长发育的反应，如细胞伸长、分裂、维管分化、顶端优势及根系的形成等，在植物生长发育过程中起重要的调控作用。1928年，Went通过著名的燕麦芽鞘弯曲实验而首次建立了检测植物生长素的生物测试法。除此之外，常用于测定IAA等植物激素的传统方法还有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用(GC/MS)或液-质(LC/MS)联用、酶联免疫(ELISA)、放射免疫(RIA)等方法。这些方法各有优点，但都存在一定的局限性。其中，生物试法简单易行，能反映被测植物激素的生理活性，但不能排除植物激素类似物和拮抗物的影响，专一性和灵敏度均较低；色谱法灵敏度高、重现性好，但对待测样品需要量大、样品前处理复杂且需要昂贵的仪器设备和较高的使用维护费用；酶联免疫法和放射免疫法灵敏度较高，但抗体制备和纯化较为困难、测定周期长且很难排除植物激素前体物和结构类似物的影响。而且，酶联免疫法的重现性受环境条件影响较大，放射免疫法还存在放射性废物处理的问题。植物激素与生长发育湖南省重点实验室所研制的植物激素免疫传感测定方法是继生物试法、物理化学方法、酶联免疫与放射免疫等方法之后，在植物激素测定方法领域的重大创新与突破，如所研制的植物激素免疫传感器可以直接测定出提取液中不同植物激素含量，且结构简单、制造简便和操作方面。本发明力图建立一种IAA含量的酶传感测定方法。
发明内容本发明目的是提供一种能克服现有检测技术的不足(测定时间长、成本高、操作繁琐等)、快速和高灵敏检测IAA的新方法。为了解决所述技术问题，这种酶传感检测IAA的方法主要包括以下步骤来实现(1)酶传感器将铂电极依次用金相砂纸、含氧化铝悬浮液的麂皮进行粗磨和抛光成镜面，洗净后进行硫堇电聚合和戊二醛共价交联吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶后待用；(2)绘制标准曲线利用所构建酶传感器测定一系列不同浓度的IAA，根据电流变化与IAA浓度之间的关系绘制标准曲线；(3)用所构建的酶传感器检测样品的电流变化，根据标准曲线计算IAA浓度。本发明方法步骤(1)中所述IAA电化学酶传感器的构建采用以下步骤(图1):①电极的修饰以铂电极(Plati皿mElectrode,Pt)作为传感器的基体电极，使用前电极需要依次经过6号金相砂纸、含1.0、0.3和0.05iim氧化铝悬浮液的麂皮上进行粗磨和抛光成镜面，并用水、乙醇超声清洗电极表面；②硫堇电聚合将洗净后的Pt电极置于三电极体系中浸泡在5mL、含有5mmol/L的硫堇溶液和pH=4.5醋酸-醋酸钠溶液当中，在-0.41.2V的电位范围内，以0.05V/s的扫描速度进行循环扫描。然后用双蒸水冲洗电极表面并干燥；③戊二醛共价交联在电极表面滴加16yL浓度为2.5%的戊二醛溶液，在室温下静置lh。接着，洗净电极表面，吹干。取吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶16yL，滴加于电极表面，置于人工气候箱(37°C)中温育lh后待用。本发明方法步骤(2中所述标准曲线的绘制为将组装好的酶电极作为工作电极与Ag/AgCl电极和铂丝电极构建成的三电极系统浸入5mL的pH5.8的磷酸缓冲液中进行循环伏安法测定电流的变化。整个检测过程都在室温下进行。电压范围为-0.8V0.8V，扫描速度为0.lvs—、一次测定过程包括两次电流检测，一是在吲哚乙酸氧化酶固定在电极表面后进行的电流检测，记为I。；二是在工作底液(pH5.8的磷酸缓冲液)中加入待测IAA，进行的电流检测，记为I"则电流的增加量为AI=IrI。。不同浓度的IAA对应着不同的电流增加值，通过已知浓度的IAA和对应的电流增加值做出标准曲线。本发明中，所述的硫堇电聚合溶液为5mmol/LThionine(含5mL，pH=4.5AceticAcid-SodiumAcetateBuffer)。所述的戊二醛溶液为25%的戊二醛溶液稀释10倍。所述的PBS为0.lmol/L的磷酸缓冲液(pH5.8)。整个制作过程都使用双蒸水。本发明的检测原理本发明检测方法是基于利用电化学传感器具有简便、快速、灵敏的特点，结合酶与底物发生氧化还原反应(电子传递)而形成的一种自动化分析检测系统，来检测植物样品中IAA的含量。本发明中，利用硫堇单体和聚硫堇具有很好的电化学可逆性、稳定性和快速的电子传递能力，通过电沉积方法增强电极的电子传递能力。然后利用戊二醛共价交联法将从植物组织中提取的吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶固定在电极表面，形成一个酶传感器。由于吲哚乙酸与吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶能发生氧化还原反应，在该反应中发生了电子传递从而引起电极表面的电流或电阻的变化。同时，采用循环伏安法进行测定IAA。根据电流的变化值和IAA浓度两者的关系，绘制标准工作溶液，然后根据标准曲线可以检测未知浓度的IAA。本发明效果本方法能在3小时内得出结果，灵敏度为0.liig/mL，与HPLC测定结果保持了较高的一致性。本文对植物苎麻花芽中IAA含量的测定实例表明，本发明的检测方法能运用在植物激素的实际测定。并且，本发明还对测定的条件进行了优化设计，来提高测定的精确性和灵敏度。由此可见，本发明主要解决了IAA在植物体内含量低、又易分解的问题IAA在植物体内含量甚微，含量一般为10100ng/g，并且其性质不稳定，容易被高温、光以及氧气所分解。本发明利用生物传感器的高灵敏度、操作步骤简单、耗时少的特点，对IAA进行测定，进一步提高检测的准确度，实现IAA的定量测定。本发明的检测方法，无需特殊标记，无需昂贵仪器，无需复杂的检测过程，显著改善了IAA传统检测方法的复杂度4和灵敏度，可实现IAA的快速和高灵敏检测。图1是本发明所用酶传感器的制备过程图。具体实施例方式下面结合实例对本发明作进一步描述—、试剂与仪器IAA、购于Sigma-Aldrich公司。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、石英砂、无水乙醇、硫堇、醋酸钠、冰醋酸、25%戊二醛均购自上海化学试剂公司。电流检测过程是在CHI760c电化学工作站(上海辰华仪器公司)上进行。三电极体系中以铂电极(CHI102，直径2mm，上海辰华仪器公司)作为工作电极，钼丝电极(CHI115，上海辰华仪器公司)作为对电极即辅助电极，Ag/AgCl电极(CHI111，上海辰华仪器公司)作为参比电极。BRANSONIC200超声波清洗仪(德国BRANSONULTRASCHALL公司)，CS501-SP型超级数显恒温器(重庆四达实验仪器厂制造)，HP300GS-C型智能人工气候箱(武汉瑞华仪器设备有限责任公司)，MP230酸度计(瑞士MetterToledo公司)，AB204-S电子天平(瑞士MetterToledo公司)，AgilentllOOHPLC液相色谱仪(美国，Agilent公司)。二、实施方法1、制备IAA电化学酶传感器(图1):1)、电极的修饰以铂电极(PlatinumElectrode,Pt)作为传感器的基体电极，使用前电极需要依次经过6号金相砂纸、含1.0、0.3和0.05iim氧化铝悬浮液的麂皮上进行粗磨和抛光成镜面，并用水、乙醇超声清洗电极表面；2)、硫堇电聚合将洗净后的Pt电极置于三电极体系中浸泡在5mL、含有5mmol/L的硫堇溶液和pH4.5醋酸-醋酸钠溶液当中，在-O.41.2V的电位范围内，以0.05V/s的扫描速度进行循环扫描。然后用双蒸水冲洗电极表面并干燥；3)、戊二醛共价交联在电极表面滴加16iiL浓度为2.5X的戊二醛溶液，在室温下静置lh。接着，洗净电极表面，吹干。取吲哚乙酸氧化酶16yL，滴加于电极表面，置于人工气候箱(37°C)中温育lh后待用。该吲哚乙酸氧化酶是从培养了35天的绿豆幼苗下胚轴处提取的，并采用比色法进行酶活测定；2、测定一系列不同浓度的IAA，绘制标准曲线循环伏安法测定将组装好的酶电极作为工作电极与Ag/AgCl电极和铂丝电极构建成的三电极系统浸入5mL的pH5.8的PBS中进行循环伏安法测定电流的变化。整个检测过程都在室温下进行。电压范围为_0.8￥0.8￥、扫描速度为0.lv*s—、以PBS作为工作底液，依次在工作底液中滴加IAA标准溶液50iig/mL、250yg/mL、500yg/mL、750yg/mL、1000iig/mL。然后根据IAA每个浓度所对应的电流变化值和IAA浓度之间的关系绘制标准工作曲线。试验结果表明，该传感器在IAA浓度为5iig/mLlmg/mL范围内具有良好的线性关系，其线性方程为y=0.0117x+3.388，R2=0.9939，其检测下限为0.1yg/mL。3、检测实例利用该传感器对苎麻花芽中IAA含量进行了检测取苎麻花芽鲜样1.5000g，于51.5mL离心管中冰浴研磨，加入600iiL100%的甲醇，混匀后浸提过夜，4800g离心10min，取上清液于一新离心管中，剩余残渣用200iiL100X的甲醇浸提2h，4800g离心10min，取上清，合并两次上清液，移入一新5mL离心管中。用3000yL超纯水稀释提取液，过WatersS印-pak(]18柱，用200iiL20X甲醇和250iiL30%甲醇分别洗脱后，用300yL100%甲醇洗脱并收集IAA，用于后续的检测和分析。接着，将收集好的IAA用100iiL100%甲醇溶解后，取20yL进行HPLC检领"同时，取20iiL滴加入PBS溶液中，用传感器检测。两种方法的检测结果表明，与HPLC测定的结果基本一致(表1)。表1IAA电化学酶传感器与HPLC检测苎麻中IAA含量(±s，n=3)的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种检测植物样品中IAA含量的方法，其特征在于包括以下步骤(1)在铂电极表面构建电化学酶传感器以铂电极为基体电极，通过电聚合和共价交联等过程固定氧化酶后，构建一个传感器；(2)绘制IAA电化学酶传感测定标准曲线利用已构建的酶传感器测定不同浓度的IAA标准溶液。在工作底液磷酸缓冲液(PBS，pH5.8)中依次加入不同浓度的IAA，然后采用循环伏安法测定电流。随着IAA浓度的变化，电流也随之发生变化。最后，以IAA浓度为横坐标，以电流的变化值为纵坐标绘制标准工作曲线。(3)植物样品检测。用所构建的传感器测定植物样品的电流变化，根据标准曲线计算IAA含量。2.根据权利要求1所述的检测植物样品中IAA含量的方法，其特征包括(1)中所述IAA电化学酶传感器的构建，首先要对电极进行修饰，以铂电极(Plati皿mElectrode，Pt)作为传感器的基体电极，使用前电极需要依次经过6号金相砂纸、含1.0、0.3和0.05i！m氧化铝悬浮液的麂皮上进行粗磨和抛光成镜面，并用水、乙醇超声清洗电极表面；(1)中所述IAA电化学酶传感器的构建，对电极进行修饰后需进行硫堇电聚合，将洗净后的Pt电极置于三电极体系中浸泡在5mL含有5mmol/L的硫堇溶液和pH4.5醋酸-醋酸钠溶液当中，在-0.41.2V的电位范围内，以0.05V/s的扫描速度进行循环扫描。然后用双蒸水冲洗电极表面并干燥；(1)中所述IAA电化学酶传感器的构建，电极硫堇电聚合后进行戊二醛共价交联，在电极表面滴加16yL浓度为2.5%的戊二醛溶液，在室温下静置lh后，洗净电极表面，吹干。取氧化酶16iiL，滴加于电极表面，置于人工气候箱(37°C)中温育lh;(1)中所述氧化酶为吲哚乙酸氧化酶或辣根过氧化物酶，用量范围0.10.3mg;(1)中所述IAA电化学酶传感器，构建好后进行循环伏安法测定IAA，将电极洗净并干燥，以PBS为工作底液，在其溶液中加入IAA，利用循环伏安法测定电流的变化；(2)中所述的绘制标准曲线，在PBS(pH=5.8)工作底液中依次加入不同浓度的IAA，然后采用循环伏安法测定电流。不同的IAA浓度有着不同的电流响应。根据两者对应的关系，以IAA浓度为横坐标，以电流的变化值为纵坐标绘制标准工作曲线。所得的标准曲线表明，在一定的浓度范围内，IAA浓度与电流呈一定的线性关系；(3)中所述的植物样品检测，先从植物样品中提取和纯化IAA，然后将IAA滴加入工作底液(PBS)中，用该发明中所述的传感器测定IAA。全文摘要本发明是涉及一种植物样品中吲哚乙酸(IAA)含量的酶传感测定方法，主要包括以下步骤来实现1)构建酶传感器将铂电极依次用金相砂纸、含氧化铝悬浮液的麂皮进行粗磨和抛光成镜面，洗净后进行硫堇电聚合和戊二醛共价交联氧化酶后待用；2)绘制标准曲线利用所构建酶传感器测定一系列不同浓度的IAA，根据电流变化与IAA浓度之间的关系绘制标准曲线；3)检测样品IAA含量用所构建的酶传感器检测样品的电流变化，根据标准曲线计算IAA浓度。本发明有益的效果是酶传感测定IAA是一种快速准确测定植物样品IAA含量的方法，与传统检测方法相比，具有简便、结果可靠和测定成本低等优点。文档编号G01N27/327GK101788519SQ20101010103公开日2010年7月28日申请日期2010年1月26日优先权日2010年1月26日发明者丁君辉,刘清,王若仲,肖浪涛,黄志刚申请人:湖南农业大学