专利名称：一种产油微生物rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物RNA的提取方法，特别是涉及到产油微生物RNA的提取方
法。
背景技术：
自然界中部分微生物，如细菌、酵母菌、霉菌和藻类等，能在特定的培养条件下，在胞内贮存质量超过其细胞干重20% (w/w)的油脂，具有这种表型的微生物被称为产油微生物。这些产油微生物所产的油脂主要以脂肪酸甘油三酯的形式存在，其组成与一般的动植物油脂相似。近年来微生物油脂发酵也逐渐成为生物柴油产业和工业生物技术的重要研究方向。相对于一般的微生物来说，产油微生物胞内油脂含量较高。如某些红酵母属的菌株能以糖质原料为碳源的培养基发酵，在胞内积累超过其细胞干重70% (w/w)的油脂(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microb Technol，2007 (41) :312_317)，而同时还大量合成色素。 这些高含量的油脂与色素对RNA的分离纯化会产生很大的干扰，严重影响提取RNA的质量和产量。而分离提取高质量的RNA是基因表达、调控与基因工程等研究的基础。目前微生物RNA提取方法有很多，单独采用Trizol试剂盒(Gilchrist Μ, MacDonald AJ, Neverova I，et al.J Immunol methods, 1997(201) :207_214)、热酸酚处理(Schmitt ME, Brown, TA, Trumpower LB. Nucleic Acids Res, 1990(18) :3091_3092)、玻璃珠破碎细胞(奥斯伯 F， 金斯顿R，塞德曼J.精编分子生物学实验指南.1998 :597-598)和液氮研磨(Sayler GS, Fleming JT, Nivens DE. Curr Opin Biotechnol. 2001(12) :455_60)等方法均不能有效的从产油微生物中提取高质量的RNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、简单的操作方法，从产油微生物中提取高质量 (高纯度)的细胞总RNA。为了实现上述目的，本发明所采用的操作步骤为一种从产油微生物中提取高质量RNA的方法，产油菌体首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取缓冲液中采用玻璃珠振荡(相结合的方式)进行细胞破碎，得细胞破碎液；在细胞破碎液中加入有机溶剂去除油脂，离心后取水相，加入醋酸钠、酸性苯酚、氯仿和异戊醇除去胞内蛋白，离心后取水相加入异丙醇沉淀RNA，洗涤沉淀，真空干燥后加入DEPC 处理水溶解。具体操作过程为，1)取细胞密度为1 X IO7-I X IO8细胞/ml的菌体经液氮速冻的产油菌体研磨破碎 0. 5-30min至粉末状，刮取粉末装于离心管中，加入RNA提取缓冲液，菌体与RNA提取缓冲液体积比例为IOml l-2ml ；2)向离心管中加入玻璃珠间歇振荡，总的破碎时间为0. 5-30min ；每IOml菌体 (5ml离心管中)加入0. 5-1. 5g玻璃珠；
3)向离心管中加入有机溶剂，充分混勻后0-4°C，12000-18000Xg离心5-lOmin ； 有机溶剂的量为1/4-3/4RNA提取缓冲液体积；4)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入浓度为3M、pH为4. 6的醋酸钠和体积比为25 24 1酸性苯酚/氯仿/异戊醇混合液，充分混勻0-4°C，12000-18000Xg 离 心5-15min ；按IOml菌体计，加入100 μ 1的醋酸钠和Iml混合液；5)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇混勻，置于 0—70°C放置 5min-16h，然后 0-4°C，12000-18000 X g 离心 5_15min 获得沉淀的 RNA ；6)获得的RNA沉淀用70%的乙醇洗涤干燥后加入体积比0. 01 % -0. 5%的DEPC 处理水溶解保存。RNA提取缓冲液为内含4M异硫氰酸胍、0. 5wt%十二烷基肌氨酸钠、25mM柠檬酸钠、pH 7.0,0. 5wt%巯基乙醇的水溶液。所述的玻璃珠振荡破碎方法为间歇振荡，每次振荡IOs-IOmin后置于冰上冷却 0. 5-10min，总的破碎时间为0. 5_30min，玻璃珠直径为0. 2_lmm。所述去除油脂的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、石油醚或它们之间的任意比例混合。本发明区别于传统的微生物RNA提取方法，为了快速的破碎细胞，采用液氮研磨和玻璃珠振荡相结合的方式。本发明加入有机试剂，有效的去除了产油微生物胞内大量油脂及色素，减少了对 RNA分离纯化的干扰。本发明使用的产油微生物包括但不限于产油真菌，如 Rhodosporidiumtoruloides、Cryptococcus curvatus、Yarrowia IipoIytica、Rhodotorula glutinis、Rhizopus arrhizus、Lipomyces starkeyi、Mortierella isabellina、 Mucorcircinelloides 禾口 Cunninghamella ；产油细菌，如 Croynebacterium、Nocardia 禾口 Mycobacterium ；产油微藻，如 Botryococcus braunii、Crypthecodiniumcohni i、ChloreIla protothecoides>Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytriumlimacinum。所得的高质量 RNA 可广泛应用于如Northern杂交、mRNA分离、RACE、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等。
图1.产油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560总RNA提取电泳分析，泳道1 没有加入有机试剂去除油脂；2 加入有机试剂去除油脂(以下相同)。图 2.产油酵母 Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 总 RNA 提取电泳分析。图3.产油微藻Botryococcus braunii LB572总RNA提取电泳分析。图 4.产油酵母 Yarrowia lipolytica AS 2. 1398 总 RNA 提取电泳分析。图 5.产油霉菌 Mucor circinelloides AS 3. 2208 总 RNA 提取电泳分析。图 6.产油酵母 Rhodotorula glutinis AS 2. 703 总 RNA 提取电泳分析。图 7.产油细菌 Corynebacterium glutanicum 总 RNA 提取电泳分析。
具体实施例方式以下实施例选取了一些典型的产油微生物菌株，说明了产油微生物RNA的提取方法，这将有助于了解本专利，但不以任何形式限制在其它菌株材料上应用本发明。下述实施例中所用试剂1. RNA提取缓冲液4M异硫氰酸胍，0. 5 %十二烷基肌氨酸钠，25mM柠檬酸钠，pH 7.0，0.5%巯基乙醇；2. DEPC处理水100ml去离子水加入100 μ 1 DEPC,常温下混勻，高压灭菌，得体积比0. 1 %的DEPC处理水；3.醋酸钠将24. 61g醋酸钠溶于DEPC处理水中，用冰醋酸调节pH为4. 6，定容置 100ml，高压灭菌。
实施例一将产油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)培养到细胞密度为IX IO8细胞/ml，收集IOml菌体液氮速冻。酵母细胞液氮研磨IOmin至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的RNA提取缓冲液，混勻，加入1. 5g直径为0. 4mm的玻璃珠，涡旋振荡lOmin，间歇lOmin，总破碎时间为 30min，加入500 μ 1氯仿后充分混勻(对照组不加氯仿)，13，OOO X g离心IOmin,小心吸取水相，依次加入ΙΟΟμΙ的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 1)， 颠倒转几次混合均勻，冰浴15min，4°C条件下13，OOOXg离心15min，将水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后置于-70°C放置lh，4°C条件下13，OOOXg离心15min，去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水沉淀，置于-70°C低温条件下保存。实施例二 将产油酵母Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)培养到细胞密度为IX IO8细胞/ml，收集IOml菌体液氮速冻。酵母细胞液氮研磨30min至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的 RNA提取缓冲液，混勻，加入1. 5g直径为0. 4mm的玻璃珠，涡旋振荡0. 5min,间歇0. 5min, 总破碎时间为Ιπ η,ΜΛδΟΟμΙ氯仿后充分混勻(对照组不加氯仿)，13，OOOXg离心 IOmin,小心吸取水相，依次加入100 μ 1的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为 25 24 1)，颠倒转几次混合均勻，冰浴1511^11，41条件下13，000乂8离心151^11，将水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后置于-20°C放置5min，4°C条件下 13，000 Xg离心15min，去上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水溶解沉淀，置于-70°C低温条件下保存。实施例三将产油微藻Botryococcus braunii LB572 (菌株来源于美国德克萨斯大学)培养到细胞密度为ι χ IO7细胞/ml，收集IOml菌体液氮速冻。细胞液氮研磨2min至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的RNA提取缓冲液，混勻，加入1. 5g直径为0. 6mm玻璃珠，涡旋振荡3min，间歇3min，总破碎时间为9min，加入500 μ 1 二氯甲烷后充分混勻(对照组不加二氯甲烷)，13，000 Xg离心lOmin，小心吸取水相，依次加入100 μ 1 的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 1)，颠倒转几次混合均勻，冰浴15min，4°C条件下13，000 Xg离心15min，将水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后置于_50°C放置20min，4°C条件下13，OOOXg离心15min，去上清液，70% 乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水溶解沉淀，置于_70°C低温条件下保存。实施例四将产油酵母Yarrowia lipolytica AS 2. 1398 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)培养到细胞密度为1 X IO8细胞/ml，收集IOml菌体，液氮速冻。酵母细胞液氮研磨IOmin至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的RNA提取缓冲液，混勻，加入1. 5g直径为0. 4mm的玻璃珠，涡旋振荡2min，间歇2min，总破碎时间为6min，加入500μ1氯仿/ 二氯甲烷(体积比为1 1)后充分混勻(对照组不加氯仿/ 二氯甲烷)，13，000Xg离心lOmin，小心吸取水相，依次加入100 μ 1的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 1)，颠倒转几次混合均勻，冰浴15min，4°C条件下 13，OOOXg离心15min，将水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后 置于-60°C放置16h，4°C条件下13，OOOXg离心15min，小心去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水溶解沉淀，置于-70°C低温条件下保存。实施例五将产油霉菌Mucor circinelloides AS 3. 2208 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)培养到细胞密度为1 X IO8细胞/ml，收集IOml菌体，液氮速冻。 酵母细胞研磨15min至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的RNA提取缓冲液，混勻，加入1. 5g直径为Imm的玻璃珠，涡旋振荡5min，间歇5min，总破碎时间为lOmin， 加入500 μ 1 二氯甲烷后充分混勻(对照组不加二氯甲烷)，13，000 X g离心lOmin，小心吸取水相，依次加入ΙΟΟμΙ的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 1)， 颠倒转几次混合均勻，冰浴15min，4°C条件下13，OOOXg离心15min，将水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后置于_20°C放置10h，4°C条件下13，OOOXg离心 15min，去上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水溶解沉淀，置于-70°C低温条件下保存。实施例六将产油酵母Rhodotorula glutinis AS 2. 703 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)培养到细胞密度为IX IO8细胞/ml，收集IOml菌体，液氮速冻。 酵母细胞液氮研磨IOmin至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的RNA提取缓冲液，混勻，加入Ig直径为0. 2mm的玻璃珠，涡旋振荡3min，间歇4min，总破碎时间为 15min，加入500 μ 1石油醚后充分混勻(对照组不加石油醚)，13，000 X g离心5min，小心取上清，依次加入ΙΟΟμΙ的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25 24 1)， 颠倒转几次混合均勻，冰浴15min，4°C条件下13，OOOXg离心15min，将上层水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后置于0°C放置21!，41条件下13，000\8离心 20min,小心去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水溶解沉淀，置于-70°C低温条件下保存。实施例七将产油细菌Corynebacterium glutanicum(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)培养到细胞密度为IX IO8细胞/ml，收集IOml菌体，液氮速冻。酵母细胞液氮研磨0. 5min至粉末状，刮取粉末装于5ml离心管中，加入Iml预冷的RNA提取缓冲液，混勻，加入0. 5g直径为0. 2mm的玻璃珠，涡旋振荡10s，间歇0. 5min,总破碎时间为 0.5min，加入500μ1石油醚/氯仿(体积比为1 1)后充分混勻(对照组不加石油醚/氯仿)，13，000 Xg离心lOmin，小心吸取水相，依次加入100 μ 1的醋酸钠、Iml酸性苯酚/氯仿 /异戊醇(体积比为25 24 1)，颠倒转几次混合均勻，冰浴15min，4°C条件下13，OOOXg 离心15min，将水相转移至干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混勻后置于-30°C放置2h，4°C条件下13，000 Xg离心15min，小心去除上清液，70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥后加入100 μ 1 DEPC处理水溶解沉淀，置于-70°C低温条件下保存。以上实施例所表述的，加入或不加有机溶剂去除胞内油脂所提取的细胞总RNA，它们的电泳分析结果分别见说明书附图1-7。从图中可以看出，采用本发明方法提取的细胞总 RNA,电泳检测28S和18S rRNA条带相对于没有加有机溶剂的方法要清晰，说明RNA保持了良好的完整性。取实施例1-7中加入有机试剂去除油脂所得到的RNA样品，加蒸馏水稀释50倍， 并以蒸馏水做空白对照，分别在230nm、260nm、280nm处调节紫外分光光度计的读数至零， 然后读出待测样品在三个波长处的OD值。表1结果显示通过紫外分光光度计检测总RNA 的OD26tZOD28tl值，均介于1. 8-2. 2之间，说明RNA纯度符合要求。表IRNA纯度检测
权利要求
1.一种从产油微生物中提取高质量RNA的方法，其特征在于产油菌体首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取缓冲液中采用玻璃珠振荡进行细胞破碎，得细胞破碎液；在细胞破碎液中加入有机溶剂去除油脂，离心后取水相，加入醋酸钠、酸性苯酚、氯仿和异戊醇除去胞内蛋白，离心后取水相加入异丙醇沉淀RNA，洗涤沉淀， 真空干燥后加入DEPC处理水溶解。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产油微生物为产油真菌、产油细菌和/或产油微藻。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述产油真菌为Rhodosporidium toruloides、Cryptococcus curvatus、Yarrowia lipolyica、Rhodotorula glutinis、 Rhizopus arrhizus、 Lipomyces starkeyi、 Mortiere1Iaisabe11ina、 Mucor circinelloides、Cunninghamella 中白勺一禾中或多禾中，产油细菌为 Croynebacterium、 Nocardia 禾口 Mycobacterium 中的一禾中或多禾中；产油微藻为 Botryococcus braunii、 Crypthecodinium cohnii、 Chlorellaprotothecoides、 Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytrium Iimacinum 中的一禾中或多禾中。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于具体操作过程为，1)取细胞密度为IXIO7-I X IO8细胞/ml的菌体经液氮速冻的产油菌体研磨破碎 0. 5-30min至粉末状，刮取粉末装于离心管中，加入RNA提取缓冲液，菌体与RNA提取缓冲液体积比例为IOml l-2ml ；2)向离心管中加入玻璃珠间歇振荡，总的破碎时间为0.5-30min ；每IOml菌体加入 0. 5-1. 5g玻璃珠；3)向离心管中加入有机溶剂，充分混勻后0-4°C，12000-18000Xg离心5-lOmin ；有机溶剂的量为1/4-3/4RNA提取缓冲液体积；4)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入浓度为3M、pH为4.6的醋酸钠和体积比为25 24 1酸性苯酚/氯仿/异戊醇混合液，充分混勻0-4°C，12000-18000 Xg离心 5-15min ；按IOml菌体计，加入100 μ 1的醋酸钠和Iml混合液；5)取分层后的水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇混勻，置于0--70°C放置 5min-16h，然后 0-4°C，12000-18000X g 离心 5_15min 获得沉淀的 RNA。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于获得的RNA沉淀用70%的乙醇洗涤干燥后加入DEPC处理水溶解保存。
6.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于RNA提取缓冲液为内含4M异硫氰酸胍、0. 5wt%十二烷基肌氨酸钠、25mM柠檬酸钠、pH7. 0,0. 5wt%巯基乙醇的水溶液。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征还在于所述的玻璃珠振荡破碎方法为间歇振荡，每次振荡IOs-IOmin后置于冰上冷却0. 5-lOmin，总的破碎时间为0. 5-30min，玻璃珠直径为 0. 2-lmm。
8.按照权利要求1或4所述的方法，其特征还在于所述去除油脂的有机溶剂为氯仿、 二氯甲烷、石油醚或它们之间的任意比例混合。
全文摘要
本发明公开了一种从产油微生物中提取RNA的方法。该方法包括以下步骤产油微生物菌体采用液氮研磨和玻璃珠振荡相结合的方式进行细胞破碎，在细胞破碎液中加入有机溶剂去除油脂，加入酸性苯酚/氯仿/异戊醇除去蛋白，离心取水相加入异丙醇沉淀，最后经乙醇洗涤沉淀，真空干燥，可成功提取产油微生物RNA。本发明操作简单，成本低，完整性好。采用本方法获得的RNA，可以满足产油微生物分子生物学如Northern杂交、mRNA分离、RACE、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等方面的研究。
文档编号C12N15/10GK102250875SQ201010176579
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者唐伟, 张素芳, 谭海东 申请人:中国科学院大连化学物理研究所