专利名称：一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株通过离子束诱变选育得到的高溶剂产量和高丁醇比的丙酮丁醇梭杆菌菌株，以及该菌株的筛选方法和其在溶剂发酵工业中的应用，属于生物发酵技术领 域。
背景技术：
丁醇是重要的有机化工原料，广泛应用于油漆、表面涂料、皮革处理、塑料等领域。 作为燃料，丁醇具有能量密度大，对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在 能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。2005年我国丁醇表观消费 量已达到68万吨，预计2010年国内丁醇需求量将达到97. 2万吨。由于国内产量不能够满 足需要，我国已经是世界上最大的丁醇进口国。丁醇的生产方法主要有乙醛缩合法，丙烯羰基合成法和发酵法。乙醛缩合法工艺 流程长，收率低，成本较高，目前在国外已被淘汰；丙烯羰基合成法生产丁醇的原料为石化 下游产品丙烯；随着石油价格飞涨和资源加速枯竭，发酵法生产丁醇受到了广泛的重视，逐 渐成为生物能源的研究热点之一。近年来，国内对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、基因工 程改造、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。山西大学颜叙秀(山西食品工 业.1995，2 :26 28)采用紫外诱变处理，筛选到代谢产物提高、稳定性好的菌种，总 溶剂比出发菌提高约36% ；中国专利申请ZL95111733.5报道了通过化学诱变处理丙 酮丁醇梭杆菌，利用玉米粉或高粱为底物，发酵得到总溶剂产量在20g/L左右，丁醇比 为 70 % 的稳定菌株；Mermelstein 等(Biotechnology and Bioengineering. 1993,42 1053 1060)构建了含有乙酰乙酸脱羧酶、CoA转移酶A、CoA转移酶的质粒pFNK6，转化 Clostridiumnacetobutylicum ATCC 824 后，丙酮、丁醇和乙醇产量分别提高了 95%、37% 和90%;Kim等(Applied Environment Microbiology. 1994,60 :337 340)将Clostridium cellulorans的内切葡聚糖酶基因eng B导入Clostridium beijerinckii中，其内切葡 聚糖酶活力比原始菌种提高了 4倍，这对丙酮、丁醇发酵中纤维素的利用具有重要意义； Tomas φ (AppliedEnvironment Microbiology. 2003,69 4951 4965) M groESL 基因在Clostridiumacetobutylicum ATCC 824中过量表达，溶剂产量比野生型高40%。可见，菌种改良是提高丙酮-丁醇发酵经济竞争力的关键手段之一，而建立针对 诱变菌种高效准确的筛选条件是获得优良丙酮丁醇梭杆菌的重要环节之一。目前国内外仅 有2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选丙酮_ 丁醇产生菌的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于培育具有新的性能的丙酮丁醇菌株，使其够高 效利用木糖和淀粉，且发酵的溶剂产量和丁醇比高；本发明要解决的技术问题之二在于提 供所述丙酮丁醇菌株的新筛选方法；本发明要解决的技术问题之三在于提供所述丙酮丁醇菌株的用途。为了解决本发明的技术问题，本发明的技术方案在于一、本发明培育了一株新的丙酮丁醇梭杆菌菌株，其分类命名为丙酮丁醇梭杆菌 Clostridium acetobutylicum XY16，保藏号登记号为CCTCC NO :M 2010011。
二、本发明所述的丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16的筛选方 法，其特征在于将丙酮丁醇梭杆菌出发菌株离子束诱变后，利用木糖平板和2-脱氧-D-葡 萄糖平板筛选得到能够高效利用木糖和淀粉的丙酮丁醇菌株，再利用溴甲酚绿平板、刃天 青平板筛选得到产酸能力和还原力强的菌株，最后经摇瓶发酵筛选获得总溶剂产量和丁醇 比高的丙酮丁醇梭杆菌目标菌株。其具体步骤如下a)离子束诱变将丙酮丁醇梭杆菌原始菌株活化培养，培养温度30 40°C，250mL 摇瓶装液量100 150mL，石蜡液封2 5cm，培养时间12 18h，得到生长旺盛、菌体粗壮 的菌液，将培养的细胞稀释5 10倍，涂布于灭菌的空培养皿中，用无菌空气吹干；以5 15KeV作为离子注入的能量，以1. 0 2. OX 1016ions/cm2作为诱变剂量对菌株进行离子束 诱变；b)木糖平板筛选菌株经离子诱变后，用生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于 以0. 5 2%的木糖作为唯一碳源的平板上，在30 40°C温度下厌氧培养24 72h，挑选 出在该平板上能够生长的菌落；c) 2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选将步骤b)筛选出的突变株点植于含有0. 05 0. 2%的2-脱氧-D-葡萄糖的常规固体培养基平板上进行筛选，在30 40°C温度下厌氧培 养12 36h，挑选生长情况显著好于出发菌的菌落；d)溴甲酚绿平板筛选将步骤C)筛选的菌株接种于常规固体培养基平板上，30 40°C厌氧培养12 36h，无菌生理盐水制成浓度相同的菌悬液，加入到含有0. 001% 0. 01%的溴甲酚绿的常规固体培养基平板的孔洞中，在30 40°C温度下厌氧培养12 36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落；e)刃天青平板筛选将步骤d)筛选的菌株接种于常规固体培养基平板上，30 40°C厌氧培养12 36h，无菌生理盐水制成浓度相同的菌悬液，加入到含有0. 001% 0. 01%的刃天青平的常规固体培养基平板的孔洞中，在30 40°C温度下厌氧培养12 36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落；f)摇瓶发酵筛选将步骤e)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度 30 40°C，厌氧培养培养时间12 36h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5% 15% (ν/ ν)，发酵温度30 40°C，厌氧发酵发酵时间30 60h ；考察步骤d)和e)筛选出的菌落发 酵产总溶剂的量和溶剂中的丁醇比，同时选出总溶剂产量和丁醇比最高的菌落。在上述筛选方法中步骤a)中所述的离子诱变方法中，优选IOKeV作为离子注入 的能量，1.6X1016ions/cm2作为诱变剂量。在上述筛选方法中步骤c)、d)和e)所采用的常规固体培养基、碳源为木糖、淀粉 中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵 中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无 机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。
在上述筛选方法中步骤f)所采用的种子培养基和发酵培养基中，1)碳源为木 糖；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多 种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾 盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。或者2)种子培养基和发酵培养基为，20 80g/L玉米粉，煮沸后糊化0. 5 2h，补足挥发的水分，自然pH。三、本发明所述的丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16在发酵生 产丁醇中的应用，其具体过程如下平板培养将丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接种至平板培 养基厌氧培养，培养温度30 40°C，培养时间12 36h ；种子培养将平板培养的丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接 种到种子培养基中，培养温度30 40°C，250mL摇瓶装液量100 150mL，石蜡液封1 3cm，培养时间12 36h ；
发酵产丁醇将种子培养液热激1 5min，接种到发酵培养基中，接种量5% 15% (ν/ν)，发酵温度30 40°C，250mL摇瓶装液量100 150mL，石蜡液封1 3cm，发酵 培养时间为48 80h。其中，平板培养基、种子培养基和发酵培养基的组成为碳源为木糖；氮源为有机 或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合 物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷 酸盐、亚铁盐中的一种或多种，平板培养基中添加琼脂；或者，平板培养基、种子培养基和发酵培养基的组分为种子培养基和发酵培养基 为，20 80g/L玉米粉，煮沸后糊化0. 5 2h，补足挥发的水分，自然pH，平板培养基中添加 琼脂。本发明的有益效果在于本发明根据丙酮丁醇发酵代谢途径中先产酸后产溶剂及高活力厌氧发酵细胞具 有较强还原力的特点，采用离子束诱变丙酮丁醇梭杆菌，首次利用木糖平板、溴甲酚绿平板 和刃天青平板联合筛选高效利用木糖和淀粉，高溶剂产量和高丁醇比的发酵高产菌。利用 本发明的菌株和工艺进行发酵，以木糖作为唯一碳源，在5L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产 量分别达到了 17. 8g/L和12. 9g/L，而出发菌株无法以木糖为唯一碳源发酵生产丁醇；以玉 米粉为原料，在5L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 20. 2g/L和15. 9g/L，比出发 菌株提高了 66. 9%和114.9%，丁醇比达到了 78.7%，具有重大的社会意义和经济价值。
图1丙酮丁醇梭杆菌的离子注入存活率曲线本发明的微生物分类命名为丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16，其保藏日期为2010年1月15日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称 CCTCC，保藏编号为 CCTCC NO :M 2010011。
具体实施例方式实施例一
本实施例说明将丙酮丁醇梭杆菌原始菌株进行第一步离子束诱变的方法。丙酮丁醇梭杆菌原始菌株来源于自行筛选，具体方法如下1.用含有25g/L 丁醇的发酵筛选培养基对南京地区土壤样品中的耐丁醇微生物 进行富集培养，筛选出能够耐受25g/L 丁醇的菌株。将能够生长的样品管中的菌液在固体 平板培养基上划线，37 0C培养48h，获得单菌落。
其中，发酵筛选培养基丁醇1 %，酵母粉0. 2 %，蛋白胨0. 3 %，可溶性淀粉1 %，乙 酸铵0.2%，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚 铁 0. 01%，pH6。2.将初筛获得的单菌落挑至发酵筛选培养基中，37°C培养48h，检测发酵产物中 总溶剂和丁醇的产量，选取总溶剂和丁醇产量最高的菌株，作为诱变菌株。其中，摇瓶发酵筛选培养基玉米粉5% (固型物含量40 50% )，混勻，煮沸后 糊化lh，补足挥发水分，pH自然。丙酮丁醇梭杆菌原始菌株进行第一步离子束诱变的方法如下用将保藏的自行筛选获得的丙酮丁醇梭杆菌原始菌株活化培养，培养温度30 40°C,250mL摇瓶装液量100 150mL，石蜡液封2 5cm，培养时间12 18h，得到生长旺 盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD6tltl = 0. 05 0. 1，涂布于灭菌 的空培养皿中，无菌空气吹干；用IOKeV注入不同剂量，脉冲方式每次注入5s，间隔15s。 离子注入诱变后，将菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知， 1.6X1016ions/cm2是最佳的诱变剂量。实施例二本实例说明进一步筛选优良丙酮丁醇梭杆菌的方法。其中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)(1)固体平板培养基酵母粉0.2%，蛋白胨0.3%，可溶性淀粉1%，乙酸铵 0.2%,氯化钠0. 2 %，硫酸镁0. 3 %，磷酸二氢钾0. 1 %，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁 0. 01%，pH6。(2)木糖平板培养基玉米浆0. (固形物含量为40 50%)，木糖1%，乙酸 铵0. 2 %，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁 0. 01%，琼脂 1. 5%, pH5 7。(3) 2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1%， 乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水硫酸 亚铁0. 01%，琼脂1. 5%，2_脱氧-D-葡萄糖0. 1%，pH5 7。(4)溴甲酚绿平板培养基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1%，乙酸铵 0.2%,氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水硫酸亚铁 0. 01%，琼月旨1. 5%，溴甲酚绿0. 002%, pH5 7。(5)刃天青平板培养基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3 %，可溶性淀粉1 %，乙酸铵 0.2%,氯化钠0. 2 %，硫酸镁0. 3 %，磷酸二氢钾0. 1 %，磷酸氢二钾0. 1 %，七水硫酸亚铁 0. 01%，琼脂 1. 5%，刃天青 0. 002%, pH5 7。(6)种子培养基酵母粉1 %，蛋白胨1 %，可溶性淀粉4%，乙酸铵0. 2 %，氯化钠 0.2%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。
(7)摇瓶发酵筛选培养基I :玉米粉5% (固型物含量40 50%)，混勻，煮沸后 糊化lh，补足挥发水分，pH自然。(8)摇瓶发酵筛选培养基II 玉米浆0.8% (固型物含量40 50%)，木糖5%， 乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸 亚铁 0. 01%,琼脂 1. 5%，pH5 7。筛选步骤1、木糖平板筛选用生理盐水洗出经离子束诱变的菌株，稀释成不同浓度涂布于木糖平板上，在 37°C温度下厌氧培养48h挑选出15株可以在木糖平板上生长的菌株。2、2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选将木糖平板筛选出的15株突变株点植于2-脱氧-D-葡萄糖平板，放入37°C温度下厌氧培养24h，其中4株生长情况显著好于出发菌。3、溴甲酚绿平板和刃天青平板筛选溴甲酚绿平板筛选将2-脱氧-D葡萄糖平板筛选出的具有高淀粉酶活力的突 变株点植于固体培养基平板上，37°C厌氧培养12h，无菌生理盐水制成菌悬液，加入到含有 0.01%的溴甲酚绿的常规固体培养基平板的孔洞中，在37°C温度下厌氧培养24h，挑选出 变色圈明显大于出发菌的菌落；刃天青平板筛选将上述筛选得到的菌株接种于固体培养基平板上，37°C厌氧培 养12h，无菌生理盐水制成与上一步骤浓度相同的菌悬液，加入到含有0. 01 %的刃天青平 的常规固体培养基平板的孔洞中，在37°C温度下厌氧培养12h，挑选出变色圈明显大于出 发菌的菌落；最终菌株XY16和XYlO显示了较强的木糖和淀粉利用效率，产酸能力和还原活力。4、发酵摇瓶筛选将菌株XY16、XY10和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度37°C，250mL摇 瓶装液量lOOmL，石蜡液封2 5cm，培养时间12h。然后在发酵培养基中发酵，接种量10% (ν/ν)，发酵温度37°C，250mL摇瓶装液量IOOmL,石蜡液封2 5cm，发酵时间48h后检测各 菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示表 1
“~发酵时间总溶剂产量丁醇产量丁醇比
___(h)(g/L) (g/L) (%)
.出发菌株(培养基I ) 48 12l TA 63Λ~~ 「 j ΧΥ16(培养基 I) 48 15.7 11.1 70.7 L 」 XYlO (培养基 I ) 48 14.9 10.2 68.5 出发菌株(培养基II) 48 0 00
ΧΥ16(培养基 II) 48 12.8 8.6 67.1 ΧΥ10(培养基 II)_48_1^9_6.65 61经过平板组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均明 显高于出发菌株，其中ΧΥ16具有最高的溶剂和丁醇产量，丁醇比也最高。这与组合平板筛 选的结果一致。实施例三
本实施例说明突变株XY16和XYlO的传代稳定性。菌株XY16和XYlO传代发酵试验结果如表2所示表2 从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳 定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。实施例四本实施例说明丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16发酵生产丁醇 的工艺。本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)平板培养基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1 %，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。种子培养基玉米粉4%，煮沸后糊化1. 5h，补足挥发的水分，pH自然。发酵培养基玉米粉6%，煮沸后糊化1. 5h，补足挥发的水分，pH自然。将丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接种至平板培养基厌氧 培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的XY16接种到种子培养基中，培养温度 370C，250mL摇瓶装液量lOOmL，石蜡液封2 5cm，培养时间12h ；将种子培养液热激lmin， 接种到发酵培养基中，接种量10% (ν/ν)，发酵温度37°C，250mL摇瓶装液量IOOmL,石蜡液 封2 5cm，发酵培养12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，发酵培养72h后检测总溶剂 产量和丁醇产量分别达到了 18. 6g/L和13. 7g/L，比出发菌株提高了 53. 7%和85. 1%，丁醇 比达到了 73.6%。实施例五本实施例说明丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutyicum XY16发酵生产丁醇 的工艺。本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)平板培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1 %，乙酸铵0. 2 %，氯化钠 0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0. 1%，磷酸氢二钾0. 1%，7水硫酸亚铁0.01%，？!1 6。种子培养基酵母粉1%，蛋白胨1%，可溶性淀粉4%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。发酵培养基玉米浆1. 6 %，木糖8 %，乙酸铵0. 2 %，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%， 磷酸二氢钾0. 1 %，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。将丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接种至平板培养基厌氧培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的XY16接种到种子培养基中，培养温度370C，250mL摇瓶装液量lOOmL，石蜡液封2 5cm，培养时间12h。将种子培养液热激lmin， 接种到发酵培养基中，接种量10% (ν/ν)，发酵温度37°C，250mL摇瓶装液量IOOmL,石蜡液 封2 5cm，发酵培养12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，发酵培养72h后检测总溶剂 产量和丁醇产量分别达到了 16. 6g/L和11.7g/L，丁醇比达到了 70.5%。实施例六本实施例说明丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16发酵生产丁醇 的工艺。本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)平板培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1 %，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。种子培养基酵母粉1%，蛋白胨1%，可溶性淀粉4%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。发酵培养基木糖5%，玉米粉3. 5%，煮沸后糊化1. 5h，补足挥发的水分，pH自然。将丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接种至平板培养基厌氧 培养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的XY16接种到种子培养基中，培养温度 370C，250mL摇瓶装液量lOOmL，石蜡液封2 5cm，培养时间12h。将种子培养液热激lmin， 接种到发酵培养基中，接种量10% (ν/ν)，发酵温度37°C，250mL摇瓶装液量IOOmL,石蜡液 封2 5cm，发酵培养12h，添加0. 2%的乙酸和0. 3%的丁酸，发酵培养72h后检测总溶剂 产量和丁醇产量分别达到了 17. 2g/L和12. 3g/L，丁醇比达到了 71. 5%。实施例七本实施例说明丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16在5L发酵罐 中发酵生产丁醇的工艺。本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)平板培养基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1 %，乙酸铵0. 2%，氯化钠 0. 2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0. 1%，磷酸氢二钾0. 1%，7水硫酸亚铁0.01%，？!1 6。种子培养基玉米粉4%，煮沸后糊化1. 5h，补足挥发的水分，pH自然。发酵培养基玉米粉6%，煮沸后糊化1. 5h，补足挥发的水分，pH自然。将丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接种至平板培养基厌氧培 养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的XY16接种到种子培养基中，培养温度37°C， 250mL摇瓶装液量lOOmL，石蜡液封2 5cm，培养时间12h ；将种子培养液热激lmin，接种 到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量10% (ν/ν)，发酵温度37°C，发酵过程中连续 通入氮气，流速为0. 8L/min,发酵培养12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，发酵培养72h 后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 20. 2g/L和15. 9g/L，比出发菌株提高了 66. 9% ^P 114.9%, 丁醇比达到 7 78. 7 %0实施例八本实施例说明丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16在5L发酵罐 中发酵生产丁醇的工艺。本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)
平板培养基酵母粉0. 3 %，蛋白胨0. 5 %，可溶性淀粉10A，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。种子培养基酵母粉1%，蛋白胨1%，可溶性淀粉4%，乙酸铵0.2%，氯化钠 0.2%,硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。发酵培养基玉米浆1. 6 %，木糖8 %，乙酸铵0. 2 %，氯化钠0.2%，硫酸镁0.3%， 磷酸二氢钾0. 1 %，磷酸氢二钾0. 1 %，7水硫酸亚铁0. 01 %，pH6。将丙酮丁醇梭杆菌Clostridium acetobutylicum XY16接种至平板培养基厌氧培 养，培养温度37°C，培养时间12h。将平板培养的XY16接种到种子培养基中，培养温度37°C， 250mL摇瓶装液量lOOmL，石蜡液封2 5cm，培养时间 12h。将种子培养液热激lmin，接种 到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量10% (ν/ν)，发酵温度37°C，发酵过程中连续 通入氮气，流速为0. 8L/min,发酵培养12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，发酵培养72h 后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 17. 8g/L和12. 9g/L，丁醇比达到了 72. 5%。
权利要求
一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，其分类命名为Clostridium acetobutylicum XY16，其保藏号登记号为CCTCC NOM 2010011。
2.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭杆菌菌株的筛选方法，其特征在于将丙酮丁醇梭 杆菌出发菌株离子束诱变后，利用木糖平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选得到能够高效利 用木糖和淀粉的丙酮丁醇菌株，再利用溴甲酚绿平板、刃天青平板筛选得到产酸能力和还 原力强的菌株，最后经摇瓶发酵筛选获得总溶剂产量和丁醇比高的丙酮丁醇梭杆菌目标菌 株。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，具体的筛选步骤如下a)离子束诱变将丙酮丁醇梭杆菌原始菌株活化培养，培养温度30 4(TC，250mL摇 瓶装液量100 150mL，石蜡液封2 5cm，培养时间12 18h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌 液，将培养的细胞稀释5 10倍，涂布于灭菌的空培养皿中，用无菌空气吹干；以5 15KeV 作为离子注入的能量，以1. 0 2. OX 1016ions/cm2作为诱变剂量对菌株进行离子束诱变；b)木糖平板筛选菌株经离子诱变后，用生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于以 0. 5 2%的木糖作为唯一碳源的平板上，在30 40°C温度下厌氧培养24 72h，挑选出 在该平板上能够生长的菌落；c)2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选将步骤b)筛选出的突变株点植于含有0. 05 0. 2%的 2-脱氧-D-葡萄糖的常规固体培养基平板上进行筛选，在30 40°C温度下厌氧培养12 36h，挑选生长情况显著好于出发菌的菌落；d)溴甲酚绿平板筛选将步骤c)筛选的菌株接种于常规固体培养基平板上，30 40°C厌氧培养12 36h，无菌生理盐水制成浓度相同的菌悬液，加入到含有0. 001% 0. 01%的溴甲酚绿的常规固体培养基平板的孔洞中，在30 40°C温度下厌氧培养12 36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落；e)刃天青平板筛选将步骤d)筛选的菌株接种于常规固体培养基平板上，30 40°C 厌氧培养12 36h，无菌生理盐水制成浓度相同的菌悬液，加入到含有0. 001 % 0. 01 %的 刃天青平的常规固体培养基平板的孔洞中，在30 40°C温度下厌氧培养12 36h，挑选出 变色圈明显大于出发菌的菌落；f)摇瓶发酵筛选将步骤e)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度30 400C，厌氧培养培养时间12 36h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5% 15% (ν/ν)，发 酵温度30 40°C，厌氧发酵发酵时间30 60h ；考察步骤d)和e)筛选出的菌落发酵产总 溶剂的量和溶剂中的丁醇比，同时选出总溶剂产量和丁醇比最高的菌落。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于所述的步骤a)中离子诱变采用IOKeV 作为离子注入的能量，1.6X1016ions/cm2作为诱变剂量。
5.根据权利要求1所述的丙酮丁醇梭杆菌菌株在发酵生产丁醇中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的具体应用步骤如下1)平板培养将丙酮丁醇梭杆菌Clostridiumacetobutylicum XY16接种至平板培养 基厌氧培养，培养温度30 40°C，培养时间12 36h ；2)种子培养将平板培养的丙酮丁醇梭杆菌Clostridiumacetobutylicum XY16接种 到种子培养基中，培养温度30 40°C，250mL摇瓶装液量100 150mL，石蜡液封1 3cm， 培养时间12 36h ；3)发酵产丁醇将种子培养液热激1 5min，接种到发酵培养基中，接种量5% 15% (ν/ν)，发酵温度30 40°C，发酵培养时间为36 80h。
7. —种权利要求1所述的丙酮丁醇菌株在生产丁醇中的应用，其特征在于利用丙酮 丁醇菌株XY16发酵，总溶剂产量达到16 23g/L，丁醇比达到了 64 75%。
全文摘要
本发明涉及一株能快速利用木糖和淀粉发酵生产丁醇的丙酮丁醇梭杆菌及其筛选方法和用途。本发明公开了一种丙酮丁醇梭杆菌，分类命名为Clostridium acetobutylicumXY16，其保藏登记号为CCTCC NOM2010011。本发明通过离子束诱变，木糖平板、2-脱氧-D-葡萄糖平板、溴甲酚绿平板和刃天青平板筛选，得到的菌株能高效快速利用木糖和淀粉发酵生产丁醇，其总溶剂产量高、丁醇比高，重复性好，是一种适合工业生产的优良菌种。
文档编号C12R1/145GK101864389SQ20101017644
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者何冰芳, 吴斌, 姜岷, 柏中中, 欧阳平凯, 靳孝庆 申请人:南京工业大学