利用乙酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌菌株构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及构建利用己酸生产了二酸的重 组大肠杆菌菌株，W及通过己酸为主要原料利用该代谢工程大肠杆菌发酵合成了二酸。
【背景技术】
[0002] 了二酸，又名玻巧酸，是一种四碳二駿酸，广泛应用于农业、食品及医药行业。了 二酸是许多重要工业化学品的前体，包括已二酸，1，4- 了二醇，四氨巧喃，Ν-甲基化咯 焼丽，2-化咯焼丽，了二酸盐及Υ-了内醋。还可用于合成可生物降解的聚合物聚了二 酸了二醇醋（ΡΒ巧及聚醜胺聚合物（Ny虹故接X，4)。目前，商业用了二酸已经由液化 石油气或矿物油经化学合成生产，转变为生物发酵生产（Catal. Today (2014)，http:// dx. doi. org/10. 1016/j. cattod. 2014. 05. 035)，利用可再生资源通过生物发酵法生产 了二酸比石油炼制更具经济和社会效益，因此受到广泛关注巧nzyme and microbial technology, 2006, 39(3):352-361)。
[000引 了二酸生产菌株主要为产了二酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens,产了二酸方义线杆菌 Actinobacillus succinogenes,曼海姆产 了 二酸菌 Mannheimia succiniciproducens,重组大肠杆菌 Escherichia coli,酿酒 酵母 Saccharomyce scerevisiae (Met油 ling, 2010, 12(6) :518-525)，谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium glutami州m(PLoS One, 2013, 8(4):e60659)等。其中大肠杆菌由于基因 遗传背景清楚，基因操作简单，同时发酵底物多为可再生资源，如葡萄糖，木糖，甘油，麦草、 玉米枯杆等木质纤维素，木墓、菊芋等淀粉类物质，而更具有工业价值。
[0004] 利用重组大肠杆菌发酵了二酸的生产，大量工作针对葡萄糖的代谢途径改 造，包括在好氧和厌氧条件下葡萄糖到了二酸的代谢流引导。San等度iotechnol Bioeng, 2005, 90 化）：775-779)构建的大肠杆菌 HL27658k(pKK313)，阻断 TCA 循环，切除 副产物形成途径，解除己醒酸支路阻遏，实现葡萄糖好氧转化积累了二酸58. 3g/l，得率 为 0.94±0.07mol/mol 葡萄糖，生产强度为 1.08±0.06gAL.h)。Zhao 等（Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology, 2013, 40 (12) : 1461-1475)构建的大肠杆菌 E2- Δ S化-ppc-sucAB，阻断TCA循环和过表达磯酸帰醇式丙丽酸駿化酶、玻巧醜辅酶A合成 酶的改造下，在甘油基本盐培养基中，了二酸的最大体积生产速率和平均体积生产速率分 别为 19. 2 和 6. 55mM h 1。
[0005] 己酸主要由甲醇的撰基化制备，即甲醇和一氧化碳制备，是一种大量而廉价的碳 源，同时也是木质纤维素材料酸水解中形成的主要副产物之一。己酸是许多微生物厌氧代 谢的终产物和有氧代谢的不完全氧化产物，大肠杆菌可W好氧代谢己酸进行生长，并且W 己酸为唯一碳源好氧生长时，己醒酸支路和糖异生途径的关键酶活性会得到显著提高，有 利于随后进行葡萄糖到了二酸的厌氧转化（Applied and linvironmental Microbiology, 2 007, 73 (24) : 7837-7843.)。但是目前为止尚未有采用己酸作为碳源直接生物合成了二酸的 研究报道。本发明从增强底物摄取、阻断下游分解代谢和疏导代谢流等多方面对大肠杆菌 进行改造，使其能够直接利用己酸为碳源生产了二酸。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种利用己酸生产了二酸的代谢工程大肠杆菌菌 株的构建方法。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供一种代谢工程大肠杆菌菌株。
[0008] 本发明的第Η个目的在于提供一种代谢工程大肠杆菌菌株在生产了二酸中的应 用。
[0009] 本发明的第四个目的在于提供一种利用代谢工程大肠杆菌菌株生产了二酸的方 法。
[0010] 为实现W上目的，本发明公开W下技术方案；一种利用己酸生产了二酸的代谢工 程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，代谢工程改造的大肠杆菌使用己酸为原料发酵 生产了二酸，其改造途径为缺失了二酸脱氨酶复合物基因 W阻断TCA循环，并和/或缺失玻 巧醜CoA生成途径关键基因 W阻断了二酸利用途径，并和/或过表达己酸摄取基因、和/或 缺失己醒酸循环和TCA循环的调苄基因、和/或过表达己醒酸循环和TCA循环关键酶基因 W增强己酸摄取和草醜己酸供给，强化己醒酸循环，和/或减少苹果酸的脱駿反应W缺失 副产物生成途径，和/或减少从丙丽酸脱駿生产己酸引起的无效循环，和/或缺失乳酸和己 醇生产途径中关键基因 W疏导己醜CoA节点代谢流。
[0011] 作为一个优选方案，其改造途径为：至少包括 [001 引（1)缺失 sdMB
[0013] W及W下途径中的一种或几种：
[0014] 似缺失 sucABCD 和 / 或 fumC ;
[001引 （3)过表达acs和/或ackA ;
[001 引（4)缺失 iclR、fadR 和 / 或 arcA ;
[0017] (5)过表达 gltA 和 / 或 aceA 和 / 或 acnB ;
[001引 做缺失sfcA和/或maeB ;
[001 引（7)缺失 poxB;
[0020] 做缺失a化E和/或1化A。
[0021] 作为一个优选方案，其改造途径为；缺失sdhAB，缺失iclR和过表达gltA。
[002引作为一个优选方案，其改造途径为；缺失sdMB，缺失iclR，缺失maeB,过表达 gltA。
[0023] 作为一个优选方案，其改造途径为；缺失S化AB，缺失iclR，缺失maeB,过表达aceA 和过表达gltA。
[0024] 作为一个优选方案，其改造途径为；缺失sdhAB，缺失iclR，缺失maeB,过表达acs 和过表达gltA。
[002引作为一个优选方案，其改造途径为；缺失sdMB，缺失iclR，缺失maeB,过表达 aceA,过表达acs和过表达gltA。
[0026]为实现本发明第二个目的，本发明公开W下技术方案；利用上述构建方法得到的 代谢工程大肠杆菌菌株。
[0027] 为实现本发明第Η个目的，本发明公开W下技术方案；利用上述构建方法得到的 代谢工程大肠杆菌菌株在生产了二酸中的应用。
[002引为实现本发明第四个目的，本发明公开W下技术方案；一种利用上述代谢工程大 肠杆菌菌株生产了二酸的方法，其特征在于，利用W己酸为主要碳源的大肠杆菌常用培养 基，发酵权利要求3所述代谢工程大肠杆菌，得到了二酸。
[0029] 本发明构建高效利用己酸生产了二酸的代谢工程大肠杆菌，即根据已有信息对大 肠杆菌途径进行分析，利用基因工程手段对大肠杆菌基因进行改造，并对其代谢情况进行 分析，获得好氧条件下能够W己酸作为碳源生产了二酸的代谢工程大肠杆菌，并利用改造 后的代谢工程菌株W己酸为原料生产了二酸。
[0030] 本发明的方法；（1)采用分子生物学手段，对己酸摄取途径和己醒酸循环进行加 强，分别使用载体pTrc99a和地AD33表达己醒酸循环关键酶基因 gltA、aceA、acnB和己酸 摄取基因 acs和ackA ; (2)利用red基因重组技术获得基因 sdMB、iclR、a;rcA、ldM、sfcA、 111曰613、311。413〔0、9〇油、日化6、化(11?和加此等单缺失或组合缺失的宿主大肠杆菌；组合（1)和 (2)构建了二酸生产大肠杆菌。
[0031] 本发明是W野生型大肠杆菌或已有其他改造的菌株为出发菌株（实施例用的是 野生型菌株为出发菌株），一方面缺失了二酸脱氨酶复合物基因 sdhAB，阻断TCA循环W达 到积累了二酸的目的。己酸进入细胞后被转化为己醜辅酶A，己醜辅酶A通过TCA循环和 己醒酸循环两种途径被代谢。故而可W选择进一步缺失己醒酸循环和TCA循环的调苄基因 iclR、a;rcA，和或过表达aceA、gltA、acnB。缺失sfcA和maeB可W减少苹果酸的脱駿反应， 维持草醜己酸的供给。缺失poxB来减少从丙丽酸脱駿生产己酸引起的无效循环。同时，缺 失乳酸和己醇的副产物产生途径。本发明的另一方面是增强己酸利用途径的通量。己酸通 过己醜辅酶A合成酶和ack-pta两种途径被利用，研究过表达acs和ackA对大肠杆菌代谢 己酸的影响。
[0032] 本发明的优点在于；本发明通过对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对 大肠杆菌进行了改造，获得的菌株在W己酸为碳源的培养基中，能够产生了二酸，且没有副 产物产生。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，送些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.萨姆布鲁克（Joseph Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
[0034] 本发明通过代谢途径分析，为了加强己酸的利用，需要对己酸摄取途径进