苏云金芽胞杆菌菌株,表达蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及对稻飞虱农业害虫具 有高毒力的Bt菌株、杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质。
【背景技术】
[0002] 稻飞虱属同翅目飞虱科。危害水稻的主要有褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱三种。危 害较重的是褐飞虱和白背飞虱，早稻前期以白背飞虱为主，后期以褐飞虱为主；中晚稻以褐 飞虱为主。灰飞虱很少直接成灾，但能传播稻、麦、玉米等作物的病毒。
[0003] 稻飞虱长翅型成虫均能长距离迀飞，成虫和若虫均群集在稻丛下部茎杆上刺吸汁 液，遇惊扰即跳落水面或逃离，趋光性强，且喜趋嫩绿；但灰飞虱的趋光性稍弱。
[0004] 稻飞虱的越冬虫态和越冬区域因种类而异。褐飞虱在广西和广东南部至福建龙溪 以南地区，各虫态皆可越冬。冬暖年份，越冬的北限在北炜23°~26°，凡冬季再生稻和落 谷苗能存活的地区皆可安全越冬。在长江以南各省每年发生4~11代，部分地区世代重 叠。其田间盛发期均值水稻穗期。白背飞虱在广西至福建德化以南地区以卵在自生苗和游 草上越冬，越冬北限在北炜26°左右。在中国每年发生3~8代，为害单季中、晚稻和双季 早稻较重。灰飞虱在华北以若虫在杂草丛、稻粧或落叶下越冬，在浙江以若虫在麦田杂草 上越冬，在福建南部各虫态皆可越冬。华北地区每年发生4~5代，长江中、下游5~6代， 福建7~8代。田间为害期虽比白背飞虱迟，但仍以穗期为害最烈。
[0005] 稻飞虱对水稻的为害，除直接刺吸汁液，使生长受阻，严重时稻丛成团枯萎，甚至 全田死杆倒伏外，产卵也会刺伤植株，破坏输导组织，妨碍营养物质运输并传播病毒病。
[0006] 对于稻飞虱的防治，大多采用传统的化学防治方法，如毒死蜱、吡虫啉、马拉硫磷、 吡蚜酮、醚菊酯等，容易造成环境污染，和抗药性的产生。对于飞虱这类植食性刺吸式口器 害虫，目前并没有高效的杀虫蛋白用于生物防治以及转基因植物开发。
【发明内容】
[0007] 针对上述领域中的缺陷，本发明提供筛选到一株苏云金芽胞杆菌菌株，对稻飞虱 有较强的毒杀作用。
[0008] 同时本发明还提供该菌株中分离得到的有毒杀稻飞虱作用的杀虫蛋白。
[0009] 苏云金芽胞杆菌菌株IPPBI0TSUC-C9F1，其保藏编号为：CGMCC No. 10782。
[0010] 上述菌株在毒杀稻飞虱害虫中的应用。
[0011] 一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0012] 编码上述杀虫蛋白的基因。
[0013] 所述基因的核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示。
[0014] 所述杀虫蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用。
[0015] 所述应用为将杀虫蛋白作为杀虫活性成分制作杀虫剂对稻飞虱进行动杀灭。
[0016] 所述应用为将表达杀虫虱白的基因转入稻飞虱的寄主植物，使该植物表达对稻飞 虱害虫的抗性。
[0017] 所述害虫为灰飞虱。
[0018] 本实验选用灰飞虱作为杀虫活性菌株筛选对象，选取大量的Bt菌株进行筛选，得 出：菌株IPPBI0TSUC-C9F1对灰飞虱有较强的毒杀作用。
[0019] 从该菌株中得到一个1个基因的阳性克隆，分析结果证明所克隆的基因为新基 因，命名为T0XIN1，通过纯化，检测，得到该蛋白编码基因一共382氨基酸，如SEQ ID N0 :1 所示，分子量43358道尔顿；编码基因一共1149碱基，具体信息如下：
[0020] Composition421A；190C；182G；356T；00THER
[0021] Percentage: 37%A；17%C；16%G；31%T；0%OTHER
[0022] 该编码该蛋白的基因序列如SEQ ID NO :2所示。
[0023]将克隆得到的基因进行表达，蛋白功能验证死亡率达95%(蛋白浓度为25ppm)， 表明该蛋白对稻飞虱有较强的毒杀作用。
[0024] 菌株保藏信息：
[0025] 菌种分类命名：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis)
[0026] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027] 保藏日期：2015年5月6日
[0028]保藏编号：CGMCC No. 10782。 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】
[0029] 图1部分菌株SDS-PAGE结果，
[0030]Ml，高分子量 Marker ;M2?低分子量 Marker。
[0031] 图2, Rosetta菌株中诱导表达结果。
[0032] 其中M的分子量marker;1，空白对照（只含有pET28a空载体）可溶性组分；2，含 有杀虫基因载体（含有pET28a+Toxinl载体）的可溶性组分；3,空白对照不可溶性组分；4， 含有杀虫基因载体的不可溶性组分；箭头显示的是目标杀虫蛋白表达条带。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0034] 1、生测体系的建立与验证
[0035] 生测方法
[0036] 参照Fu等报道的生测方法，并加以改进。
[0037] 新的生测体系的建立在原有的生测体系的基础上，经过多点改进。首先，生测改用 透明PET塑料瓶（容积50mL，瓶高69mm，直径42mm)进行，并在其瓶身一侧开6mm直径的孔， 并于瓶内贴透气的医用胶带封住开孔，既能防止试虫逃逸又能为试虫的生长提供足量的空 气，解决了试虫意外死亡对生测结果的影响。其次，瓶盖与瓶身可分离，可以只用瓶盖完成 生测用饲料的准备。白色瓶盖，用直径30_开孔器打孔，将双层石蜡封口膜（parafilm M， USA)拉伸4倍后罩住开孔的盖子，添加200 y L人工饲料，再用拉伸的石蜡封口膜覆于人工 饲料上密封，制作成饲料囊。将需替换的饲料与瓶盖一同取下，更换新的即可。整个过程可 以分步骤进行，利于操作，减少试虫逃逸，极大的方便了生测实验的进行。最后，在瓶底加入 2%浓度的琼脂糖凝胶，可以维持瓶内对灰飞虱适宜的湿度，只要控温良好的培养箱皆可进 行灰飞虱的生测实验。
[0038] 每瓶放入试虫20头，每个处理重复3次。以黑布覆盖瓶身，将瓶口朝向光源，每隔 两天更换饲料。生测持续3-6d。
[0039] 人工饲料
[0040] 采用傅强等（2000)报道的，褐飞虱全纯人工饲料配方（表2-1)。
[0041] 表中⑴浓度大于0. 05mg/mL的组分直接用十万分之一天平称量；（ii)低 于0. 05mg/mL的组分配制10X母液；（iii)生物素，无机盐配制100X母液使用。用 Imol/LNaOH溶液将饲料溶液的pH值调至6. 8,容量瓶定容。最后将人工饲料用一次性的 Millipore微孔（0. 22ym)过滤器过滤除菌，分装在2mL离心管，储存在-20°C备用。饲料 配制所有试剂购自Amresco或Sigma-Aldrich。
[0042] 表2-1.生测用灰飞虱全纯人工饲料配方
[0043]
【主权项】
1. 苏云金芽胞杆菌菌株IPPBI0TSUC-C9F1，其保藏编号为：CGMCCNo. 10782。
2. 权利要求1所述的菌株在毒杀稻飞虱害虫中的应用。
3. 一种杀虫蛋白，其氣基酸序列如SEQIDNO:1所不。
4. 编码权利要求3所述的杀虫蛋白的基因。
5. 根据权利要求4所述的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
6. 权利要求3所述的杀虫蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，为将杀虫蛋白作为杀虫活性成分制作杀虫剂对稻飞虱 进行动杀灭。
8. 根据权利要求6所述的应用，所述应用为将表达杀虫虱白的基因转入稻飞虱的寄主 植物，使该植物表达对稻飞虱害虫的抗性。
9. 根据权利要求6所述的应用，所述害虫为灰飞虱。
【专利摘要】本发明涉及“苏云金芽胞杆菌菌株，表达蛋白及其应用”，属于生物防治技术领域。杀虫蛋白，具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。上述基因对稻飞虱害虫具有高毒力，可以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。CGMCC No.1078220150506
【IPC分类】C12N15-32, A01P7-04, C12N1-20, A01N47-44, A01N63-00, C12R1-07, C07K14-325
【公开号】CN104845914
【申请号】CN201510275530
【发明人】张 杰, 束长龙, 王杨, 林克剑, 刘永磊, 耿丽丽, 王桂荣, 宋福平, 彭琦
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月26日