专利名称：一种从白酒大曲中微生物总dna提取的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物总DNA提取的方法，特别涉及一种从白酒大曲中微生物总DNA提取的方法。
背景技术：
中国白酒大曲是生产白酒的糖化发酵剂，虽然前人已经在大曲微生物的分析方面作了大量的研究，但是以形态学和生理化指标为基础的细菌检测和分类方法较为复杂，而且所得出的结论难免与实际情况有所偏差。利用传统的实验室分离培养方法，由于环境的复杂性和培养条件的限制，认为能用现有技术培养的微生物仅占微生物总种类数的1%左右，并且传统的实验室分离培养方法不能及时反映出某一生态环境中细菌的构成和变化规律。目前，大分子16srRNA及其基因rDNA已被作为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。在基因水平上研究大曲微生物的关键之一是从大曲样品中高效的获得可进行分子操作的基因组DNA。由于大曲样品中所含的成分复杂，微生物种类巨大，从屮提取出高质量的微生物总DNA的难度较大。随着微生物生态学的发展，各种土壤样品中提取DNA的方法陆续建立起来，但是由于白酒大曲的特殊性，提取方法的探讨一直都存在一定的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种能从白酒大曲中提取有效用基因组的方法，对后续的利用分子生物学分析提供有效的模板。
为达到上述目的，本发明根据白酒大曲的特点，结合土壤中微生物总UNA的提取方法摸索出一种适用于大曲中提取总DNA的提取方法。
本方法不需纯化即可用于后续的一系列操作。此方法获得的总基因组片段大约为23kb;纯度为OD260/OD280=1. 762, 0D260/0D23(:'二1.587;为利用16s r隨分析等后续一系列的分子生物学技术操作打好基础，使得利用先进的分子生物学技术对大曲微生物的研究成为可能。
本发明的提供了一种从白酒大曲中微生物总DNA提取的方法，其特征在于在提取DNA之前对白酒大曲进行前处理，前处理包括如下步骤
(O取大曲，加入前处理液含0.05-0.2W/V。/。PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V%土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，其中大曲和前处理液的重量体积比为3-8: 25，振摇；
(2) 超声处理；
(3) 静置后低速离心；
(4) 取上清液，高速离心；
(5) 去除上清液沉淀加入0.05-0.2W/V。/。PVPP (交联聚乙烯基吡咯垸酮)的磷酸缓冲液；
(6) 打散后高速离心，去除上清液，得到样品。具体步骤包括对大曲进行前处理，能使细菌更好的从大曲颗粒里面分散出来。
前处理步骤(1)的处理液是含0. 1%W/V% PVPP(交联聚乙烯基吡咯垸酮)和4W/V%十温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，大曲和前处理液的重量体积比为5: 25。前处理步骤(2)超声处理的时间优选为6-7分钟。其中低速离心的转速优选为1000转/分钟。其中高速离心的转速优选为9000转/分钟。经过前处理的样品，从中提取DNA的步骤包括
A. 将样品用提取液提取，其中提取液的组成如下100mM Tris-HC](三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)plR 0、 100mM sodiura EDTA (乙二胺四乙酸二钠)pH8. 0、 L〔)0mM磷酸钠pH8. 0、 1.5M NaCl和1% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵);
B. 加入蛋白酶K和溶菌酶对微生物细胞进行裂解；
C. 加入等体积氯仿抽提一次、离心、收集水相；
D. 用异丙醇沉淀DNA。
其中使用的蛋白酶K的浓度优选10mg/Ml，酶反应温度为37°C，反应时水平摇动30m]'n(200rpm)，中间上下摇动一次；使用的溶菌酶的浓度为50rag/mL，摇完后加入l()ml 20%的SDS(加量是总体积的4%)， 65。C水浴保育2h，每15-20min，缓慢摇动一次，尽量打散，然后8000转室温离心10min，收集上清液，转到50m]离心管中。
步骤C是为了除去蛋白，以及多糖等杂质，本发明的方法只用氯仿抽提一次即可，节省时间，成本低。
本发明提取DNA的方法，优选还包括用70%冷乙醇冲洗所得沉淀的步骤。
本发明的方法，其中步骤D是用0.6倍体积的异丙醇沉淀，优选的沉淀温度是-2(TC，过
4夜沉淀。
可以从含有大量杂质的大曲样品中提取到一定纯度的片段，不经试剂盒纯化直接用于后续的分子生物学分析。可以对大曲中的各种细菌的总DNA无偏好的进行提取。采用本发明直接提取大曲样品中的总DNA进行鉴定，避免了在传统培养过程中的筛选和富集作用，能更直接真实地反应大曲样品中的微生物多样性及种群分布情况，较传统培养、分离和鉴定也更为简易、准确。
附图是0.8%琼脂糖的胶作出的电泳图，l一-白曲，2---黄曲，3-—混合曲，4-一黑曲，5—-母曲。结果表明本方法对不同大曲的微生物总DNA的提取效果均较好
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行具体说明，实施例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。
样品取自贵州仁怀金士酒业有限公司，且均为合格的成品大曲。实施例1
取5g大曲+25mL磷酸缓冲液(pH8.0)+().l。/。PVPP， +lmL 土温(80或60)摇床30min，超声6-7min，静置2-5min，，沉淀低速(1000rpm)离心5min ，取出上清，混合，高速(9000rpm)离心8min，去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP)， 25 mL，打散后高速离心(9000rpm) 8min,
去上清。
加15-25mL提取液(提取液成分是100福THs-HC1(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)p118. 0、lOOmM sodium KDTA (乙二胺四乙酸二钠)pH8. 0、 lOOmM磷酸钠pH8. 0、 1. NaCl和1% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵))，摇匀。加10mg/mL的蛋白酶K50ul， 37°C， 200rpm，水平摇动3()min，中间上下摇动一次；再加50rag/mL的溶菌酶lml，摇完后加入10ml 20%的SDS (加量是总体积的4%)， 6fTC水浴保育2h,每15-20min，缓慢摇动一次，尽量打散，然后8000转室温离心10min，收集上清液，转到50ral离心管中。加入相同体积的氯仿，离心收集水相，加0.6倍体积的异丙醇，-20。C沉淀过夜。12000转^C离心20min，收集沉淀，用7()%冷乙醇冲洗(洗后离心才能去上清液)，吹干，用]XTE悬浮，定容到20-40u]于-2CTC冰箱中保存备用。
实施例2
取3g大曲+25mL磷酸缓冲液(pH8.0)十0.05%PVPP， +lmL 土温-60摇床30min，超声6-7min，静置2-5min，沉淀低速(1000rpm)离心5min,取出上清，混合，高速(9000rpm)离心8min，去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP)， 25 mL,打散后高速离心(9000rpni) 8min，
去上清。
加入i5ra]的提取液(提取液成分是lO()mM THs-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH8. 0、 lOOmM sodi咖EDTA (乙二胺四乙酸二钠)pH8. 0、 lOOmM磷酸钠pH8. 0、 1. 5M NaCl.和WCTAB (十六烷基三甲基溴化铵))加10mg/mL的蛋白酵K 腦u丄,37。C， 2()0rpm，水平摇动30min，中间上下摇动一次；再加50mg/mL的溶菌酶lml,摇完后加入3ml 10%的SDS， 50。C水浴保育2h，每15-20min缓慢颠倒离心管混匀一次，然后6000r/min室温离心10min，收集上清液，沉淀用5ml提取液，漩涡10s, 65'C水浴保育10min，离心收集上清液转到50ml离心管中，合并两次的上清，加等体积的氯仿，离心收集水相，重复抽提次。加入0.6倍的异丙醇-20。C沉淀lh,然后14000r/min， 4'C离心20min,收集沉淀，用70%乙醇洗涤两次，去掉上清，冷风吹干，用TE缓冲液溶解后于-20'C冰箱中保存备用。实施例3
取8g大曲+25mL磷酸缓冲液(pH8.0)+ 0.2%PVPP ， +lmL 土温-80摇床30min,超声6-7min，
6静置2-5min，沉淀低速(1000rpm)离心5min ,取出上清，混合，高速(9000rpm)离心8min,去除上清，再加入磷酸缓冲液(PVPP), 25mL，打散后高速离心(9000rpm) 8min，去上清。称取5g大曲置于50ml的离心管中，加入15ml的提取液(提取液成分是lO()mM Tris-HC丄(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)PH8.0、 100mM sodi咖EDTA (乙二胺四乙酸二钠)pH8. 0、L00mM磷酸钠pH8. 0、 1. 5M NaCl和1% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵))加10mg/m,的蛋白酶K i(X)ul， 37°C, 200rpm,水平摇动30min，中间上下摇动一次；再加50mg/mL的溶菌酶lm],摇完后加入3ml i(W的SDS， 50'C水浴保育2h，每15-20min缓慢颠倒离心管混匀一次，然后6000r/min室温离心10min，收集上清液，沉淀用5tnl提取液，漩涡10s， 65'C水浴保育l()mJn，离心收集上清液转到50ml离心管中，合并两次的上清，加等体积的氯仿，离心收集水相，重复抽提1次。加入0.6倍的异丙醇-2(TC沉淀1 h，然后14000r/min， 4'C离心2()min，收集沉淀，用70%乙醇洗涤两次，去掉上清，冷风吹干，用TE缓冲液溶解后于-2(rC冰箱屮保存备用。
权利要求
1.一种从白酒大曲中微生物总DNA提取的方法，其特征在于在提取DNA之前对白酒大曲进行前处理，前处理包括如下步骤(1)取大曲，加入前处理液含0.05-0.2W/V％PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V％土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，其中大曲和前处理液的重量体积比为3-8∶25，振摇；(2)超声处理；(3)静置后低速离心；(4)取上清液，高速离心；(5)去除上清液沉淀加入0.05-0.2W/V％PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸缓冲液；(6)打散后高速离心，去除上清液，得到样品。
2. 如权利要求1的方法，其中前处理步骤(1)的处理液是含O. 1%W/V% PVPP (交联聚乙烯基吡咯烷酮)和4W/V。/。 土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，大曲和前处理液的重量体积比为5: 25。
3. 如权利要求2的方法，其中前处理步骤(2)超声处理的时间为6-7分钟。
4. 如权利要求3的方法，其中低速离心的转速是1000转/分钟。
5. 如权利要求4的方法，其中高速离心的转速是9000转/分钟。
6. 如权利要求l-5的方法，其中从样品中提取DM的步骤包括A. 将样品用提取液提取，其中提取液的组成如下100mM Tris-HC1 (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH8. 0、 lOOmM sodi咖EDTA (乙二胺四乙酸二钠)pH8. 0、 K)OmM磷酸钠pH8. 0、 1.5M NaC]和1% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)；B. 加入蛋白酶K和溶菌酶对微生物细胞进行裂解；C. 加入等体积氯仿抽提一次、离心、收集水相；D. 用异丙醇沉淀DNA。
7. 如权利要求6的方法，其中还包括用70W令乙醇冲洗沉淀的步骤。
8. 如权利要求7的方法，其中步骤D是用0.6倍体积的异丙醇沉淀。
9. 如权利要求8的方法，其中步骤D沉淀温度是-20'C。
10.如权利要求9的方法，其中步骤D沉淀过夜。
全文摘要
本发明涉及一种白酒大曲中微生物总DNA提取的方法，其特征在于在提取DNA之前对白酒大曲进行前处理，前处理包括如下步骤取大曲，加入前处理液含0.05-0.2W/V％PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V％土温-80或土温-60的磷酸缓冲液，pH8.0，其中大曲和前处理液的重量体积比为3-8∶25，振摇；超声处理；静置后低速离心；取上清液，高速离心；去除上清液沉淀加入0.05-0.2W/V％PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸缓冲液；打散后高速离心，去除上清液，得到样品。本发明的方法简便易行。
文档编号C12N15/10GK101684137SQ200810151830
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者张春辉, 李长文, 梁慧珍, 魏纪平 申请人:贵州仁怀茅台镇金士酒业有限公司