专利名称：微生物atp提取及检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及裂解细菌及其他微生物细胞以检测并定量ATP的组合物及方法。
背景区别活细胞与死细胞的特征之一是ATP的存在。因为ATP是广泛使用的生物发光检测系统的底物，所以它可以为细胞生活力或细胞污染提供替代标记。利用萤光素-萤光素酶系统从细胞中提取并检测ATP的方法是本领域已知的。然而，取决于细胞类型，提取并检测ATP的要求可能不同。具有其在结构上柔软的磷脂双层膜的体细胞可以很容易地用温和去污剂破坏以释放ATP。具有其较刚硬细胞壁的细菌、酵母和真菌提出了更大的挑战。
美国专利号4,303,752(Kolehmainen等人)描述了选择性测定来自活的体细胞和微生物细胞的核苷酸(例如ATP)的方法。Kolehmainen等人开发了使用各种离子和非离子型表面活性剂利用体细胞和微生物细胞的有差别的透性的多步骤方法。尽管发现体细胞在用非离子型去污剂例如乙氧基化烷基酚处理后释放ATP，但细菌细胞不受影响。这个观察提供了处理体细胞和细菌细胞混合群体的方法，其包括体细胞的乙氧基化烷基酚处理、洗掉被释放的体细胞ATP，并用包含乙氧基化季胺和乙氧基化胺的更苛刻的离子型表面活性剂混合物处理剩余的细胞(包含ATP的微生物细胞和缺乏ATP的体细胞)以释放微生物ATP。在最后一个步骤中，在生物发光测定中测量被释放的ATP。
近来，Wood等人(US 2003/0104507)公开了利用均质试剂组合物检测细胞中ATP的方法，所述组合物包含在单个步骤中从细胞中提取并检测ATP的所有组分。为无需牺牲萤光素酶即可保留ATP释放功能而专门配制的反应组分在经济和时间方面提供了重大进步。然而，所公开的方法对于微生物细胞不是最优的，因为其具有较刚硬的细胞壁。
与微生物所需较苛刻透化剂例如离子型去污剂使用相关的一个问题是它们能够灭活萤光素酶。这种试剂不相容性问题使得在最终萤光素酶/萤光素添加步骤之前需要额外的中和或稀释步骤以开始ATP检测，并且为单步骤ATP提取/检测试剂组合物开发设置了障碍。
考虑到与从微生物细胞中释放并检测ATP相关的困难，本领域需要改进的用于在微生物细胞中单步骤检测ATP的试剂组合物和方法。除了与从含有细胞壁的细胞中释放ATP相关的挑战之外，微生物细胞一般比体细胞小很多。这需要关于灵敏度的进一步提高。本发明提供了单步骤ATP检测方法对微生物细胞应用中的进展并且部分基于下述发现，即微生物细胞在其支持ATP释放及检测能力方面表现出意想不到的差异。
概述本发明涉及从微生物细胞中提取并检测ATP的试剂组合物及方法。本发明部分基于下述发现，即提取并检测ATP的反应条件在微生物细胞和体细胞之间和之中不同，并且试剂组合物可以配制为有利于从广泛多样的微生物细胞中有效地单步骤检测ATP。
在一方面，本发明包括试剂组合物，它包括反应缓冲剂、至少一种ATP提取剂、二价阳离子、二价阳离子螯合剂和/或萤光素酶/萤光素混合物，其中二价阳离子的浓度足够低或被阳离子螯合剂充分中和以减少二价阳离子对ATP提取的负面影响。在一个实施方案中，试剂组合物中二价阳离子螯合剂浓度和二价阳离子浓度之间的差异小于约5mM。在另一实施方案中，二价阳离子螯合剂浓度为二价阳离子浓度的至少一半。在二价阳离子浓度低(例如小于约5mM、2.5mM或1mM)的情况下二价阳离子螯合剂可以是不必要的。在一个特别优选的实施方案中，螯合剂浓度等于或大于二价阳离子浓度，二价阳离子为Mg2+，二价阳离子螯合剂为EDTA，并且至少一种ATP提取剂包括十六烷基三甲基溴化铵、氯己定及非离子型去污剂，例如Triton-X100。
在另一方面，本发明包括检测微生物细胞中ATP的方法，其中微生物样品与试剂组合物接触，所述试剂组合物包括反应缓冲剂、至少一种ATP提取剂、二价阳离子及二价阳离子螯合剂以形成混合物，其中二价阳离子的浓度足够低或被阳离子螯合剂充分中和以减少二价阳离子对ATP提取的负面影响，并且二价阳离子的水平足够用于后续萤光素酶介导的ATP检测步骤。混合物中二价阳离子螯合剂浓度与二价阳离子浓度之间的差异可以小于约5mM。可替代地，混合物中二价阳离子螯合剂浓度可以是二价阳离子浓度的至少一半，优选在浓度上相等或甚至更大。在二价阳离子浓度低(例如小于约5mM、2.5mM或1mM)的情况下二价阳离子螯合剂可以是不必要的。在一个优选实施方案中，该方法涉及检测微生物样品中ATP的方法，所述样品含有或怀疑含有革兰氏阴性微生物例如大肠杆菌(E.coli)。
在另一个方面，本发明包括鉴定适合于检测微生物样品中ATP的ATP提取剂的方法，其中向样品中加入包含二价阳离子、二价阳离子螯合剂、至少一种ATP提取剂、萤光素酶及萤光素酶底物的组合物以形成混合物；测量发光程度以鉴定适合于检测样品中ATP的试剂组合物。一般地，如果发光程度足以检测微生物样品中的ATP，则ATP提取剂适合于检测微生物来源中的ATP。在一个优选实施方案中，混合物中存在的二价阳离子浓度小于约0.5mM，更优选小于约0.1mM。微生物样品可以包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、古细菌(archaebacterium)、真菌等。
可替代地，微生物样品与包括二价阳离子、二价阳离子螯合剂、至少一种ATP提取剂及萤光素酶的试剂组合物接触以形成具有第一种二价阳离子浓度的第一种混合物；接触微生物样品以形成第二种混合物，它与第一种混合物的唯一不同在于第二种混合物中具有比第一种混合物中更高的二价阳离子浓度；并鉴定适合于释放并检测ATP的微生物ATP提取剂的浓度，其中第一种混合物中的发光比第二种混合物中的发光更强。
在另一个方面，本发明的微生物ATP提取/检测系统可以用于测试微生物细胞的生活力或基于其影响微生物细胞生活力和/或生长的能力鉴定药物学活性剂(例如抗生素药物候选物)或生物学活性剂。
附图简述
图1的图描绘在不同MgCl2浓度下铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(图1A)中ATP检测的动力学。在图1B中使用纯化的ATP作为对照。
图2的图描绘在低(-；0.2mM)和高(+；20.0mM)二价阳离子(MgCl2)浓度下不同ATP提取剂组合对铜绿假单胞菌中ATP检测的作用。
图3的图描绘了在各种微生物中(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、铜绿假单胞菌及蜡状芽孢杆菌(B.cereus))利用螯合剂中和抑制性二价阳离子的作用，以模仿在低二价阳离子浓度条件下所获得的较强发光。在t＝12分钟时向包含20mM MgCl2的反应混合物中加入CDTA(终浓度为20mM CDTA)。
图4的图描绘了在20mM二价阳离子(MgCl2)浓度的存在下渐增的螯合剂浓度(EDTA为0mM、22mM、23mM、24mM和25mM)对大肠杆菌(图4A)或铜绿假单胞菌(图4B)中ATP检测的影响。
图5的图描绘了在各种二价阳离子(MgCl2)浓度(0mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM)下不同细菌(大肠杆菌(图5A)、金黄色葡萄球菌(图5B)、铜绿假单胞菌(图5C)及蜡状芽孢杆菌(图5D)中ATP检测的动力学。
图6的图描绘了在低(0.2mM)和高(20mM)二价阳离子浓度下使用一组ATP提取剂在大肠杆菌(图6A、6B)或铜绿假单胞菌(图6C、6D)中ATP检测的动力学。在图6E、6F中使用纯化的ATP作为对照。
图7的图描绘了Mg2+(图7A)、Ca2+(图7B)和Mn2+(图7C)在低(0.2mM)和高(20mM)二价阳离子浓度下对铜绿假单胞菌中ATP提取及检测的作用。
图8的图描绘了在低(0.2mM)和高(20mM)二价阳离子浓度下利用重组萤火虫萤光素酶(而不是热稳定性萤光素酶)检测铜绿假单胞菌中的ATP。
图9的图描绘了在4种细菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及蜡状芽孢杆菌)中细菌细胞数目与发光之间的关联。
图10的图描绘了在微生物ATP测定中产生的发光信号的持续时间。
图11的图描绘了用于监控大肠杆菌生长的ATP检测的灵敏度。
图12的图描绘了在96孔板中在t＝5小时时作为减少的发光的函数筛选抗微生物的化合物。
图13的图描绘了作为抗生素剂量函数的细菌生长的生物发光检测。
详述
A.定义为了提供关于说明书和权利要求的清晰且一致的理解，提供了下述定义。除非另外定义，所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。除非另有说明，所有引用的专利和出版物都整体引入作为参考。
“分离的”或“纯化的”萤光素酶是已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的萤光素酶。
如本文所使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。样品是怀疑含有利用本发明分析的ATP的组合物。尽管样品通常已知为任选在生长培养基中或细胞裂解物中含有或怀疑含有细胞或细胞群体，但样品也可以是怀疑含有附着细胞或细胞群体的固体表面(例如拭子、膜、过滤器、微粒)。预期对于此类固体样品，通过使固体与本发明的试剂组合物或加入本发明试剂组合物的另一种水性溶液接触来制成水性样品。在某些情况下需要过滤以产生样品，例如在通过本发明方法测试液体或气体样品时。当样品取自大体积稀释气体或液体时，过滤是优选的。
术语“试剂组合物”在本文中用于指从样品中提取和/或检测ATP的一种或多种组分。试剂组合物可以包括足以从样品中提取和/或检测ATP的某些或全部组分。
如本文所使用的，术语“反应混合物”指含有ATP或怀疑含有ATP的样品与一种或多种试剂组合物接触后出现(或得到)的内容物，所述试剂组合物共同足以从样品中提取并检测ATP。
如本文所使用的，术语“检测”指在定量或定性确定样品内组分的存在或缺失。
如本文所使用的，术语“ATP提取剂”指改变细胞膜或细胞壁透性或破坏微生物来源的膜和/或细胞壁完整性(即，裂解或导致其中形成孔)以实现ATP提取或释放的任何化合物或化合物组合。一般地，ATP提取剂可以包括各种试剂，包括但不限于，抗生素，例如多粘菌素B(例如多粘菌素B1及多粘菌素B2)、多粘菌素β-九肽(PMBN)及氯己定(CHEX)；烷基葡糖苷或烷基硫代葡糖苷，例如辛基-β-D-1-硫代吡喃葡糖苷(参见整体引入本文作为参考的美国专利号6,174,704)；非离子型去污剂，例如Triton-X100(TX-100)；甜菜碱去污剂，例如羧丙基甜菜碱(CB-18)；季铵盐，例如三甲基十八烷基溴化铵(TMA-18)；鱼精蛋白；胺，例如三乙胺(TEA)及三乙醇胺(TeolA)；以及阳离子、抗细菌的、成孔、膜活性和/或细胞壁活性聚合物，例如聚赖氨酸、乳链菌肽、爪蟾抗菌肽、蜂毒素、磷脂酶A2、磷脂酶A2活化肽(PLAP)；噬菌体；等。参见，例如Morbe等人，Microbiol.Res.(1997)vol.152，pp.385-394。
术语“稳定信号”被定义为显示相对于萤光素酶反应开始时的发光每半小时的发光损失小于50％的发光信号。
术语“信噪比”(S∶N)通过等式S∶N ＝(样品发光平均值-背景平均值)/背景发光标准差进行定义。
本发明描述了用于检测并定量来自微生物细胞的ATP水平的试剂组合物及方法并且基于下述意想不到的发现，即从微生物细胞中释放并检测ATP的反应条件可以在后续发光检测步骤之前无需中和步骤而实现或者可以整合在所述后续步骤中。本发明公开了能够促进来自广泛范围的微生物细胞ATP的稳定发光检测的试剂组合物。进一步地，通过谨慎选择反应组分的适当组合，可以从事实上任何细菌或微生物细胞中获得有效的ATP单步骤释放。
B.镁反转效应在本发明的一个方面，本发明人已发现非最佳的二价阳离子浓度可以阻碍ATP从某些微生物细胞中有效释放和检测。一般地，萤光素酶介导的ATP检测方法利用具有与10-20mM一样多的二价阳离子浓度及约1-2mM二价阳离子螯合剂浓度的试剂组合物(参见，例如Wood等人，US 2003/0104507)。图1描述的实验证实了蜡状芽孢杆菌(图1A)和铜绿假单胞菌(图1B)的作为二价阳离子浓度函数的ATP检测动力学差异。尽管二价阳离子对于ATP检测是必需的，但来自这个实验的结果证明了一个令人惊讶的发现利用低于预期的二价阳离子量事实上可以获得微生物细胞中较好的发光。此外，本发明的发明人还吃惊地发现，通过用二价阳离子螯合剂例如EDTA减少试剂组合物或反应混合物中游离的二价阳离子(例如Mg2+)浓度可以选择性增强因使用某些ATP提取剂组合引起的生物发光(图2)。通过其中发现螯合剂化合物例如CDTA的添加激活发光的实验进一步支持了这种“镁反转效应”(图3)。本发明的发明人已进一步证明当使用比ATP提取/检测试剂组合物或反应混合物中存在的二价阳离子浓度更高的二价螯合剂(或仅使用含或不含螯合剂的较低二价阳离子量)时对于ATP提取和/或检测的意想不到的益处。通过最优化试剂组合物以利用这些观察，利用相同的试剂组合物可以从广泛多样的微生物来源中获得有效的ATP释放和检测。
尽管不希望受到理论束缚，但相信不同微生物的结构特征可以解释关于ATP释放的二价阳离子抑制性作用。例如，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁的不同在于其肽聚糖层的密度和组成以及外部脂双层膜的存在或不存在。革兰氏阳性细菌的细胞壁表现为宽的、致密的壁(20-80nm厚)，由众多互相连接的肽聚糖层组成，所述肽聚糖层构成60-90％的革兰氏阳性细胞壁。交织在细胞壁中的是磷壁酸和各种糖蛋白。与革兰氏阳性细胞壁形成对比，革兰氏阴性细胞壁包括包含2-3层含肽聚糖的内壁(2-3nm厚)，所述内壁仅构成10-20％的革兰氏阴性细胞壁，以及由磷脂、脂多糖(LPS)和蛋白质组成的外膜(约7nm厚)。革兰氏阴性细菌外膜中的LPS被认为以类似于革兰氏阳性细胞壁的糖蛋白和磷壁酸的方式增加外膜的强度。与细菌形成对比，酵母和真菌的细胞壁比细菌细胞壁更为坚固，其包含其他物质，例如几丁质，以保护其中脆弱的细胞膜。
革兰氏阴性细菌的外膜提供了由二价阳离子增强的屏障功能，所述二价阳离子稳定了邻近的LPS分子中带负电荷基团之间的静电排斥。(Nikaido，Outer Membrane，In Escherichia coli and Salmonella，″ASM Press，Washington D.C，pp.29-47)。屏障功能解释了某些抗生素化合物例如乙氧萘青霉素，一种疏水性青霉素的相对不渗透性。二价阳离子螯合剂EDTA和/或体积大的胺例如Tris的添加被认为抑制LPS分子之间的紧密结合。当利用本发明的ATP提取剂时，二价阳离子螯合剂例如EDTA或CDTA可以使外膜去稳定并且促进瞬间破裂及细胞组分(例如ATP)的释放。
因为二价阳离子一方面能够抑制ATP释放，所以它们是用于ATP检测的发光反应的必需组分。对于ATP检测中的最大灵敏度，二价阳离子特别是镁的浓度，一般以大于约10mM的浓度使用(参见图1B)。用于提取并检测包含微生物的样品中ATP的单步骤试剂组合物必须解决关于二价阳离子的这些相矛盾的要求。此外，本发明人还发现来自微生物的ATP的最佳提取和检测可以在试剂组合物加到样品中后10分钟内，优选在5分钟内快速实现。试剂组合物中使用的二价阳离子或阳离子螯合剂的最佳量的确定将取决于各种因素，包括但不限于，微生物的类型和结构；二价阳离子稳定细胞壁和/或细胞膜组分的程度；微生物样品中已经存在的ATP、阳离子和/或阳离子螯合剂的量；以及试剂组合物或反应混合物中的萤光素酶的量或稳定性。
C.试剂组合物1.ATP提取剂本发明的一个方面包括使用一种或多种ATP提取剂以促进ATP从微生物细胞中的释放。微生物ATP提取剂可以包括能够透化微生物细胞壁和/或膜以促进ATP释放的各种试剂，包括但不限于，抗生素，例如多粘菌素B(例如多粘菌素B1及多粘菌素B2)、多粘菌素β-九肽(PMBN)及氯己定(CHEX)；烷基葡糖苷或烷基硫代葡糖苷，例如辛基-β-D-1-硫代吡喃葡糖苷(参见整体引入本文作为参考的美国专利号6,174,704)；非离子型去污剂，例如非离子型乙氧基化烷基酚，包括但不限于乙氧基化辛基酚Triton X-100(TX-100)及其他乙氧基化烷基酚；甜菜碱去污剂，例如羧丙基甜菜碱(CB-18)；季铵盐，例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；三甲基十八烷基溴化铵(TMA-18)；鱼精蛋白；胺，例如三乙胺(TEA)及三乙醇胺(TeolA)；以及阳离子、抗细菌的、成孔、膜活性和/或细胞壁活性聚合物，例如聚赖氨酸、乳链菌肽、爪蟾抗菌素、蜂毒素、磷脂酶A2、磷脂酶A2活化肽(PLAP)；噬菌体；等。参见例如，公开了离子型表面活性化合物的Morbe等人，Microbiol.Res.(1997)vol.152，pp.385-394，以及美国专利号4,303,752，所述文献及专利整体引入本文作为参考。
优先选择不灭活本发明萤光素酶的ATP提取剂。对于需要较苛刻试剂(例如离子型去污剂等)释放ATP的微生物，在这些试剂的存在下显示增强的稳定性的改良萤光素酶是特别优选的，例如U.S.2003/0104507中所公开的那些，其完整内容据此整体引入作为参考。
在本发明的一个实施方案中，ATP提取剂包括季铵盐CTAB。在优选实施方案中，试剂组合物中存在的CTAB浓度为约0.04％-0.15％(w/v)。在另一实施方案中，ATP提取剂可以包括CHEX和乙氧基化烷基酚，例如Triton X-100。在优选实施方案中，CHEX优选为约0.04％-0.16％(w/v)并且存在的乙氧基化烷基酚为约0.25％-1.0％(w/v)。在特别优选的实施方案中，试剂组合物可以包括超过一种的ATP提取剂。一个优选实施方案包括CHEX(约0.04％-0.16％(w/v))；乙氧基化烷基酚，例如Triton X-100(约0.25％-1.0％(w/v))；以及季铵盐，例如CTAB(约0.02％-0.08％(w/v))。
可完全预期在本发明方法中起作用的最优选浓度或浓度范围将因不同微生物并因不同的ATP提取剂而不同，并且可以利用主题应用中所述的或本领域技术人员通常已知的方法以经验为主进行确定。
2.二价阳离子甲虫萤光素酶-萤光素反应不仅取决于ATP，还取决于二价阳离子。因此，一般供应二价阳离子(除非样品中已经存在)以提高萤光素酶的活性。二价阳离子包括镁、钙和锰。二价阳离子可以作为盐或卤化物来供应，例如硫酸盐、磺酸盐、葡糖酸盐、碳酸盐、氯化物和溴化物。例如镁离子可以作为氯化镁、硫酸镁、葡糖酸镁、乙酸镁、溴化镁、碳酸镁等供应。优选地，二价阳离子选自镁的氯化物或硫酸盐。
因为某些细胞膜或壁的透性可以受二价阳离子存在的负面影响，所以对于给定的微生物或给定的提取/检测系统可以以经验为主配制二价阳离子浓度以提供例如ATP细胞释放和ATP检测之间的正确平衡。
进一步地，鉴于二价阳离子螯合剂具有中和二价阳离子对ATP提取的负面作用的能力，二价阳离子浓度可以根据试剂组合物或反应混合物中存在的二价阳离子螯合剂水平进行调整。当二价阳离子螯合剂低时(例如小于约5mM、2.5mM或1mM)，二价阳离子浓度将相应更低，优选小于2.5mM，更优选为0.2-1mM。然而，当二价阳离子螯合剂较高时(例如2-20mM)，二价阳离子浓度将相应更高，其浓度优选小于或等于二价阳离子螯合剂浓度。
3.二价阳离子螯合剂二价阳离子螯合剂包括，但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和1，2-环己二次氮基四乙酸(CDTA)、氨三乙酸(NTA)、柠檬酸、葡糖酸钠、葡糖酸、木质素磺酸盐(lignosulfonate)的盐及其混合物。优选地，螯合剂选自EDTA、EGTA和CDTA，因为它们一般可得到并且相对低成本。二价阳离子螯合剂的合适水平可以以经验为主进行确定，其中基于提供的水平足够中和二价阳离子对ATP提取的负面作用，但不到其阻止阳离子依赖性的、萤光素酶催化的ATP检测的程度。
一般地，螯合剂浓度为二价阳离子浓度的至少约50％，优选为二价阳离子浓度的约60％、70％、80％、90％或95％。更优选地，螯合剂浓度约等于或大于二价阳离子浓度。在一个特别优选的实施方案中，螯合剂浓度为约20-25mM。在二价阳离子浓度低(例如小于约5mM、2.5mM或1mM)的情况下二价阳离子螯合剂可以是不必要的。
然而，本领域技术人员将认识到，取决于pH，不同的螯合剂可以具有不同的螯合能力。因此，本发明的外部参数包括关于与提供螯合剂能力相称的螯合剂的螯合剂浓度的可变性程度，所述螯合剂能力在其他方面相同的萤光素酶测定反应条件下(例如pH7.0-8.0等)相当于EDTA的螯合能力。换言之，二价阳离子螯合剂的量可以被调整为在其他方面相同的单步骤ATP反应条件下(除了二价螯合剂外，所有其他的试剂和试剂浓度均相同)提供相当于或超过EDTA的螯合能力，或者可以被调整为足够分别平衡二价阳离子对ATP提取和检测的负面及正面作用的量。
4.萤光素酶/萤光素在其最基本的水平上，萤光素酶根据其产生发光的能力进行定义。更具体而言，萤光素酶催化底物萤光素氧化从而产生氧化萤光素和光子。其催化产物包括光的萤光素酶提供灵敏度、可检测的产物以及ATP的容易的测量。任何ATP依赖性产生发光的酶均可考虑用于本发明的试剂组合物和方法中。
迄今为止，已经鉴定出至少5类萤光素酶(Jones等人，1999；Thomson等人，1997)。在这些中，甲虫萤光素酶，例如普通萤火虫(萤科(Lampyridae))的那种，形成具有独特进化来源的特殊种类(McElroy等人，1969；White等人，1969；White等人，1975)。甲虫萤光素酶在文献中通常被称为萤火虫萤光素酶；然而，萤火虫萤光素酶实际上是甲虫萤光素酶类的亚类。甲虫萤光素酶可以从甲虫自身的灯笼(lantern)或本领域众所周知的蛋白质表达系统中进行纯化(Baldwin和Green，2000；Beny和Dolivo，1976；Branchini等人，1980；Filippova等人，1989)。
催化ATP依赖性反应并产生发光的所有萤光素酶、萤光素酶变体、萤光素酶片段及变异的萤光素酶片段均可考虑用于本发明，包括但不限于U.S.2003/0104507中所公开的那些，所述专利的完整内容据此整体引入作为参考。甲虫萤光素酶，特别是来自北美萤火虫Photinuspyralis的萤火虫萤光素酶，是本领域众所周知的。P.pyralis萤光素酶(LucPpy)由Mr为61kDa的大约550个氨基酸组成，所述分子量由基因的核苷酸序列编码的蛋白质计算出来。与本发明一致的其他萤火虫萤光素酶包括Photuris pennsylvanica萤火虫萤光素酶(LucPpe2；545个氨基酸残基；GenBank 2190534，(Ye等人，1997)，以及U.S.2003/0104507中所公开的各种突变的萤光素酶，它们来源于LucPpe2(例如LucPpe2m78(也称为78-0B10)；LucPpe2m90(也称为90-1B5)；LucPpe2m133(也称为133-1B2)；LucPpe2m146(也称为146-1H2)；以及各种商业上可获得的萤光素酶，例如UltraGloTMLuciferase(Promega)。LucPpe2m78、LucPpe2m90、LucPpe2m133和LucPpe2m146的制备方法公开于U.S.2003/0104507中，并据此整体引入作为参考。
本发明中一般使用被分离的和/或纯化的萤光素酶。来源于其天然环境、能够干扰诊断或治疗用途的污染组分可以包括酶、激素及其他蛋白质性质或非蛋白质性质的材料。确定纯度的技术之一是在非还原或还原条件下利用考马斯蓝或银染色应用SDS-PAGE分析。萤光素酶可以从天然产生萤光素酶的来源或从表达外源性编码萤光素酶的多核苷酸的重组细胞中分离。生产和/或纯化萤光素酶的技术是本领域技术人员众所周知的。
甲虫萤光素酶天然存在的底物是萤火虫萤光素，一种polytherocyclic有机酸，D-(-)-2-(6′-羟基-2′-苯并噻唑基)-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(萤光素)。萤光素可以从自然界(例如从萤火虫)中分离或合成。合成萤光素可以具有与天然存在的萤光素一样的结构或者可以是变体或衍生化，只要其功能类似(Bowie等人，1973；Branchini，2000；Craig等人，1991；Miska和Geiger，1987；Yang和Thomason，1993)。在本发明中使用的示例性萤光素衍生物包括，但不限于，6-脱氧氨基萤光素(deoxyaminoluciferin)、D-萤光素甲酯、D-萤光素基(luciferyl)-L-苯丙氨酸、D-萤光素基-L-N α-精氨酸、D-萤光素-O-硫酸盐和D-萤光素-O-磷酸盐(Miska和Geiger，1987)、被水解或通过酯酶作用产生样品中的组分萤光素的萤光素酶的酯(Craig等人，1991；Yang和Thomason，1993)。有用的萤光素类似物的其他实例包括萘基-和喹啉基萤光素，它们分别发出绿色和红色光谱中的光(Branchini等人，1989)。萤光素有多种商业来源(例如Promega Corp.Madison，WI；Molecular Probes，Eugene，OR)。
产生来自萤光素酶-萤光素反应的发光信号的甲虫萤光素酶催化的反应需要萤光素酶、萤光素、腺苷三磷酸(ATP)、镁(或其他二价阳离子)及分子氧。在反应开始时，萤光素与ATP反应形成萤光素基腺苷酸，其中伴随无机焦磷酸的去除。萤光素基腺苷酸仍然与萤光素酶的催化位点紧密结合。当这种形式的酶暴露于分子氧时，酶结合的萤光素基腺苷酸被氧化以产生电子激发态的氧化萤光素。激活的氧化萤光素在回复基态时发光 ATP类似物(例如dATP)也能够进行上述反应。此外，其他二价阳离子可以取代上述反应中的镁(例如Mn2+或Ca2+)。因为氧是反应的反应剂，所以反应在无氧条件下不能进行。然而，一般无需提供超过空气中存在的氧。反应可以在密闭容器内发生，前提是反应溶液中存在足够的氧。
大多数萤光素酶-萤光素反应产生生命短暂的闪光。然而，优选用于本发明的某些萤光素酶，例如LucPpe2m146和LucPpe2m90萤光素酶，在本发明的条件下产生“发光型”发光信号，在试剂组合物与样品组合形成混合物后所述发光信号具有每小时少于50％的发光损失。本发明范围内的优选的萤光素酶、萤光素酶变体、萤光素酶片段及变异的萤光素酶片段包括在试剂组合物的环境中能够保持其稳定性并且当在相同试剂组合物的背景中时，保留其产生稳定发光能力的那些。
为了促进萤光素酶催化反应的完成，萤光素酶的底物例如萤光素可以包括在试剂组合物中。本发明范围内的某些实施方案可以不含萤光素并且允许使用者提供他/她选择的萤光素；可替代地，萤光素可以分开提供以加到其他反应组分中。所提供的萤光素类型可以不同，但它必须是在给定应用中使用的特定萤光素酶的底物。
产生均质的、单步骤提取及检测试剂组合物的能力无需依赖于萤光素酶的化学或热稳定性，因为天然的酶也可以在此类组合物中发挥作用。然而，优选使用热稳定性萤光素酶，因为它们较不易受制剂中其他组分例如ATP提取剂影响而损失活性，并且可以提供更大的选择性和/或灵敏度以及与更广泛的反应条件范围(即环境的和/或更高的温度)的相容性。类似地，在化合物或条件的存在下“化学稳定性萤光素酶”能较好地保留活性或增加灵敏度和/或性能程度上(相比较于例如野生型酶)，它们将是优选的。
在本发明的试剂组合物、混合物或方法中使用的优选萤光素酶产生稳定信号，即此类萤光素酶当在萤光素酶反应中使用时产生持续时间增加的发光，所述发光定义为相对于萤光素酶反应开始时的发光每半小时少于50％的发光损失。优选的萤光素酶包括维持至少约30％(优选至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)酶活性至少1小时，优选至少2小时、再更优选至少4小时(如通过发光测得)的那些。
5.ATP酶抑制剂或ATP代谢抑制剂微生物细胞可以包括能够随着时间推移歪曲细胞中存在的ATP量的物质。这可以是由于存在ATP酶、ATP酶抑制剂和/或ATP生成性酶的抑制剂。因为ATP浓度在特定时间上进行确定，所以与ATP产生或丧失相关的不恰当的活性，如果未加抑制，可以导致微生物细胞中存在的ATP浓度的过高估计。
为了精确测量样品中的ATP水平，优选抑制能够降解微生物ATP池或不恰当地产生ATP新来源的酶。无法掺入适当的抑制剂可以导致ATP浓度的不准确测定。示例性ATP酶抑制剂包括本发明的ATP提取剂(例如CTAB)、阳离子或非离子型去污剂，或U.S.2003/0104507中所公开的任何一种ATP酶抑制剂。抑制剂例如DTAB可以灭活某些ATP酶，而其他分子例如氟化钠(NaF)可以灭活磷酸酶，所述磷酸酶影响参与ATP代谢调节的微生物激酶的活性。
ATP生成性酶的示例性抑制剂可以包括如U.S.2003/0104507中所公开的激酶或磷酸酶抑制剂(例如NaF)。在优选实施方案中，本发明的试剂组合物可以包括的NaF浓度为至少约0.2mM，优选至少约1mM，更优选至少约2mM。ATP生成性酶的其他抑制剂可以包括其他激酶抑制剂，例如钒酸盐、AMP、DAPP(Bostick等人，1982)以及二氯乙酸(Kiechle等人，1980)。
利用抑制剂阻止ATP不恰当产生或丧失在高通量应用中可以是特别有用的，其中许多样品板必须在延长的时间段内阅读，从而为样品中存在的原始ATP水平歪曲提供了更大的机会。
6.缓冲剂恰当的缓冲剂的选择取决于pH缓冲能力及与萤光素酶-萤光素反应的相互作用。维持适合于工作溶液的pH并且不干扰萤光素酶-萤光素反应的任何缓冲剂均是预期的。优选的pH范围为约pH4.5-约pH9.0，更优选约pH6.0-约pH8.0。除MES和柠檬酸盐缓冲剂之外，一般的缓冲剂可以包括磷酸缓冲盐水(PBS)、Tris、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、硼酸盐及本领域技术人员已知的任何其他缓冲剂均可以是适合的。一般的缓冲剂可以包括用于维持适当pH和离子强度的三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、HEPPS、HEPES、MOPS、Tris、甘氨酰甘氨酸及磷酸盐。优选的缓冲剂浓度可以为约50mM-200mM。
7.消泡剂需要消泡剂以阻止由于发沫引起的样品损失和/或样品交叉污染。消泡剂的添加还可以促进制备或使用过程中产品的分配。适当的消泡剂包括以商品名MAZU(PPG Industries，Gurnee，IL)可获得的那些并且可以是有机的或基于硅氧烷的。消泡剂的选择可以取决于其消除泡沫而不干扰萤光素酶-萤光素反应的能力。
8.其他试剂试剂组合物还可包括稳定剂或挥发性控制试剂。稳定剂或挥发性控制试剂可以是稳定萤光素酶不被降解和/或帮助萤光素酶和/或萤光素冻干的任何化合物。适当的酶稳定剂包括，但不限于，牛血清清蛋白(BSA)；BSA取代物，例如Prionex(Pentapharm，Ltd.，BaselSwitzerland)；明胶；及去污剂(优选非离子型去污剂，最优选THESIT)。
本发明的试剂组合物还可包括已知增加发光持续时间(延长检测半衰期)的物质，包括但不限于，焦磷酸钠(NaPPI；例如约25mM)；辅酶A(CoA)；硫醇试剂，例如二硫苏糖醇和β巯基乙醇(Wood，US 5,283,179，1994；Wood，US 5,650,289，1997)；金属离子螯合剂(除其在ATP提取/检测中的用途外)或蛋白酶抑制剂(Scheirer，US5,618,682，1997；Scheirer，US 5,866,348，1999)；或高浓度的盐(VanLune和Trer Wiel，WO 00/18953，2000)。
D.提取并检测微生物细胞中ATP的方法本发明的方法、组合物和试剂盒提供了微生物样品中ATP(或者可以作为萤光素酶底物起作用的ATP类似物)的简单定性或定量检测。一般地，证实样品中发光的简单定性实验指示ATP的存在。
在一个方面，本发明包括检测微生物细胞中ATP的方法，其中微生物样品与包含反应缓冲剂、至少一种微生物ATP提取剂、二价阳离子及二价阳离子螯合剂的试剂组合物接触，其中二价阳离子螯合剂浓度与二价阳离子浓度的差异小于约5mM。可替代地，试剂组合物或反应混合物中的二价阳离子螯合剂浓度可以是二价阳离子浓度的至少一半，优选相等或甚至更高。然而，在二价阳离子浓度低(例如小于约5mM、2.5mM或1mM)的情况下二价阳离子螯合剂可以是不必要的。优选地，可检测的发光信号在微生物样品与试剂组合物接触后5或10分钟内产生。基本上，本公开内容中描述的任何试剂组合物均预期用于本发明方法中。
微生物样品与试剂组合物的接触促进ATP从微生物细胞中的提取或释放，以用于与试剂组合物中存在的适当生物发光试剂反应，从而产生易于检测的生物发光信号。微生物样品可以组成纯化的微生物样品、微生物细胞的混合群体或怀疑含有微生物细胞的来源材料。在一个优选实施方案中，本发明涉及从大肠杆菌或从怀疑含有大肠杆菌的微生物来源的材料中提取并检测ATP的方法。
适当的发光信号可以利用试剂组合物产生，所述试剂组合物包含例如至少一种ATP提取剂，例如阳离子或非阳离子型去污剂；二价阳离子，例如镁；二价阳离子螯合剂，例如EDTA；萤光素酶来源，例如LucPpe2m78、LucPpe2m90、LucPpe2m133或LucPpe2m146；以及一种或多种萤光素酶底物，例如萤光素(它可以由冻干制剂或其他适当的萤光素类似物底物重构)。试剂组合物可以另外包括一种或多种ATP生成性酶的抑制剂、酶稳定剂、消泡剂等。
1.微生物细胞来源在一个方面，本发明提供了提取并检测微生物样品或怀疑含有微生物样品例如细菌、酵母或其他真菌的样品中ATP的方法。存在适合于根据本发明使用的各种微生物来源，包括但不限于，真细菌(革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌)、古细菌、酵母或真菌。例如，已发现本发明的试剂组合物对各种不同的微生物生物起作用，所述微生物生物包括但不限于，革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、海床黄杆菌(Flavobacterium okeanokoites)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)及蜃楼弗朗西丝氏菌(Francisella philomiragia)；革兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌、藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)；以及真核微生物，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色假丝酵母(Candida albicans)。在一个优选实施方案中，样品含有或怀疑含有大肠杆菌或铜绿假单胞菌。尽管本发明的方法可以与含有任意量ATP的样品一起使用，但优选使用含有非饱和量ATP的样品(即，发光与ATP浓度成线性比例的范围)。
微生物样品可以是怀疑含有微生物的任何事物，例如细胞裂解物、完整细胞、活组织检查、食物、饮料、擦拭例如动物、植物或无生命物体表面的拭子等。对照样品可以包括已知ATP浓度以产生促进样品中ATP水平定量测定的标准曲线。
细胞裂解物包括不再组织成可识别的完整细胞结构的细胞组分。细胞裂解物可以含有可溶和不可溶组分，其中的每一种均可以在使用裂解物之前去除。裂解物可以通过任何方式进行制备，包括利用超声处理、匀浆器(dounce)、研钵和研杵、冻融循环或破坏细胞物理完整性的任何其他装置或方法的物理破裂；或通过去污剂裂解，例如其中LucPpe2m146保留活性的那些，例如两性离子和非离子型去污剂或阳离子去污剂DTAB或CTAB。优选地，细胞裂解物以此类在收集细胞的同时保持ATP浓度完整性的方式产生。
2.ATP提取从微生物来源中有效提取或释放ATP可以取决于微生物来源呈现的结构限制。当二价阳离子的水平足以促进生物发光检测ATP时，这些情况可能需要平衡二价螯合剂化合物的量以反转二价阳离子介导的稳定作用。用于提取并检测ATP的适当ATP提取剂的选择可以以经验为主针对给定的微生物来源进行确定。优选地，这些化合物的选择将以关于根据本发明的单步骤提取和ATP检测的ATP有效提取及ATP检测活性保留(例如萤光素酶活性等)为基础。
3.ATP检测甲虫萤光素酶-萤光素反应导致产生光(“发光”)。因为甲虫萤光素酶-萤光素反应是ATP依赖性的，所以萤光素酶可以用于测定ATP。反应是非常灵敏的，从而允许检测含有少至10-16摩尔ATP或更少的样品中的ATP。本发明的组合物、方法和试剂盒允许使用者通过确定发光的量来确定样品中ATP的量。本发明应用于目的样品，以及包含已知量ATP的样品(对照)。由ATP浓度未知的样品产生的信号可以与由内部对照(例如向样品中加入已知量ATP并测量后续发光)产生的信号或外部标准曲线相互关联，所述标准曲线通过测量几种已知ATP浓度的样品的发光并将它们用图解表示作图而产生。此类方法是技术人员已知的。(Moyer和Henderson，1983；Ronner等人，1999；Stanley，1989；Wood等人，1989)。
由萤光素酶反应产生的发光一般用发光计来检测，尽管其他检测方法也可使用。为了测量发光并因此确定试剂组合物活性，可以测量试剂组合物与样品组合后在目的时间点上由萤光素酶反应产生的相对光单位(RLU)值。光的存在大于背景水平提示样品中存在ATP。在其中样品存在(例如试剂组合物等)但缺少样品的相同反应条件下可以测量发光的背景水平。可以采用包含ATP的阳性对照反应以促进样品中存在的ATP量的确定。本领域技术人员可以确定这些及其他对照反应。
在本发明组合物和方法中使用的优选萤光素酶产生稳定的发光信号，持续时间显著，显示相对于萤光素酶反应开始时产生的发光信号每半小时小于50％的发光损失。在本发明组合物和方法中使用的优选萤光素酶可以具有增强的热稳定性特性和/或可以具有动力学特性，所述动力学特性有利于随着时间推移样品的多重分析或者随着时间推移多种样品的分析，所述时间包括但不限于萤光素酶反应开始后1小时，更优选2小时或最优选4小时或开始后更长时间。
确定发射的光量可以使得样品中的ATP量得到确定，并因此确定活微生物细胞的量。定量ATP值被实现，例如，当从测试样品发射的光量与从对照样品发射的光量或与标准曲线进行比较时，所述标准曲线通过利用已知量ATP以及相同的萤光素酶、底物及反应条件(即温度、pH等)进行确定。应当理解定量包括减去背景值。当从一个样品发射的发光与另一个样品发射的发光进行比较时，无需知道样品中存在的ATP绝对量，例如在测试化合物存在或不存在下比较样品，可以了解定性的ATP值。本领域普通技术人员可以很容易地设计许多此类实验。
根据本发明的优选实施方案涉及利用包含一组完整组分的单步骤试剂组合物检测ATP的方法，以促进ATP提取和检测。然而，依照本领域技术人员已知的其他“两步骤”ATP检测方法，在最终ATP检测步骤中加入中和试剂(例如缓冲剂)和/或外源性萤光素酶和/或萤光素试剂之前，本发明的包含ATP提取剂的试剂组合物可以不依赖于萤光素酶和萤光素试剂而首先用于裂解细胞。
4.细胞生活力ATP的存在是活细胞特有的活跃代谢过程的反映。因此本发明的组合物、方法和试剂盒可以用于测定细胞生活力(Cree，1998；Jassim等人，1990；Petty等人，1995)。细胞生活力的精确测量允许准确评估物质对于细胞的作用；与细胞生活力相关的其他应用是本领域技术人员已知的。细胞生活力的确定在评估例如细胞毒性、细胞增殖、坏死、细胞代谢中的改变等中是有用的。
用于评估细胞生活力的微生物样品可以是天然的活细胞，或可以包括细胞裂解物(作为细胞生活力的替代标记)或怀疑含有细胞、怀疑来源于细胞或预期反映微生物来源材料生活力的任何其他微生物来源材料。
5.测定试剂盒测定试剂盒预期依照本发明使用并且可以包括制备均质裂解的组分和检测试剂以及一套使用说明书。优选地，试剂盒可以包括冻干来源的萤光素/萤光素酶和一瓶包含ATP提取剂的重构缓冲剂以制备均质裂解以及检测试剂。重构缓冲剂可以与固定浓度的阳离子和/或螯合剂一起提供或这些组分可以分别提供，从而允许使用者根据特定微生物细胞来源的材料(例如个别细胞、群体等)以适合于使用的浓度添加二价阳离子和/或螯合剂。
E.鉴定适合于裂解并检测细菌样品中ATP的试剂组合物的方法因为基于影响这个方法的结构差异，不同的微生物显示出它们可以支持单步骤细胞裂解-ATP检测方法的程度的差异，所以在另一方面本发明提供了鉴定合适反应条件的方法，所述条件适合于有效单步骤裂解并检测特定微生物或微生物组中的ATP。具体地，本发明提供了评估或测定微生物ATP提取剂、二价阳离子和二价阳离子螯合剂化合物之间最佳平衡的测定，所述化合物能够个别地或共同地实现ATP提取及检测。
在一个优选实施方案中，本发明提供了鉴定适合于提取并检测微生物样品中ATP的ATP提取剂的方法，其中(1)第一种试剂组合物包括第一种浓度的二价阳离子、二价阳离子螯合剂、一种或多种微生物ATP提取剂、萤光素酶及萤光素酶底物(例如萤光素)，其与生长培养基中的细菌样品组合以生成产生第一种发光信号的第一种混合物；以及(2)包括比第一种试剂组合物中浓度更高的二价阳离子、二价阳离子螯合剂、一种或多种微生物ATP提取剂、萤光素酶及萤光素酶底物(例如萤光素)的第二种试剂组合物与相同的细菌样品组合以生成产生第二种发光信号的第二种混合物；其中如果来自第一种混合物的第一种发光信号大于来自第二种混合物的第二种发光信号，则第二种试剂组合物适合于提取并检测细菌样品中的ATP。
优选地，第一种试剂组合物中的二价阳离子浓度优选为第二种试剂组合物中的二价阳离子浓度的至少约1/10，更优选至少约1/25并再更优选至少约1/100。第一种试剂组合物中的二价阳离子浓度可以为约0-2mM、约0.05mM-0.5mM、约0.1mM-0.3mM或约0.2mM。优选地，第二种试剂组合物中的二价阳离子浓度为约20mM-200mM，约5mM-50mM、约10mM-30mM或约20mM。
可以使用上述方法的变形以鉴定适合于有效提取并检测来自广泛多样的微生物细胞的ATP的试剂组合物。简言之，这种方法可以涉及制备试剂组合物，所述试剂组合物包括萤光素酶(例如热稳定的、化学稳定的或天然的)、萤光素、固定的Mg2+浓度(例如5mM)及缓冲剂；向试剂组合物加入推定的目的ATP提取剂并在外源性ATP(阳性对照)和不同微生物细胞来源集合的存在下检查发光中可比较的差异。在一个实施方案中，微生物细胞来源可以包括代表几个种类的各种不同的微生物，包括但不限于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、古细菌及真菌。在另一实施方案中，微生物细胞来源可以包括对特定微生物种类特定的各种微生物(例如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、古细菌或真菌)。选择的ATP提取剂应对ATP对照样品的发光具有最小的影响，但提供稳定发光信号的足够的提取及产生(例如至少24分钟的半衰期。几种ATP提取剂可以个别测试或组合并且以矩阵形式评估其剂量效应以鉴定每种活性化合物的最佳组合和浓度。当相等地固定试剂组合物中的所有其他组分时，通过滴定各种浓度的Mg2+可以进一步评估Mg2+的作用。
F.用于检测微生物细胞中ATP的用途1.确定活微生物细胞或微生物污染物的存在本发明的主要应用是利用上文所公开的方法测定微生物细胞样品、微生物细胞群体或怀疑的微生物污染来源的相对生活力。
2.评估药物学活性或生物学活性化合物依照本发明使用细胞生活力测定可以进一步应用于开发和测试药物学活性或生物学活性试剂。在一个优选实施方案中，本发明的组合物、方法和试剂盒可以用于评估抗生素候选化合物的功效或测试化合物对细菌代谢的作用，所述化合物例如无机物、小的有机物、肽、蛋白质和多肽(Aiginger等人，1980；Andreotti等人，1995；Bradbury等人，2000；Cree和Andreotti，1997；Crouch等人，1993；Kangas等人，1984)。用药物学活性或生物学活性试剂(例如抗生素等)处理微生物细胞后测量细胞生活力可以提供筛选并鉴定负面影响微生物生长的新型药物学或生物学活性试剂的方法。
例如，适当培养装置(例如多孔板等)中的微生物培养物可以用一组候选抗生素试剂进行处理(与未处理的对照培养物平行)，生长足够微生物生长的时间，并利用本发明的组合物和方法测试ATP(发光测定)。一般地，如果从未处理的对照培养物检测的发光高于来自处理的培养物的发光，则将发现候选抗生素试剂显示抗生素活性。相反，如果处理的培养物中的发光与未处理的对照培养物相比是相等的(或甚至更高)，则一般将发现候选抗生素试剂不具有抗生素活性。
本发明的进一步应用提供了筛选抗微生物肽的方法，所述肽类似于天然免疫防御机制中使用的那些(参见例如Lehrer和Ganz，Curr.Opin.Immunol.，11(1)23-27，1999)。本方法使用E部分中所述方法的修改以鉴定能够破坏微生物细胞的抗微生物肽，其中抗微生物肽(或适当的肽文库)取代上文E部分中的ATP提取剂。可以用例如肽文库代替ATP提取剂处理所选的微生物靶(例如抗生素抗性微生物)并基于促进ATP有效提取和检测筛选生物发光以鉴定具有选择性裂解微生物细胞能力的潜在杀微生物剂。然而，该方法无需局限于肽的筛选。基于利用所公开的ATP测定系统获得的结果，可以测试各种不同的化学或生物化学化合物以鉴定显示选择性裂解微生物细胞能力的候选试剂。下述实施例意图不加限制地举例说明本发明。
实施例实施例1在不同MgCl2浓度下微生物细胞中ATP检测的动力学。
利用萤光素酶试剂组合物评估微生物细胞中ATP检测的动力学，所述试剂组合物包括重构试剂(200mM HEPES，pH7.5(Sigma)、MgCl2(0mM、2.5mM、5mM、10mM或20mM)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％ CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM氟化钠(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))及底物(4mM柠檬酸盐、mM萤光素、0.4％ Prionex(Pentapharm，Ltd)、～0.08mg/ml热稳定性萤光素酶、1mM硫酸镁及1.25mM CDTA)。将100μl铜绿假单胞菌培养物或100μl 1×10-9M ATP贮存液(对照)加到100μl萤光素酶试剂组合物中并在35分钟的时间段内定期测量发光。铜绿假单胞菌在大约106细胞/孔进行测试。所述分析的结果(图1)突出了作为二价阳离子浓度函数的ATP检测中的差异。
实施例2在不同ATP提取剂的存在下的ATP检测。
在低(0.2mM)和高(20.0mM)二价阳离子浓度下测试不同ATP提取剂组合对ATP检测的作用。在MgCl2的“高”(+；20mM)或“低”(-；0.2mM)浓度的存在下在BacTiter-GloTM试剂组合物(0.358mg/mlUltraGloTMLuciferase(Promega)、6mM甲虫萤光素(Promega)200mM HEPES(Sigma)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％ CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))中用不同的ATP提取剂处理铜绿假单胞菌。将100μl铜绿假单胞菌培养物加到100μl BacTiter-GloTM试剂组合物中并测量发光。铜绿假单胞菌在大约106细胞/孔进行测试。所述分析的结果(图2)证实了“镁反转”效应，其特征在于当试剂组合物或混合物中的镁水平从20mM降至0.2mM时，在时间范围的相等点上(例如t＝0分钟时)发光增强。
实施例3加入二价螯合剂后ATP检测的刺激。
为了证实二价阳离子与螯合剂的中和作用可以模拟在低二价阳离子浓度条件下获得的较高发光，用萤光素酶试剂组合物处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌培养物，所述试剂组合物包括重构试剂(200mM HEPES(Sigma)、20mM MgCl2、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％ CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma))及底物(4mM柠檬酸盐、5mM萤光素、0.4％ Prionex(Pentapharm，Ltd)、～0.08mg/ml热稳定性萤光素酶、1mM硫酸镁及1.25mM CDTA)。将100μl细菌培养物或100μl 1×10-9M ATP贮存液(对照)加到100μl重构试剂中并在35分钟的时间段内定期测量发光。微生物培养物在大约106细胞/孔进行测试。在t＝12分钟时向每个样品中加入另外的CDTA(终浓度为20mM CDTA)。所述分析的结果(图3)表明CDTA在铜绿假单胞菌中能够中和二价阳离子的抑制作用。
实施例4在二价阳离子螯合剂存在下的ATP检测。
为了证明二价阳离子螯合剂存在下的ATP检测，制备包含各种EDTA浓度(0mM、22mM、23mM、24mM及25mM)的重构试剂组合物(200mM HEPES(Sigma)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μMNaPPI(Sigma)、20mM MgCl2(Sigma))。随后通过将重构试剂组合物与底物(4mM柠檬酸盐、5mM萤光素、0.4％ Prionex(Pentapharm，Ltd)、～0.08mg/ml热稳定性萤光素酶、1mM硫酸镁及1.25mM CDTA)混合产生萤光素酶试剂组合物。将100μl大肠杆菌(图4A)、铜绿假单胞菌(图4B)或1×10-9M ATP贮存液(未显示)加到100μl萤光素酶试剂组合物中并在40分钟的时间段内定期测量发光。细菌培养物在大约106细胞/孔进行测试。所述分析的结果(图4A、4B)表明利用二价螯合剂浓度可以滴定出抑制性二价阳离子的作用，所述二价螯合剂浓度被最优化以促进ATP释放和检测之间的适当平衡。
实施例5不同二价阳离子浓度对不同微生物细胞中ATP检测的作用。
为了确定二价阳离子浓度对不同细菌中ATP检测的作用，制备重构试剂(200mM HEPES(Sigma)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μMNaPPI(Sigma)并加入到各种浓度的MgCl2(0mM、2.5mM、5mM、10mM和20mM))及底物(4mM柠檬酸盐、5mM萤光素、0.4％Prionex(Pentapharm，Ltd)、～0.08mg/ml热稳定性萤光素酶、1mM硫酸镁及1.25mM CDTA)。大肠杆菌(图5A)、金黄色葡萄球菌(图5B)、铜绿假单胞菌(图5C)和蜡状芽孢杆菌(图5D)在大约106细胞/孔进行测试。还测试纯化的ATP溶液作为对照(未显示)。将100μl细菌培养物或100μl 1×10-9M ATP贮存液加到100μl试剂中并在35分钟的时间段内定期测量发光。所述分析的结果(图5A-5D)突出了取决于微生物和二价阳离子浓度的ATP检测中的差异。
实施例6在低(0.2mM)和高(20mM)二价阳离子浓度下利用一组ATP提取剂在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中ATP检测的动力学。
为了评估在低(0.2mM)和高(20mM)二价阳离子浓度下ATP检测的动力学，将各种不同的ATP提取剂组合包括在含有低(0.2mM)或高(20mM)浓度MgCl2的试剂组合物(200mM HEPES(Sigma)、2mMNaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml UltraGloTMLuciferase(Promega)及6mM甲虫萤光素(Promega))中以形成一系列试剂组合物，每一种就其中包含的提取剂和/或二价阳离子浓度而言是不同的。将100μl每种不同的试剂组合物加到小孔中的100μl大肠杆菌(图6A、6B)、铜绿假单胞菌(图6C、6D)或1×10-9M ATP对照溶液(图6E、6F)中。在50分钟的时间段内定期测量发光。所述分析的结果(图6A-6F)表明取决于微生物、ATP提取剂组合及二价阳离子浓度的glo动力学中的差异。
实施例7二价阳离子对ATP提取和检测的影响不限于Mg2+。
为了评估替代的二价阳离子在低(0.2mM)和高(20mM)二价阳离子浓度下对ATP提取及检测的作用，在Mueller Hinton II(MH II)Broth中37℃过夜生长铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。将过夜培养物在新鲜的MH II Broth中稀释50倍并随后温育几小时以达到对数期。将细胞稀释至大约1×106细胞/孔。将ATP对照溶液稀释至大约10-9M。制备包含不同浓度0.002、0.02、0.2、2.0或20mM的MgCl2(图7A)、CaCl2(图7B)或MnCl2(图7C)的100μl BacTiter-GloTM试剂组合物(200mM HEPES(Sigma)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％ CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml UltraGloTMLuciferase(Promega)及6mM甲虫萤光素(Promega))，并加到100μl细菌或ATP对照样品中。在来自Turner Biosystems的VeritasTMMicroplate Luminometer上记录发光。所述分析的结果(图7A-7C)表明二价阳离子对ATP提取和检测的影响不限于Mg2+，因为发现高Ca2+(图7B)和Mn2+(图7C)的使用同样阻碍ATP检测。
实施例8二价阳离子对ATP提取和检测的影响不限于热稳定性萤光素酶。
使铜绿假单胞菌(ATCC 27853)在Mueller Hinton II(MH II)Broth中37℃过夜生长。将过夜培养物在新鲜的MH II Broth中稀释50倍并随后温育几小时以达到对数期。将细胞稀释至大约1×106细胞/孔。将ATP对照溶液稀释至大约10-9M。制备包含低(0.2mM)或高(20mM)浓度MgCl2的100μl BacTiter-GloTM试剂组合物(200mMHEPES(Sigma)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％ CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/ml QuantiLum Recombinant Luciferase(Promega)及6mM甲虫萤光素(Promega))，并加到细菌或ATP对照样品中。在来自Turner Biosystems的VeritasTMMicroplate Luminometer上记录发光。所述分析的结果(图8)表明二价阳离子对ATP单步骤提取和检测的抑制作用不限于热稳定性萤光素酶的使用。
实施例9微生物细胞数目与生物发光信号之间的关联。
使用4种细菌株评估微生物细胞数目与发光之间的关联。使细菌株大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和蜡状芽孢杆菌(ATCC 10987)在Mueller HintonII(MH II)Broth中37℃生长过夜。将过夜培养物在新鲜的MH IIBroth中稀释50倍并随后温育几小时以达到对数期。将培养物样品用MH II Broth在96孔板中进行连续稀释。将重构的BacTiter-GloTM试剂组合物(200mM HEPES(Sigma)、0.08％ CTAB(Sigma)、0.16％CHEX(Sigma)、1％ Triton-X100(Sigma)、20mM MgCl2、23mMEDTA、2mM NaF(Sigma)、25μM NaPPI(Sigma)、0.358mg/mlUltraGloTMLuciferase(Promega)及6mM甲虫萤光素(Promega))在室温下平衡1.5小时以提高灵敏度并加到每个不同的培养物样品中。在来自Turner Biosystems(Sunnyvale，CA)的VeritasTMMicroplateLuminometer上记录发光。
所述分析的结果显示于图9中，图9的图描绘了微生物细胞数目与生物发光之间的关联。发光信号代表每次测量3次重复的平均值。通过在Luria-Bertani琼脂平板上平板计数菌落形成单位来确定细菌细胞数目。计算信噪比，其中S∶N＝[信号平均值-背景平均值]/背景标准差。图9证实了发光信号与细胞数目之间的线性关联超过5个数量级。从所述实验得出的关于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌的检测极限分别为大约40、150、70和10个细胞。
实施例10 BacTiter-GloTMAssay产生稳定的发光型的发光信号。
4种不同的细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌)如实施例9中所述进行生长和测定。每次测定使用大约106细胞。随着时间推移监控发光信号的稳定性。在来自TurnerBiosystems(Sunnyvale，CA)的VeritasTMMicroplate Luminometer上记录发光。所述分析的结果(图10)表明本发明的微生物测定系统可以在一系列微生物细胞中产生具有半衰期(T1/2)＞30分钟的、稳定的“发光型”的发光信号。
实施例11 BacTiter-GloTMAssay提供作为时间函数的细菌生长的增强生物发光检测。
使大肠杆菌ATCC 25922菌株在MH II Broth中37℃过夜生长。将过夜培养物在50ml新鲜的MH II Broth中1∶106稀释并在37℃、250rpm振荡下温育。在各个时间点上取样，并如实施例9中所述进行萤光素酶检测测定。在VeritasTMMicroplate Luminometer上记录发光。利用Beckman DU650分光光度计在600nm处(O.D.600)测量光密度。当RLU和O.D.读数分别超过108和1时，使用稀释的样品。所述分析的结果(图11)表明ATP检测测定提供了比常规光密度测量更灵敏的细菌生长测量(与插图的结果比较)。
实施例12在96孔板中在t＝5小时时作为减少的发光的函数筛选抗微生物化合物。
将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌珠在MH II Broth中37℃过夜生长。将过夜培养物在新鲜的MH II Broth中稀释100倍并用作抗微生物剂筛选的接种物。在DMSO中制备LOPAC化合物和标准抗生素的工作贮存液(50×)。96孔多孔板的每个孔包含245μl接种物和5μl的50×工作贮存液。将多孔板在37℃温育5小时。从每个孔中取出100微升培养物，并如实施例9中所述进行萤光素酶检测测定。利用来自Turner Biosystems(Sunnyvale，CA)的VeritasTMMicroplateLuminometer测量发光。样品和浓度为孔1-4和93-96，阴性对照2％ DMSO，孔5-8和89-92，阳性对照32μg/ml标准抗生素四环素、氨苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、苯唑西林、卡那霉素、哌拉西林及红霉素；孔9-88，10μM的LOPAC化合物。所述分析的结果(图12)验证了这种筛选方法用于鉴定抗生素试剂的用途(与加框的阳性对照相比用圆圈表示)。
实施例13作为抗生素剂量暴露函数的细菌生长的生物发光检测。
如实施例8中所述制备金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株和苯唑西林并在37℃温育；在温育19小时后如NCCLS(6)为MIC测定所推荐的进行ATP检测测定。显示了与无苯唑西林对照相比的RLU相对百分比。在来自Turner Biosystems(Sunnyvale，CA)的VeritasTMMicroplate Luminometer上记录发光。所述分析的结果(图13)证实了抗生素对ATP检测的剂量依赖性效应。
权利要求
1.一种检测怀疑含有微生物的样品中ATP的组合物，其包括(a)反应缓冲剂；(b)一种或多种ATP提取剂；(c)第一种浓度的二价阳离子；(d)第二种浓度的二价阳离子螯合剂；以及(e)萤光素酶；其中所述第一种浓度和所述第二种浓度之间的差异小于约5mM。
2.权利要求1的组合物，其中所述第一种浓度和所述第二种浓度之间的差异小于约2.5mM。
3.权利要求1的组合物，其中所述第一种浓度和所述第二种浓度之间的差异小于约1.0mM。
4.权利要求1的组合物，其中所述第二种浓度是所述第一种浓度的至少一半。
5.权利要求1的组合物，其中所述第二种浓度至少约等于或大于所述第一种浓度。
6.权利要求1的组合物，其中所述第一种浓度为至少10mM。
7.权利要求1的组合物，其中所述第一种浓度为至少20mM。
8.权利要求1的组合物，其中所述第一种浓度为至少约20mM并且所述第二种浓度为至少约20mM。
9.权利要求1的组合物，其中所述微生物为革兰氏阴性细菌。
10.权利要求1的组合物，其中所述微生物为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。
11.权利要求1的组合物，其中所述一种或多种ATP提取剂包括十六烷基三甲基溴化铵。
12.权利要求1的组合物，其中所述一种或多种ATP提取剂包括氯己定和非离子型去污剂。
13.权利要求1的组合物，其中所述一种或多种ATP提取剂包括十六烷基三甲基溴化铵、氯己定和非离子型去污剂。
14.权利要求1的组合物，其中所述二价阳离子为Mg2+、Ca2+或Mn2+。
15.权利要求1的组合物，其中所述二价阳离子螯合剂为EDTA或CDTA。
16.权利要求1的组合物，其中所述二价阳离子为Mg2+并且所述二价阳离子螯合剂为EDTA。
17.一种检测怀疑含有微生物的样品中ATP的组合物，其包括(a)反应缓冲剂；(b)一种或多种ATP提取剂；(c)第一种浓度的二价阳离子；(d)萤光素酶；其中所述第一种浓度小于约5mM。
18.权利要求17的组合物，其中所述第一种浓度小于约2.5mM。
19.权利要求17的组合物，其中所述第一种浓度小于约1mM。
20.权利要求17的组合物，其中所述第一种浓度小于约0.5mM。
21.权利要求17的组合物，其进一步包括二价阳离子螯合剂。
22.权利要求17的组合物，其中所述微生物为革兰氏阴性细菌。
23.权利要求17的组合物，其中所述微生物为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。
24.权利要求17的组合物，其中所述一种或多种ATP提取剂包括十六烷基三甲基溴化铵。
25.权利要求17的组合物，其中所述一种或多种ATP提取剂包括氯己定和非离子型去污剂。
26.权利要求17的组合物，其中所述一种或多种ATP提取剂包括十六烷基三甲基溴化铵、氯己定和非离子型去污剂。
27.权利要求17的组合物，其中所述二价阳离子为Mg2+、Ca2+或Mn2+。
28.权利要求17的组合物，其中所述二价阳离子螯合剂为EDTA或CDTA。
29.权利要求17的组合物，其中所述二价阳离子为Mg2+并且所述二价阳离子螯合剂为EDTA。
30.一种从革兰氏阴性微生物中提取ATP的组合物，其包括(a)反应缓冲剂；(b)一种或多种ATP提取剂；(c)第一种浓度的二价阳离子；以及(d)第二种浓度的二价阳离子螯合剂；其中所述第二种浓度至少约等于或大于所述第一种浓度。
31.权利要求30的组合物，其中所述第一种浓度为至少约10mM。
32.权利要求30的组合物，其中所述第一种浓度为至少约20mM。
33.权利要求30的组合物，其中所述第一种浓度为至少约20mM并且所述第二种浓度为至少约20mM。
34.一种检测含有或怀疑含有微生物的样品中ATP的方法，其包括(a)使所述样品与包含第一种浓度的二价阳离子、第二种浓度的二价阳离子螯合剂、一种或多种ATP提取剂及萤光素酶的组合物接触以形成混合物；其中所述浓度与所述第二种浓度之间的差异小于约5mM；以及(b)检测发光。
35.权利要求34的方法，其中所述组合物中的二价阳离子螯合剂浓度至少约等于或大于所述组合物中的二价阳离子浓度。
36.权利要求34的方法，其中所述混合物中的二价阳离子螯合剂浓度为所述混合物中的二价阳离子浓度的至少一半。
37.权利要求34的方法，其中所述微生物为革兰氏阴性细菌。
38.权利要求34的方法，其中所述微生物为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。
39.权利要求34的方法，其中所述样品含有或怀疑含有异源群体的微生物细胞。
40.权利要求34的方法，其中所述样品含有或怀疑含有病原性微生物。
41.权利要求34的方法，其中可检测的发光信号在所述样品与所述组合物接触后10分钟内产生。
42.权利要求34的方法，其中可检测的发光信号在所述样品与所述组合物接触后5分钟内产生。
43.权利要求34的方法，其中所述发光产生具有至少为30分钟的半衰期的发光信号。
44.权利要求34的方法，其中所述发光产生足以检测样品中至少1×10-14摩尔ATP的发光信号。
45.权利要求34的方法，其中所述组合物产生足以检测至少1000个大肠杆菌细胞的发光信号。
46.一种检测含有或怀疑含有微生物的样品中ATP的方法，其包括(a)使所述样品与包含二价阳离子、一种或多种ATP提取剂及萤光素酶的组合物接触以形成混合物；其中所述组合物中存在的所述二价阳离子浓度小于约5mM；以及(b)检测发光。
47.权利要求46的组合物，其中所述组合物中存在的所述二价阳离子浓度为至少约2.5mM。
48.权利要求46的组合物，其中所述组合物中存在的所述二价阳离子浓度为至少约1mM。
49.权利要求46的组合物，其中所述组合物中存在的所述二价阳离子浓度为至少约0.5mM。
50.权利要求46的方法，其中所述微生物为革兰氏阴性细菌。
51.权利要求46的方法，其中所述微生物为大肠杆菌或铜绿假单胞菌。
52.权利要求46的方法，其中所述样品含有或怀疑含有异源群体的微生物细胞。
53.权利要求46的方法，其中所述样品含有或怀疑含有病原性微生物。
54.权利要求46的方法，其中可检测的发光信号在所述样品与所述组合物接触后10分钟内产生。
55.权利要求46的方法，其中可检测的发光信号在所述样品与所述组合物接触后5分钟内产生。
56.权利要求46的方法，其中所述发光产生具有至少为30分钟的半衰期的发光信号。
57.一种鉴定适合于检测微生物样品中ATP的ATP提取剂的方法，其包括(a)向来自微生物来源的微生物样品中加入包含二价阳离子、二价阳离子螯合剂、至少一种ATP提取剂、萤光素酶及萤光素酶底物的组合物以形成混合物；其中所述混合物中存在的所述二价阳离子浓度为小于或等于约0.5mM；(b)在所述混合物中测量发光程度并确定所述至少一种ATP提取剂用于检测微生物样品中ATP的适合性；其中如果发光程度足够用于检测，则所述至少一种ATP提取剂适合于检测微生物来源中的ATP。
58.权利要求57的方法，其中所述混合物中存在的所述二价阳离子浓度为小于或等于约0.1mM。
59.一种鉴定适合于检测微生物样品中ATP的ATP提取剂的方法，其包括(a)向来自微生物来源的第一种微生物样品中加入第一种浓度的二价阳离子、二价阳离子螯合剂、至少一种ATP提取剂、萤光素酶及萤光素酶底物以形成第一种混合物；(b)向来自(a)中微生物来源的第二种微生物样品中加入第二种浓度的二价阳离子、二价阳离子螯合剂、至少一种ATP提取剂、萤光素酶及萤光素酶底物以形成第二种混合物，其中所述第二种混合物中所述二价阳离子的第二种浓度大于所述第一种混合物中所述二价阳离子的第一种浓度；以及(c)分别检测所述第一种和第二种混合物中的发光并确定所述至少一种ATP提取剂用于检测微生物样品中ATP的适合性；其中如果所述第一种混合物中的所述发光大于所述第二种混合物中的所述发光，则所述至少一种ATP提取剂适合于检测所述微生物来源中的ATP。
60.一种筛选候选抗生素试剂的方法，其包括(a)用至少一种候选抗生素试剂处理第一种微生物培养物；(b)使得用所述至少一种候选抗生素试剂处理的所述第一种微生物培养物以及没有用所述至少一种候选抗生素试剂处理的第二种微生物对照培养物生长足以检测所述第二种微生物对照培养物的生长的时间段；(c)使所述第一种微生物培养物及所述第二种微生物对照培养物分别与包含二价阳离子、二价阳离子螯合剂、至少一种ATP提取剂及萤光素酶的组合物接触以分别形成第一种和第二种混合物；其中所述第一种和第二种混合物中每一种的二价阳离子与二价阳离子螯合剂的量的差异小于约2.5mM；以及(d)检测发光；以及(e)确定所述候选抗生素是否具有抗生素活性。
61.权利要求60的方法，其中所述第一种和第二种混合物中每一种的二价阳离子与二价阳离子螯合剂的量的差异小于约1.25mM。
62.权利要求60的方法，其中所述第一种和第二种混合物中每一种的二价阳离子与二价阳离子螯合剂的量的差异小于约0.4mM。
全文摘要
本发明涉及单步骤提取并检测来自微生物细胞的ATP水平的组合物及方法。配制所公开的组合物以利用共同的单步骤试剂组合物在广泛多样的不同微生物中有效诱发ATP的生物发光检测。提供了额外的基于发光的方法以用于鉴定其他有用的提取剂或用于根据其对微生物细胞的药物学或生物学作用筛选化合物。
文档编号G01N33/84GK101040054SQ200580029454
公开日2007年9月19日 申请日期2005年7月1日 优先权日2004年7月2日
发明者F·范, B·布特勒, K·V·伍德 申请人:普罗美加公司