专利名称：一种微生物油脂提取方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物油脂的提取方法，具体的讲，是先用酶对产油微生物的发酵醪液进行前处理，然后用有机溶剂浸提得到油脂，属于生物工程下游技术领域。
背景技术：
许多微生物，如酵母、霉菌、微藻、细菌等，在一定条件下能将碳水化合物转化为油脂贮存在菌体内，这种油脂称为微生物油脂。在细胞内能积累油脂超过细胞干重20%的菌株，称为产油微生物。一些产油微生物的油脂含量可以达到细胞干重的70%以上(Ratledge C. Acta Biotechnology, 1991，11(5)，似9)。微生物油脂的脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸为主。此外，一些菌株的油脂中含有大量的功能性脂肪酸，如亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。 与植物油脂生产相比，微生物油脂发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等的影响，可连续生产；而且产油微生物菌种资源丰富，能利用和转化各种农林废弃木质纤维素及其他生物质材料，对高效利用可再生资源、改善生态环境、发展生物质能源产业具有特殊的意义。因此，利用微生物转化法获取油脂潜力巨大。如何以产油微生物培养物为原料，高效、低成本地分离提取油脂，是实现微生物油脂规模化生产的瓶颈之一。为得到细胞内的油脂，通常先从产油微生物发酵醪液中回收菌体，进行干燥，然后参照植物油脂提取工艺提取微生物油脂。当前文献中以含油干菌体为原料，采用的提取方法如压榨法(何东平，陈涛.微生物油脂学.北京化学工业出版社， 2005)、压力溶剂法(White PM, Potter TL, Strickland TC. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009，57(16)，7171 )、超声波辅助溶剂浸提法(Vicente G, Bautista LF, Rodriguez R, et al. Biochemical Engineering Journal, 2009, 48(1)， 22)> WA^WM^MWii (Young JG Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995，43(11)，四04)、超临界流体法(何东平，陈涛.微生物油脂学.北京化学工业出版社，2005)和索氏提取法(李超.食品分析原理与技术.北京科学技术文献出版社， 1987)。文献中也有以产油微生物湿菌体为原料，采用溶剂浸提法或酸热法提取油脂的报道(李植峰，张玲.微生物学通报，2001，28(6), 72)。上述方法的共同特点是，首先通过离心或过滤等技术从产油微生物发酵醪液中分离出菌体。然而，许多产油微生物为单细胞生物，细胞尺寸小，菌体含水量高。在产油微生物培养后期，由于胞内积累大量油脂，细胞密度降低，发酵醪液粘度大。因此，采用离心或过滤技术从发酵醪液中分离回收菌体比较困难，操作成本高(Lee AK, Lewis DM, Ashman PJ. Journal of Applied Physiology, 2009， 21(5)，559)。显然，以富含油脂的微生物菌体为材料提取油脂，存在如下一种或多种缺陷， 包括工艺复杂、设备要求高、能耗高、使用高毒性有机溶剂。以产油微生物浓缩发酵液为原料的油脂提取方法有高压均浆法(CN101323865) 等，该方法需要对发酵液进行浓缩，而且高压均浆破碎细胞壁技术对设备要求高，能量消耗大，油脂提取成本高，不适合微生物油脂工业化生产。以产油微生物发酵醪液为原料的油脂提取方法有发酵液有机溶剂直接浸提法(CN1018M440A)等。这些方法在较高的浸提温度下使用高毒性溶剂如氯仿等才能得到较高的浸提率，毒性小的溶剂如四号溶剂、六号抽提溶剂油等即使在高温(>50 °C)下浸提率也不高(<55%)。这些方法操作安全性差，对人体健康和环境损害大。
发明内容
本发明提供了一种以产油微生物发酵醪液为原料，酶辅助有机溶剂浸提油脂的方法。本方法原料前处理过程简单，条件温和、能耗低。由于酶处理有效解除了溶剂抽提油脂的障碍，可以使用毒性低、环境更友好的有机溶剂。本发明通过下述技术方案予以实现
1)向发酵醪液中加入酶至总酶浓度为0.01g/L 5 g/L，在20 °C 50 °C，pH 3 8，处理5分钟 10小时；
2)向步骤1)处理过的发酵醪液加入有机溶剂，溶剂用量为发酵醪液体积的0.2倍 5 倍,在20 °C 60 °C处理10分钟 5小时；
3)从步骤2)处理过的混合物料中回收有机相；
4)将步骤3)得到的有机相按常规方法除去有机溶剂，得到微生物油脂。本发明的技术方案中使用的酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β -1，3-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶K、磷脂酶、蜗牛酶、几丁质酶等或它们的必要组合。其中，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、葡聚糖酶、蛋白酶从宁夏和氏璧生物技术有限公司购得，比活力分别为5万U/g、120万U/g、3. 5万U/g、120万U/g、80 万U/g，蛋白酶K从宝生物工程(大连)有限公司购得，比活力为3. 0万U/g，磷脂酶从诺维信(中国)投资有限公司购得，比活力为1.0万U/g，蜗牛酶从北京鼎国昌盛生物技术有限公司购得，β-1，3-甘露聚糖酶是发明人所在实验室以毕赤酵母(/^Aia ^1Stori1S Χ-33) 为宿主，将文献(Sugino H, Furuichi S, Murao S, et al. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2004, 68，757)公布的基因重组表达获得，其比活力为0. 64万U/ g，α-1，3-葡聚糖酶是发明人所在实验室参照文献(Shalom G, J Pratten, et al. Protein Expression and Purification, 2008，60(2)，170)制备，比活力为 0. 39 万 U/ g，几丁质酶是发明人所在实验室参照文献(Tsujibo H, H Orikoshi, et al. Journal of Bacteriology, 1993，175(1)，176)制备，比活力为 1· 0 万 U/g。本发明使用的有机溶剂为室温下可溶解油脂、极性较低的液态有机物，如石油醚 (沸点范围60 °C 90 °C)、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、六号抽提溶剂油、四号溶剂、工业己烷(沸点范围66 °C 69 °C)等或者它们的必要组合。本发明从有机溶剂相中除去有机溶剂得到微生物油脂的方法为常压蒸馏或真空蒸发等。本发明使用的发酵醪液在与酶制剂接触前，还可以通过加热、微波辐射、超声处理等或它们的必要组合进行处理，以达到使产油微生物内源性蛋白质失活或降低活性的目的。本发明使用的产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20% (w/w)的真菌、微藻、细菌或基因工程菌，它们包括但不限于，产油真菌，如圆红冬孢酵# (.Rhodosporidium toruloides),白色隐球酵母 iCryptococcus albidus)、弯曲隐球酵母(Cryp tococcus curva tos )、亚罗解脂酵母(Yarrowia Iipolytica )、粘红酵母 (Jhodo torula glutinis )、乳糖红酵母(Jhodo torula lac tosa )、小红酵母{Rhodo torula minuta)、橘林油月旨酵母 ilipomyces kononenkoae),皮状丝孢酵 # (Trichosporon cutaneum),发酵性丝孢酵母(Jrichosporon fermentans),健强地霉、Geotrichum robusturn)>^ {Mortierella isabe 11 ina)、卷瓶毛毒{Mucor circinelloides)> 小克银汉霉(Xkmninghamella )和伯顿拟内孢霉(Mncbmycopsis burtonii )；产油微藻，如布朗葡萄 {Botryococcus braunii )> 隐甲 iCrypthecodinium cohnii )> 小球 ^iChlorella pro to thecoides ) > 微绿球藻{Nannoch lorops is sp.)禾口裂殖壶菌 {Schizochytrium Iimacinum)；产油细菌，如棒状杆 1 (Corynebacterium)> 诺卡氏菌 {Nocardia )、分枝杆菌(Mycobac terium)等。本发明使用菌体材料的实际油脂含量参照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007, 41，312)的方法测定，并以此为基准计算其他方法的油脂提取率。
具体实施例方式以下实施例选取了一些典型产油微生物的发酵醪液及其酶处理和油脂提取过程， 有助于了解本专利，但不以任何形式限制在其他产油菌株材料上应用本发明。对比例1
按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母Λ toruloides AS 2.1389 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为114 g干菌体(CDW)/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为63%。取上述发酵醪液50 ml，再加入50 ml乙酸乙酯，在25 °C下充分混合，浸提1 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为10%。实施例1
按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母Λ toruloides AS 2.1389 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为114 g干菌体(CDW)/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为63%。取上述发酵醪液50 ml，在常压下微波处理(800 W, 60 S)。加入β _1，3-甘露聚糖酶至终浓度为0. g/L，在pH 5.0,25 °C下处理0.5 h ；再加入50 ml乙酸乙酯，在25 0C 下充分混合，浸提1 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为95%。比较实施例1和对比例1的实验结果，表明发酵醪液经过微波和β -1，3-甘露聚糖酶处理后，用乙酸乙酯可以非常有效地提取油脂；而用乙酸乙酯直接从新鲜发酵醪液中很难提取分离油脂。因此，发酵醪液的前处理过程对微生物油脂提取分离具有显著效果。实施例2
其他操作条件同实施例1，但提取过程中省去用β-1，3-甘露聚糖酶处理发酵醪液的步骤。浸提率为35%。比较实施例1和实施例2，说明用β-1，3-甘露聚糖酶处理显著提高了油脂提取率。实施例3其他操作条件同实施例1，但提取过程中省去微波处理发酵醪液的步骤。浸提率为
30%。比较实施例1和实施例3，说明在酶处理前进行微波处理，可以显著提高油脂提取率，其原因可能是微波处理导致产油微生物内源性蛋白质失活或活性显著降低，更有利于 β-1，3-甘露聚糖酶发挥功效。实施例4
其他操作条件同实施例1，但在酶处理前发酵醪液的处理方式为121 °C下处理2分钟。浸提率为93%。比较实施例1和实施例4，说明在β -1，3-甘露聚糖酶处理前进行高温处理，可以取得和微波处理近似的效果。实施例5
其他操作条件同实施例1，但在酶处理前发酵醪液的处理方式为70 °C下处理10分钟。浸提率为87%。比较实施例1和实施例4、实施例5，说明在酶处理前进行高温处理的温度和时间可以在较宽的范围内变化，只要能够使产油微生物内源性蛋白质失活或活性显著降低，都可以使油脂提取获得很好的效果。实施例6
按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母Λ toruloides AS 2.1389 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为15 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为35%。取上述发酵醪液50 ml，在常压下微波处理(500 W，1 min)。加入β _1，3-甘露聚糖酶至终浓度为0.01 g/L，在pH 5.0,25 ° C下处理10 h ；再加入100 ml乙酸乙酯，在25 °(下充分混合，浸提1 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为100%。实施例7
按照文献(Ykema A, Verbree EC, Kater MM, Smit H. Applied Microbiology and Biotechnology, 1988，29，211)所述的方法培养产油酵母 C curvatus ATCC 20509 (菌株来源于美国典型微生物菌种保藏中心)，得到发酵密度为90 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为40%。取上述发酵液50 ml，在121 °C下处理5分钟。加入蜗牛酶至终浓度为 2.0 g/L，在pH 6. 5,37 ° C下处理2.0 h ；再加入100 ml 二氯甲烷，在20 ° C下充分混合， 浸提1 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为96%。实施例8
按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母Λ glutinis AS 2.703 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为105 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为60%。取上述发酵醪液50 ml，在50 °C下加热处理2 h。加入β _1，3-甘露聚糖酶至终浓度为0. 30 g/ L，在pH 5.0,37 °C下处理1.0 h ；调pH至7. 5，加入蛋白酶K至其终浓度为0. 05 g/L，再加入250 ml乙酸乙酯，在40 °C下充分混合，浸提10 min，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为85%。实施例9按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母Ζ. starkeyi AS 2.1560 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为61 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为58%。取上述发酵醪液50 ml，超声处理20 min。加入β -葡聚糖酶至终浓度为0. 10 g/L，在ρΗ 5.0， 25 ° C下处理1.0 h;调ρΗ至7.0，加入果胶酶至其终浓度为0.05 g/L，在25 °(下继续处理30 min;再加入25 ml正己烷和50 ml石油醚，在25 ° C下充分混合，浸提5. 0 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为90%。实施例10
按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母7 cutaneum AS 2.571 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为81 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为53%。取上述发酵醪液50 ml，微波处理(400 W, 3 min)。加入果胶酶、α-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶至其终浓度分别为0.40 g/L、0. 10 g/L和0.08 g/L，在ρΗ 5.0,37 ° C下处理1.0 h ；再加入工业己烷150 ml，在60 °C下充分混合，浸提20 min，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为78%。实施例11
按照文献(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. Enzyme Microbial Technology, 2007，41， 312)所述的方法，培养产油酵母isabellina AS 3. 3410 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，得到发酵密度为70 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为55%。取上述发酵醪液50 ml，在90 °C下加热处理10 min。加入β -葡聚糖酶至终浓度为0. 23 g/L 和蜗牛酶至终浓度为0. 60 g/L，在pH 6.0,37 °C下处理1.0 h ；再加入乙酸乙酯100 ml, 在50 °C下充分混合，浸提30 min，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为 90%。实施例12
按照文献(Xiong W, Li XF, Xiang JY, et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78，29)所述的方法培养产油微藻 CATCC 30556 (菌株
来源于美国典型微生物菌种保藏中心)，得到发酵密度为50 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为52%。取上述发酵液50 ml，微波处理(800 W, 30 S)。加入纤维素酶至其终浓度为 1.0 g/L和蜗牛酶至其终浓度为4.0 g/L，在pH 7.0,50 ° C下处理2.0 h ；再加入四号溶剂 20 ml和乙酸乙酯80 ml，在40 °C下充分混合，浸提1 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为93%。实施例13
按照文献(Xiong W, Li XF, Xiang JY, et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78，29)所述的方法培养产油微藻 C protothecoides CS-41 (菌株来源于澳大利亚CSIRO微藻研究中心)，得到发酵密度为18 g CDW/L的发酵醪液，干菌体油脂含量为49%。取上述发酵液50 ml，在60 °C下加热处理1 h。加入纤维素酶至其终浓度为0.3 g/L和半纤维素酶至其终浓度为0. 10 g/L，在pH 7.0，37 ° C下处理1.5 h ；加入乙酸乙酯100 ml，在40 °C下充分混合，浸提1 h，离心分离取出有机相，蒸发溶剂得微生物油脂，浸提率为89%。
本发明的有益效果是
与以干菌体、湿菌体、浓缩发酵液为原料的油脂提取方法相比，本发明不需要浓缩发酵液、回收菌体、干燥菌体等操作，克服了直接从高粘度发酵醪液中回收菌体的技术难题，简化了工艺步骤，节约了能耗，降低了成本；而且，通过有效提取细胞内油脂，还可以增加菌体密度，有助于后期固液分离操作和菌渣回收；
与压榨法、压力溶剂法、超声波辅助溶剂浸提法、微波辅助溶剂浸提法、超临界流体法、 酸热法或高压均质法等方法相比，本发明通过酶法破碎细胞壁，条件温和，能量消耗小，对设备要求低，成本低；同时对油脂、蛋白质等组分破坏小，得到的油脂质量高，菌渣营养价值尚；
与溶剂浸提法和酸热法相比，本发明所用溶剂毒性小，在水相残留少，溶剂损失少，对环境更友好，过程更清洁；
与发酵醪液有机溶剂直接浸提法相比，本发明由于使用酶处理有效解除了抽提油脂的障碍，使用的有机溶剂毒性低、环境更友好，并且浸提温度低，浸提效果好，操作安全性好， 能量消耗少。总之，本发明技术简单有效，设备投资少，能耗低，提高了微生物油脂发酵的技术经济性，有利于大规模工业化生产。
8
权利要求
1.一种微生物油脂提取方法，其特征在于首先用酶处理产油微生物发酵醪液，然后用有机溶剂浸提酶处理过的发酵醪液，再分离回收有机相，除去溶剂，得到微生物油脂。
2.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 β-1，3-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶K、磷脂酶、蜗牛酶、 几丁质酶中的一种或二种以上的必要组合。
3.按照权利要求1或2所述方法，其特征在于酶处理条件为醪液ρΗ=3 8，温度20 °C 50 °C，时间5分钟 10小时，酶用量0. 01 g/L 5 g/L。
4.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述有机溶剂为室温下可溶解油脂、极性低的液态有机物，为沸点范围60 °C 90 °C石油醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、六号抽提溶剂油、四号溶剂、沸点范围66 °C 69 °(工业己烷中的一种或二种以上的必要组合。
5.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述浸提条件为温度20°C 60 °C，时间 10分钟 5小时，有机溶剂与发酵醪液的体积比为1:5 5:1。
6.按照权利要求1所述方法，其特征在于发酵醪液在酶处理之前，可以经过灭活处理，其灭活方法为加热、微波辐射、超声波处理中的一种或二种以上的必要组合。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产油微生物发酵醪液为产油真菌、 细菌或微藻在液体培养条件下得到的含有菌体的悬浊液。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20% (w/w)的真菌、微藻或细菌。
全文摘要
本发明公开了一种微生物油脂提取方法，属于生物工程下游技术领域。以产油微生物发酵醪液为原料，经过酶解、有机溶剂浸提得到微生物油脂，浸提率最高可达100%。本发明不需要浓缩发酵醪液、回收菌体、干燥菌体等前处理操作，酶解条件温和，处理时间短，浸提温度低，浸提率高，对设备要求低，所用有机溶剂毒性小，大大降低了微生物油脂提取过程中动力和能量的消耗，降低了过程成本，减轻了对环境的污染和人体健康的损害。此方法为微生物油脂规模化生产提取提供了新途径。
文档编号C12P7/64GK102533879SQ20101059318
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者杨帆, 赵宗保, 靳国杰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所