专利名称：一种酱香型白酒大曲生产的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种白酒大曲的质量控制方法，特别是酱香型白酒大曲上产中通过对 优势菌群的检测，控制白酒的质量。
背景技术：
大曲是指含有大量能发酵的活微生物或酶类的糖化发酵剂。制曲技术是我国特有 的一份民族遗产，在曲与酒的关系上，曲是占先导地位的。俗语说“有美酒必备佳曲”，“曲为 酒骨”。而且更重要的是关系到香型风味的重要成因。酱香型白酒大曲采用小麦为原料，经粉碎拌水后压制成砖块状的曲坯。在制曲过 程中自然网罗环境中的微生物(或部分来源于母曲)接种，在控制条件下，曲坯中的微生物 彼消此长地生长繁殖，同时在曲坯内伴随着酶的代谢和物质间的生化演化。因此微生物的 种类很多。然而，自然界中的微生物群体，除了酵母、根霉、曲霉、毛霉等有益菌外，同时也夹 带着许多对酿酒有害的菌类，影响大曲酒出酒率和优质酒率。此外，自然微生物的种群和数 量常不以人的意志为转移，从而导致大曲质量的不稳定。优质大曲中的优势微生物菌群，是决定大曲质量的关键，利用PCR-DGGE技术可以 对制曲过程进行监控，可以发现优势微生物菌群的变化，可以确定本周期曲的质量情况，若 质量下降，可以适时对工艺进行调整，有利于大曲质量的稳定。此方法克服了需要感官和各 种理化指标来进行模糊判断的大曲鉴定方法。
发明内容
本发明提供一种酱香型白酒大曲生产过程中质量控制方法，该方法通过测定大曲生产过程中的半成品及成品中的DNA DGGE指纹图谱，控制产 品的质量，符合规定图谱的半成品及成品，属于合格产品，反之则为不合格产品。大曲生产过程包括用小麦为原料，经粉碎拌水后压制成砖块状的曲坯，入仓发酵 培养，此时的大曲称为入仓曲，经过一段时间进行第一次翻仓，得到第一次翻仓曲，再经过 第二次翻仓，得到第二次翻仓曲，出仓时称为出仓曲。制曲的生产过程如图5在制曲的每个周期取样，分别是母曲样品，入仓曲样品，一次翻曲样品，二次翻曲 样品，和出仓曲。为控制大曲生产过程的质量，本发明抽取在不同生产阶段的产品样品，进行DNA 提取并进行图谱测定，进而进行质量控制分析。样品的采集可以采集不同阶段的样品测定， 也可以不同阶段的样品混合在一起测定。为此，本发明提供一种酱香型白酒大曲生产过程中质量控制方法，所述方法包括 以下步骤步骤1，建立标准的合格的生产过程中的大曲样品的优势菌群的DGGE标准指纹图 谱；
步骤2，提取生产过程中大曲样品的总DNA，进行PCR扩增，测定DGGE指纹图谱；步骤3，比较上述两个图谱，符合属于合格产品，反之则为不合格产品。其中步骤1的测定方法如下1)取大曲不同生产阶段的合格样品；幻提取总DNA;3)以总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；4)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE标准指纹图谱；其中步骤2的测定方法如下1)取大曲不同生产阶段的合格样品；2)提取待测样品的总DNA ；3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；4)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE指纹图谱；其中所述提取总DNA，包括提取待测样品中真菌的总DNA和细菌的总DNA，真菌DNA提取方法是提取缓冲液提取两次；氯仿抽提一次；异丙醇沉淀过夜；离 心。其中提取缓冲液的加量是样品量的3-6倍，所加氯仿的体积与上清液的体积相同，异丙 醇加量是上清液体积的0. 6-0. 7倍。细菌DNA提取方法提取缓冲液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提两次； 异丙醇沉淀过夜。其中提取缓冲液的加量是样品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/ mL溶菌酶的加量分别是50-100μ 1和0. 5_lml，氯仿加量与上清液相同，异丙醇加量是上清 液体积的0. 6-0. 7倍。所述专用引物，对于真菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为GeoA2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll :5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘。PCR 扩增条件为巢式PCR扩增先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增； PCR反应条件为94°C预变性4min，然后在94°C变性45s, 50°C _55°C引物复性45s，72°C引 物延伸1. 5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s， 50-55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环30-35次，72°C终延伸IOmin0对于细菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为8-27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1378-1401R :5’-TACCTTGTTACGACTT-3，。PCR 扩 增条件为巢式PCR扩增先加入扩增16S rDNA全长的引物和反应体系进行扩增；PCR反 应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s，50°C -55°C引物复性45s，72°C引物延 伸1.5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s， 50-55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环30-35次，72°C终延伸IOmin0所述4)中，是对经过纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，银染后得到 DGGE指纹图谱；所述DGGE标准指纹图谱，是跟踪制曲生产过程，总结优质大曲生产过程中的 PCR-DGGE谱图，得出标准谱图。通过真菌和细菌的PCR-DGGE谱图，就可以比较准确的确定曲的质量，有利于指导生产。
图1酱香白酒制曲过程中优势细菌的PCR-DGGE标准谱2酱香白酒制曲过程中优势真菌的PCR-DGGE标准谱3样品真菌的PCR-DGGE谱4样品细菌的PCR-DGGE谱5制曲的生产流程
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1取一个生产周期的某一仓的大曲样品入仓曲，第一次翻仓曲，第二次翻仓曲，出 仓曲ο首先提取待测样品中真菌的总DNA和细菌的总DNA，真菌DNA提取方法是提取缓冲液提取两次；氯仿抽提一次；异丙醇沉淀过夜；离 心。其中提取缓冲液的加量是样品量的3-6倍，所加氯仿的体积与上清液的体积相同，异丙 醇加量是上清液体积的0. 6-0. 7倍。对于真菌总DNA的PCR扩增，其专用引物为 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll :5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘。PCR 扩增条件为巢式PCR扩增先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增； PCR反应条件为94°C预变性4min，然后在94°C变性45s, 50°C _55°C引物复性45s，72°C引 物延伸1. 5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s， 50-55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环30-35次，72°C终延伸IOmin0基因组DNA的纯化方法为采用美国OMEGA BIO-TEK公司生产的PCR产物纯化试剂 盒，按照用户使用说明来进行。真菌的PCR扩增及产物回收、纯化对纯化后的DNA进行PCR扩增，第一步扩增采用的引物为GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘和 Geo11 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘第二步扩增采用的引物为NS31-GC:5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3‘ Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3‘。以上引物全部由上海生工生物工程技术有限公司合成。先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，50 μ 1的PCR反 应体系组成如下=IOng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每种引物、1 μ 1 dNTPs、5 μ 1的 10 X PCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2U. 5-3U 的 Taq DNA 聚合酶，适量的双蒸水补足 50 μ 1。 PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s，50°C引物复性45s，72°C引物延伸 1. 5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA 为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s，55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环35次，72°C终延伸IOmin, 18S rDNA全长序列扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行 扩增，PCR反应条件为94°C预变性4min，然后在94°C变性45s，55°C引物复性45s，72°C引 物延伸lmin，循环35次，72°C终延伸lOmin，目的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓 冲液为IX TAE缓冲液。取全部样品进行2%琼脂糖凝胶电泳(80V，50min)，在紫外灯下切胶回收230bp的 目的条带，用CyCle-Pure DNA纯化试剂盒并按照试剂盒说明书对目的片段进行纯化，纯化 后取3ul纯化产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明获得了纯度较高的目的 片段。真菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)及凝胶成像扫描与分析采用DCODE 系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为将获得的样品的 18S扩增纯化产物(约230bp)混合，取200ng用10 %变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离 (丙烯酞胺浓度35-60%,电泳缓冲液0. 5 χ TAE, 80V，IOh)，然后切下目的泳道区域，用E. B 对变性聚丙烯酞胺凝胶染色，用Vilber凝胶成像扫描系统对银染条带进行照像，得到真菌 的PCR-DGGE谱图结果如图3所示，从图3中可以看出，本仓中曲的生产过程中真菌的优势菌群变化跟标准谱图是一 致的，说明本仓生产过程中真菌的变化是正常的，曲的质量是达标的。细菌DNA提取方法提取缓冲液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提两次； 异丙醇沉淀过夜。其中提取缓冲液的加量是样品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/ mL溶菌酶的加量分别是50-100μ 1和0. 5_lml，氯仿加量与上清液相同，异丙醇加量是上清 液体积的0. 6-0. 7倍。以待测样品的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对 目的片段进行回收及纯化。总DNA的提取及纯化称取5g 样品置 50ml 的三角瓶中，加 13. 5mL DNA 的 extraction buffer，加 20mg/ mL的蛋白酶KlOOul，25mg/mL的溶菌酶1ml，37 °C，225rpm，水平摇动30min，摇完后加入 4. 5ml 10%的SDS (加量是总体积的3% )，65°C水浴保育2h，每15-20min，缓慢摇动一次， 尽量打散，然后8000转室温离心lOmin，收集上清液，转到50ml离心管中，加入相同体积 的氯仿，离心收集水相，加0.6倍体积的异丙醇，-20°C沉淀过夜，然后12000转4°C离心 20min，收集沉淀，用70%冷乙醇冲洗(洗后离心才能去上清液)，吹干，用IXTE悬浮，定容 到 20-40ul。基因组DNA的纯化方法为采用美国OMEGA BIO-TEK公司生产的PCR产物纯化试剂 盒，按照用户使用说明来进行。3、PCR扩增及产物回收、纯化对纯化后的DNA进行PCR扩增，第一步扩增采用的引物为8-27F 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘和 1378-1401R :5 ‘ -TACCTTGTTACGACTT-3 ‘。第二步扩 增采用的引物为:968FGC 5' -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3，禾口 R1041 :5，-CGGTGTGTACAAGACCC-3，，以上引物全部由上海 生工生物工程技术有限公司合成。先加入扩增16S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，50 μ 1的PCR反应体系组成如下10ng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每种引 物、1μ 1 dNTPs、5y 1 的 10XPCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U 的 iTaq DNA聚合酶，适量的 双蒸水补足50μ 1。PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s，50°C引物复 性45s，72°C引物延伸1. 5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取其产物进行100倍稀释后 作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然 后在94°C变性45s，55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环35次，72°C终延伸IOmin, 16S rDNA全长序列扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测；取其产物进行100倍稀释后作 为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在 94°C变性45s，55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环35次，72°C终延伸IOmin,目的 产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为IXTAE缓冲液。将各样品16S rDNAv3区扩增纯化产物在10%聚丙烯变性胶中分离(丙烯酞胺浓 度 35% -60%，电泳缓冲液 0. 5-1 χ TAE)，100V, 12h，样品点样量 200ng DNA0跑样结束后，用快E. B染法对其进行染色。在vilber凝胶成像扫描系统中对染色 条带进行照像，得到细菌的PCR-DGGE谱图如图4图4中可以看出，本仓曲的生产过程中，细菌的优势菌群PCR-DGGE谱图跟标准谱 图基本一致，此生产过程中细菌的优势菌群是达标的。
权利要求
1.一种酱香型白酒大曲生产过程中质量控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤步骤1，建立标准的合格的生产过程中的大曲样品的优势菌群的DGGE标准指纹图谱；步骤2，提取生产过程中大曲样品的总DNA，进行PCR扩增，测定DGGE指纹图谱；步骤3，比较上述两个图谱，符合属于合格产品，反之则为不合格产品。
2.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，其中步骤1的测定方法如下1)取大曲不同生产阶段的合格样品；2)提取总DNA；3)以总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；4)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE标准指纹图谱。
3.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，其中步骤2的测定方法如下1)取大曲不同生产阶段的合格样品；2)提取待测样品的总DNA；3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；4)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，EB染色后得到DGGE指纹图谱；
4.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，其中所述提取总DNA，包括提取待测样品 中真菌的总DNA和细菌的总DNA。
5.权利要求4的质量控制方法，其特征在于，其中真菌DNA提取方法是提取缓冲液提 取两次；氯仿抽提一次；异丙醇沉淀过夜；离心，其中提取缓冲液的加量是样品量的3-6倍， 所加氯仿的体积与上清液的体积相同，异丙醇加量是上清液体积的0. 6-0. 7倍，细菌DNA提取方法提取缓冲液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提两次；异丙 醇沉淀过夜，其中提取缓冲液的加量是样品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/mL溶 菌酶的加量分别是50-100 μ 1和0. 5-lml，氯仿加量与上清液相同，异丙醇加量是上清液体 积的0. 6-0. 7倍。
6.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，其中所述专用引物，对于真菌总 DNA 的 PCR 扩增，其专用引物为 GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll 5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘，PCR扩增条件为巢式 PCR扩增先加入扩增 18S rDNA 全长的引物和反应体系进行第一步扩增；PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变 性45s，50°C _55°C引物复性45s，72°C引物延伸1. 5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取 其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件 为94°C预变性4min，然后在94°C变性45s，50_55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin, ff 环 30-35 次，72°C终延伸 IOmin0
7.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，其中对于细菌总DNA的PCR扩增，其专用 引物为 8-27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1378-1401R :5，-TACCTTGTTACGACTT-3，， PCR扩增条件为巢式PCR扩增先加入扩增16S rDNA全长的引物和反应体系进行扩增；PCR 反应条件为94 V预变性％iin，然后在94 °C变性45s，50 V -55 V弓丨物复性45s，72 °C引物 延伸1. 5min，循环30次，72°C终延伸IOmin ；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以16S rDNA V3可变区为目标进行扩增，PCR反应条件为94°C预变性％iin，然后在94°C变性45s， 50-55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环30-35次，72°C终延伸IOmin0
8.权利要求2或3的质量控制方法，其特征在于，其中所述4)中，是对经过纯化的目的 片段进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，银染后得到DGGE指纹图谱；
9.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，所述DGGE标准指纹图谱，是跟踪制曲生产 过程，总结优质大曲生产过程中的PCR-DGGE谱图，得出标准谱图。
10.权利要求1的质量控制方法，其特征在于，其中步骤1的测定方法如下通过真菌 和细菌的PCR-DGGE谱图，就可以比较准确的确定曲的质量，有利于指导生产。
全文摘要
本发明涉及一种白酒大曲的质量控制方法，特别是酱香型白酒大曲上产中通过对优势菌群的检测，控制白酒的质量。
文档编号C12Q1/68GK102071124SQ20091022870
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者张春辉, 李季, 李长文, 梁慧珍, 闫希军 申请人:贵州仁怀茅台镇金士酒业有限公司