专利名称：：一种提高磷脂酶活性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提高酶活性的方法，尤其是一种提高磷脂酶活性的方法。
背景技术：
：神经酰胺(Ceramide)是一种广泛存在于真核生物细胞中的脂类物质，作为细胞信号转导的第二信使，在介导细胞增殖、分化、细胞周期阻滞、细胞凋亡、以及细胞衰老等多种生理病理过程中具有广泛作用，与机体免疫和癌变等有密切关系，近年研究表明，神经酰胺还具有保湿、抗皱及防止过敏性皮炎的作用，是重要的化妆品原料，能保护皮肤免于物理，化学和生物的损伤。神经酰胺是人体代谢中一个非常重要的中间代谢物，具有广泛的作用，其中包括细胞表达、传递和细胞转变，这些作用反映到生物表体上，与免疫、癌变等都有密切的联系；另外，由于神经酰胺所具有的保水特性，使其成为用于护肤品和相关皮肤病治疗药物的关键原料，现有以化学合成来生产神经酰胺的方法成本极高，产品比黄金价格还高，从而使如何低成本且高效获得神经酰胺的方法成为该领域的研究热点。已有研究证实，采用生物方法利用磷脂酶水解鞘磷脂可获得神经酰胺。然而由于磷脂酶目前的价格相当高，因此如何提高磷脂酶的活性以提高神经酰胺的产量、提高反应体系的效率，成为该生物方法能否实际应用的关键，具有非常重要的生产实践意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高磷脂酶活性的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是—种提高磷脂酶活性的方法，采用波长为630nm-1064nm的光源对磷脂酶进行照射。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述波长为640nm-810nm。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述波长为808nm-810nm。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述波长为808nm。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述波长为激光照射产生或LED光源照射产生，即所述光源为激光光源或LED光源。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述对磷脂酶进行照射的时间为10-60分钟。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述对磷脂酶进行照射的时间为10分钟。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述对磷脂酶进行照射的光源能量在120J/cm2以上。优选的，上述提高磷脂酶活性的方法，所述对磷脂酶进行照射的光源能量为120-540J/cm2。本发明的有益效果是3所述提高磷脂酶活性的方法，发现采用波长为630nm-1064nm的光源对磷脂酶进行照射可以显著提高磷脂酶活性，提高反应速度，尤其是当波长在808-810nm附近时，对磷脂酶照射至少10分钟，对磷脂酶活性的提高效果最佳，这样便可以通过提高磷脂酶活性进而提高磷脂酶水解鞘磷脂获得神经酰胺的反应速度，从而提高了单位时间内神经酰胺的产量，具有非常重要的生产实践意义，适合规模化工业生产的需要。图1是神经酰胺浓度与反应时间的关系图；图2是不同波长光源照射对磷脂酶活性的影响示意图。具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1准备样品(1)准备鞘磷脂溶液(20mg/ml)，溶剂是氯仿:甲醇(2:1)，用之前在-2(TC条件下贮存；(2)根据总的底物量的需要，适量的以上溶液在N2下干燥，然后准备0.4mg/ml的鞘磷脂溶液，有机溶剂是乳酸乙酯己烷(50:50)，放在一个超声波振荡器中约10min，使其充分溶解；(3)该反应所用的酶是CP-PLC(TYPEI)[即，磷脂酶CI型](4.6U/ml的固体)，酶溶液在Tris-buffer(Tris缓冲液，包含25X乙醇，PH二8.6)中制备，浓度是O.104mg固体/ml(=0.4784U/ml);(4)200ii1的鞘磷脂溶液(底物溶液)和12ill酶溶液在室温下混合，开始反应，该反应需要振荡器充分振荡，反应时间是10min;(5)采样过程10min后从反应混合物中取出有机溶液100iU(有机相)，将样品迅速放入冰箱中(-20。C)。下面通过高灵敏度薄层色谱分析仪(HPTLC，SarstedtAg&Co，DESAGACD60，Germany)检测反应产物神经酰胺的浓度，来确定激光对磷脂酶活性的影响。激光处理不同反应物，激光通过圆孔垂直照射在试管上，照射面积lcm2。(1)不经过激光处理；磷脂酶和鞘磷脂混合反应；(2)激光只照射鞘磷脂；将磷脂酶与经过激光处理的底物鞘磷脂混合反应；(3)激光只照射磷脂酶；将激光处理过的磷脂酶与底物鞘磷脂混合反应；(4)激光照射磷脂酶和鞘磷脂的混合溶液(即反应过程中加激光照射)；(5)激光分别照射磷脂酶和鞘磷脂，然后将经过激光处理的磷脂酶和鞘磷脂混合反应。激光采用808nm，功率200mW，对上述不同反应物分别照射10min，结果见表一。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中A磷脂酶和鞘磷脂不经过激光照射；B底物鞘磷脂经过激光照射；C磷脂酶经过激光照射；D磷脂酶和鞘磷脂反应过程中加激光照射；E磷脂酶和鞘磷脂分别经激光照射，然后再混合反应。可见，采用单纯激光照射磷脂酶，可以最大程度的提高酶反应速度，但是对最终产物的量不会产生影响，即该方法只是提高反应速度，而不会改变产物性质和产量。实施例2确定最佳的激光参数(光学参数)采用808nm激光，功率200mW通过圆孔垂直照射在试管上，照射面积lcm2，分别照射磷脂酶0，1，3，5，10，20，30min，选出最佳的照射时间，结果见表二。表二<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>可见，随着激光照射时间的延长(能量的增加)，磷脂酶的活性逐渐提高，但是当能量提高到一定程度，磷脂酶的活性不再升高(称此为"饱和状态")，最后确定为照射10min的时候，磷脂酶的活性提高较稳定且持续，此时试管外激光照射的输出能量为120J/cmo实施例3采用808nm的激光，通过圆孔垂直照射在试管上，照射面积lcm2，分别采用不同的功率和照射时间，但是最后的能量一样(能量E=功率*时间，下表中600S00.9W表示0.9W的功率照射600秒，能量是540J.)，结果见表三。表三<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>可见，在光源波长相同的前提下，只要提供的能量相同，对磷脂酶活性的改变与所选择的激光功率没有关系。实施例4LED和激光对磷脂酶活性改变的实验分别采用810nm的LED和808nm的激光单独照射磷脂酶，照射面积lcm2，然后和鞘磷脂反应，检测神经酰胺的浓度，实验结果以(f±s)表示，结果见表四。表四<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>P>0.05808nm激光和810nmLED近似视为波长相同，从而揭示了只要波长相同，同时单位面积给的能量也相等，则对磷脂酶的活性影响几乎是一致的。可见，只要单位面积LED和Laser的能量相同，对磷脂酶的活性的改变是相同的。实施例5采用808nm的激光试管外进行照射，照射面积lcm2，输出能量为120J/cm2，在反应不同的时间后，检测产物神经酰胺的浓度，结果见表五、附图1。表五反应时间(min)神经酰胺的浓度(ng/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>可见，激光对磷脂酶活性的改变，仅仅改变了反应速度，产物神经酰胺的量并不会因此而改变。附图1中纵坐标表示反应产物神经酰胺的浓度(在这里以神经酰胺浓度间接表示反应速度)；横坐标表示反应时间(比如40分钟的时候，表示在40分钟的时候检测所得神经酰胺浓度)；Withlaserirradiation表示磷脂酶经过激光照射处理，然后和鞘磷脂混合反应；Nolaserirradiation表示磷脂酶没有经过激光照射处理，S卩和鞘磷脂混合反应。由实施例1已经证明激光处理磷脂酶对反应速度(即神经酰胺浓度)提高程度最大，从而间接证明激光单独照射磷脂酶对该酶的活性增强最大，此处再次得到证实，激光单独照射磷脂酶10-60分钟，神经酰胺浓度提高程度远远大于未经过激光照射的磷脂酶，从而说明了激光单独照射磷脂酶10-60分钟大大增强了磷脂酶的活性，提高了反应速度。实施例6采用鞘磷脂溶液200微升，加入磷脂酶溶液12微升，磷脂酶溶液的浓度是0.104毫克/毫升，1cm2面积光源照射能量在540J/cm2左右，在此条件下，采用不同波长的光源做对比实验，得到不同波长光源对磷脂酶活性的影响，结果见表六和附图2。表六相对活性改变计算公式如下一定波长的光源照射磷脂酶后神经酰胺的浓度-没有经过光源处理的神经酰胺的浓度没有经过光源处理的神经酰胺的浓度°可见，波长在630-1064nm，尤其在640_808nm附近的光源(激光或LED光源)对磷脂酶活性的提高效果明显，优选在808nm附近的光源对磷脂酶活性的提高效果最佳。附图2中纵坐标表示磷脂酶活性相对活度的提高百分比；横坐标表示波长；如图可清楚看出激光照射处理磷脂酶的最佳激光波长是808nm。综上所述，通过实施例l-6可以看出，采用波长为630nm-1064nm的光源，优选的波长为640nm-810nm的光源，更优选的波长为808nm-810nm的光源对磷脂酶进行照射可以显著提高磷脂酶活性，提高反应速度，尤其是当波长在808nm附近时，对磷脂酶照射10分钟，对磷脂酶活性的提高效果最佳，这样便可以通过提高磷脂酶活性进而提高磷脂酶水解鞘磷脂可获得神经酰胺的反应速度，从而提高了单位时间内神经酰胺的产量。上述参照具体实施方式对该一种提高磷脂酶活性的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。权利要求一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于采用波长为630nm-1064nm的光源对磷脂酶进行照射。2.根据权利要求l所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述波长为640nm-810nm。3.根据权利要求2所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述波长为808nm-810nm。4.根据权利要求3所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述波长为808nm。5.根据权利要求l-4之一所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述波长为激光照射产生或LED光源照射产生。6.根据权利要求l-4之一所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述对磷脂酶进行照射的时间为10-60分钟。7.根据权利要求6所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述对磷脂酶进行照射的时间为IO分钟。8.根据权利要求l-4之一所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述对磷脂酶进行照射的光源能量在120J/cm2以上。9.根据权利要求8所述的一种提高磷脂酶活性的方法，其特征在于所述对磷脂酶进行照射的光源能量为120-540J/cm2。全文摘要本发明提供了一种提高磷脂酶活性的方法，采用波长为630nm-1064nm的光源对磷脂酶进行照射可以显著提高磷脂酶活性，通过提高磷脂酶活性进而提高磷脂酶水解鞘磷脂获得神经酰胺的反应速度，从而提高了单位时间内神经酰胺的产量，具有非常重要的生产实践意义，适合规模化工业生产的需要。文档编号C12N13/00GK101717757SQ20091022818公开日2010年6月2日申请日期2009年11月12日优先权日2009年11月12日发明者布莱本·布克维,张红雨,张隆,徐学兵,李迎新,皮特·泰德蒙-里克腾伯格申请人:天津医科大学