专利名称：一种提高酶热稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高酶热稳定性的方法，特别是ー种利用双亲短肽融合表达提高重组酶的热稳定性的方法。
背景技术：
双亲短肽是具有亲水和亲油能力的小分子肽，广泛存在于膜蛋白及脂肪代谢相关酶类的结构中。其双亲的特点能够帮助酶分子与疏水性底物结合、实现酶分子的定位等。生物活性酶在エ业生产中具有广泛的应用，而提高酶的热稳定性是エ业酶的研究重点之一。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括I.定向进化通过定点突变，随即突变，饱和突变等技术，筛选得到热稳定的突变株；2.从嗜热微生物中筛选热稳定性的酶。但是，这些方法并不适用于所有酶分子热稳定性改造中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高酶热稳定性的方法，通过在重组酶的N端或C端融合表达双亲短肽实现酶热稳定性的提高。为解决上述技术问题提供如下技术方案第一歩双亲短肽基因的获得根据双亲短肽的氨基酸序列，化学合成相应的DNA序列，并将其克隆至大肠杆菌表达质粒pET-22b (+)的Nde I和Nco I酶切位点之间上，构建成为pET_22b (+) /AP质粒；第二步融合双亲短肽的重组酶表达质粒的构建将重组酶基因克隆至pET_22b(+)/AP质粒的Nco I和Hind III位点之间。构建成为表达融合双亲短肽的重组酶表达质粒pET-22b (+) /AP-enzyme。第三步融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建将重组质粒pET_22b (+)/AP-enzyme 转化宿主大肠杆菌(E. coli BL21(DE3)),构建高效表达目的酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌。菌株经培养表达目的酶的方法为培养基组成(g/L)种子培养基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5 ；发酵培养基将下列组分溶解在O. 9L水中蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油
zHnL ο ;各组分溶解后高压灭菌；冷却到60 °C，再加IOOmL灭菌的170mmol/LKH2P04/0. 72mol/LK2HP04 的溶液(2. 31g 的 KH2PO4 和 12. 54gK2HP04 溶在足量的水中，使终体积为IOOmL ;高压灭菌或用O. 22 μ m的滤膜过滤除菌)；培养方法种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37°C，摇床转速200r/min，培养12h ;发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37°C，当OD6tltl达到O. 6吋，将培养温度降为16°C，同时加入终浓度为I. OmM的诱导剂IPTG。目的酶热稳定的测定方法将目的酶分别应用疏水层析、离子交换层析等分离手段，得到电泳纯的目的酶。将目的酶在一定温度下保温，測定酶活相比初始末保温时损失50%所需要的时间(T1/2)。本发明提供了一种提高酶热稳定性的方法，应用双亲短肽融合表达重组酶能够提高目的重组酶的热稳定性。该方法具有效果显著、エ艺简单、便于推广。本发明为快速提高エ业酶热稳定性提高了新的方法和思路。
具体实施例方式
以下通过实施例来进ー步阐明本发明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。材料和方法所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂，DNA Marker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞E. coli JM109，引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生エ生物工程公司。实施例I :双亲短肽的氨基酸序列并克隆至质粒pET_22b (+)I AEAEAKAKAEAEAKAK2. VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR3. DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADffLKAFYDKVAEKLKEAF4. DffLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDffLKAFYDKVAEKLKEAF5. DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDffLKAFYDKVAEKLKEAF6. DffLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADffLKAFYDKVAEKLKEAF按照以上氨基酸序列通过化学合成DNA序列，并克隆至质粒pET_22b (+)等到质粒pET-22b(+)/AP实施例2 :重组质粒pET_22b (+) /AP-enzyme的构建将目的酶基因克隆至表达载体pET_22b(+)/AP的Nco I和Hind III位点。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下(I)无菌状态下取感受态细胞200 μ L置于无菌的微量离心管中；(2)每管加入1-2 μ L重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min ；(3)42°C热休克90s (准确)，不要摇动离心管；(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却l_2min ；(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800 μ L ;(6)用无菌铺菌器将200 μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板,37°C平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。实施例3 :融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。转化方法如下(I)无菌状态下取感受态细胞200 μ L置于无菌的微量离心管中；(2)每管加入1-2 μ L重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min ；(3)42°C热休克90s (准确)，不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却l_2min ；(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800 μ L ;(6)用无菌铺菌器将200 μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板,37°C平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，提取质粒验证，证明转化成功。实施例4 :发酵生产融合双亲短肽的脂肪氧合酶 脂肪氧合酶基因序列如Genebank NO:PAl 19所示,根据实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组脂肪氧合酶的表达菌株，以该菌株作为种子发酵生产重组脂肪氧合酶。培养基组成(g/L)种子培养基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。发酵培养基将下列组分溶解在O. 9L水中蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60 °C，再加IOOmL灭菌的170mmol/LKH2P04/0. 72mol/LK2HP04 的溶液(2. 31g 的 KH2PO4 和 12. 54g K2HPO4 溶在足量的水中，使终体积为100mL。高压灭菌或用O. 22 μ m的滤膜过滤除菌)。培养方法种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37°C，摇床转速200r/min，培养12h ;发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37°C，当OD6tltl达到O. 6吋，将培养温度降为16°C，同时加入终浓度为I. OmM的诱导剂IPTG，发酵24h。将发酵液15000rpm离心IOmin得到菌体,将菌体溶解于150mM Tris-Hcl,pH 7. 5的缓冲液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50°C下測定重组酶的热稳定性，如表I所示表I.融合双亲短肽提高脂肪氧合酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照[1 Γ 2 Γ 3 I' 4 I 56 '
Tl/2min(50°C ) 10 18 39 38 22 ' 252 _ 187 '实施例5 :发酵生产融合双亲短肽的碱性淀粉酶以实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组碱性淀粉酶的表达菌株，以该菌株作为种子发酵生产重组碱性淀粉酶。碱性淀粉酶基因序列如GenebankN0:HV220894. I 所示。培养基组成(g/L)种子培养基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。发酵培养基将下列组分溶解在O. 9L水中蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60 °C，再加IOOmL灭菌的170mmol/LKH2P04/0. 72mol/LK2HP04 的溶液(2. 31g 的 KH2PO4 和 12. 54gK2HP04 溶在足量的水中，使终体积为100mL。高压灭菌或用O. 22 μ m的滤膜过滤除菌)。
培养方法种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37°C，摇床转速200r/min，培养12h ;发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37°C，当OD6tltl达到O. 6吋，将培养温度降为16°C，同时加入终浓度为I. OmM的诱导剂IPTG，发酵24h。将发酵液15000rpm离心IOmin得到菌体,将菌体溶解于150mM Tris-Hcl,pH 7. 5的缓冲液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50°C下測定重组酶的热稳定性，如表2所示表2.融合双亲短肽提高碱性淀粉酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
权利要求
1.一种提高酶热稳定性的方法，其特征在于将双亲短肽与重组酶进行融合表达。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于所述双亲短肽融合在重组酶的N端或者C端。
3.权利要求I所述的方法，其特征在于双亲短肽的序列为I) AEAEAKAKAEAEAKAK ；或 2) VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR ；或 3) DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADffLKAFYDKVAEKLKEAF ；或 4) DffLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDffLKAFYDKVAEKLKEAF ；或 5) DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDffLKAFYDKVAEKLKEAF ； 或 6DWLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADWLKAFYDKVAEKLKEAF ;中的一种。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于优选双亲短肽的序列为DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDffLKAFYDKVAEKLKEAF。
全文摘要
本发明公开了一种提高酶热稳定性的方法，通过将双亲短肽与重组酶进行融合表达获得热稳定性的提高的重组酶。其中优选的双亲短肽的序列为DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶热稳定性提高了新的方法和思路。
文档编号C12N9/02GK102660570SQ201210145190
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘松, 堵国成, 张娟, 陆信曜, 陈坚 申请人:江南大学