专利名称：一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法
技术领域：
本发明是用酶法降解壳聚糖与膜分离相结合生产高生理活性壳寡糖的技术。
壳寡糖是指在β-1,4位结合有2-10个葡糖胺的一种低聚糖，它具有抑制肿瘤生长，增强机体免疫力，降低血液中胆固醇的能力；能促进双歧杆菌增殖，抑制肠道有害菌的生长；它还具有阻碍病原菌的生长繁殖，增强植物对病虫害的防御能力，因而被广泛用于医药，保健食品和农业中。此外还用于化学工业作为絮凝剂、分离膜、酶固定化载体等。壳寡糖通常由壳聚糖降解而获得，目前主要采用酸降解、氧化降解和酶降解法，壳寡糖的分离提取通常采用活性炭、硅藻土、活性炭-氟镁石或离子交换膜电渗析技术。这些方法虽然可以实现活性壳寡糖的有效分离，但由于操作繁杂，污染严重，成本高而影响大规模生产。
本发明的目的在于提供一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，采用这种技术生产壳寡糖，无活性的单糖和二糖生成量低，活性寡糖收率高，污染小，生产成本低，实现反应和分离连续操作，适合于规模生产。
本发明提供了一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于生产过程如下(1)以酶降解壳聚糖制备壳寡糖；(2)采用中空纤维或平板超滤器与降解反应结合原位即时分离出活性寡糖；(3)再用纳滤器过滤超滤液，分离出高浓度活性壳寡糖。
本发明中所述酶降解过程可以是将0.5-3.0％重量壳聚糖溶在醋酸溶液中，降解用酶是几丁质酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、壳聚糖酶，或其复合物，酶相对壳聚糖的用量为0.5-3.0％重量；反应温度15-60℃，pH3.0-7.0。
所述超滤过程可以是当反应液黏度降至40～50％后，将酶解液从反应釜泵入膜分离器中，膜分离器以超滤模式操作，膜的切割分子量为2000-10000，小于膜切割分子量的分子透过膜，未透过部分返回反应釜继续酶解。
所述纳滤过程可以是将透过超滤器的酶解液泵入纳滤器，纳滤器选择卷式平板膜，膜对MgSO4的截留率为80-95％，单糖、二糖和大量水透过膜，未透过部分为活性壳寡糖的浓缩液。
本发明的反应分离藕合操作方式，可以是连续操作，也可以是间歇操作，原料补加方式，可以是间歇补料，也可以是连续补料，间歇补料是在膜分离器排出一定量后，向反应釜中加入等体积的原料液，连续补料在膜分离器滤出的同时向反应釜中滴加原料液，但补加速率须与滤出速率相等。
本发明所采用的膜超滤器可以是商用的中空纤维或平板型超滤膜分离器，也可自行构建加工由各种材料制成的超滤膜组成的各种形式的膜分离器。膜的孔径以透过相应分子量的壳寡糖为准则，但必须截留酶分子。通常为2000-10000。
本发明所用纳滤膜分离器，可以是商用的卷式平板膜或自行设计的各种形式纳滤膜器，膜的选择以透过单糖和二糖，水和醋酸为准则，通常选用对MgSO4截留率为80-95％的膜。
本发明与现有的批次降解后层析分离比较，具有如下优点1、采用酶法降解壳聚糖与膜分离相藕和可以使活性壳寡糖即时得到分离，有效地抑制了它在酶作用下进一步降解为无活性壳寡糖。
2、降解酶可连续重复使用，提高了酶的使用效率。
3、通过选择不同孔径的膜和调控操作条件可以获得不同聚合度的壳寡糖。
4、过程简捷，减少了分离过程引起的污染，提高了分离效率。过程可连续进行，有利于实现工业化生产。
总之，本发明将膜分离技术与酶法降解壳聚糖相结合，即采用中空纤维或平板膜超滤器对降解反应液原位分离，及时分离出具有生理活性的壳寡糖，有效地控制活性壳寡糖在酶作用下的进一步降解，也可以防止降解产物对反应的抑制作用，由于实现连续操作，酶可重复使用，提高降解酶的使用效率。超滤膜的滤出液再经纳滤，除去低聚合度的无活性的寡糖和大量的水，使超滤液得到浓缩，获得生理活性高的某聚合度范围的壳寡糖产品。
下面通过实例对本发明的技术进一步说明实施例1壳聚糖的酶降解反应将0.5-3.0％的壳聚糖溶于醋酸缓冲液中(pH 5.6,0.05M)，加入一定量的酶，酶∶底物=1∶20，在15-60℃下反应，以反应液黏度下降的百分率表征各种酶的降解活性。用平氏黏度计测定初始和降解12小时后反应液通过测量段的下降时间t0、t，则壳聚糖黏度下降的百分率为t0-t/t0。
各种酶降解壳聚糖活性
实施例2酶降解反应与膜分离的耦合实验在不锈钢反应釜中，将1％的壳聚糖溶于20L的1％醋酸溶液中，1％(对壳聚糖)的壳聚糖酶加入到反应体系中，40℃搅拌1小时后，黏度下降至40-60％开始超滤，超滤器为膜面积2m2的中空纤维膜滤器，切割分子2000-10000，采用间歇补料，共补料6批，超滤滤出液20L。14L超滤液用2的卷式平板膜纳滤器处理，膜对MgSO4截留率为80-95％，膜面积0.5m2，得浓缩液2L，滤出液12L，浓缩液的时间飞行质谱如附图
所示。图中标记的数字峰为壳寡糖的聚合度，主要是3-8糖，10糖以上仅含微量。
实施例3 间歇补料与连续补料实验反应总体积20L，试验条件与实施例2相同，投料1小时后开始超滤，同时以等速连续补加原料和醋酸，超滤滤出液60L，经过纳滤得浓缩液1.8L，在间歇补料与连续补料中，不同聚合度壳寡糖所占比例见下表，连续补料使3-4糖相对量降低，而6-8糖相对量增加。
间歇补料与连续补料中，3-10糖的相对量
权利要求
1．一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于生产过程如下(1)以酶降解壳聚糖制备壳寡糖；(2)采用中空纤维或平板超滤器与降解反应结合原位即时分离出活性寡糖；(3)再用纳滤器过滤超滤液，分离出高浓度活性壳寡糖。
2．按照权利1所述酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于所述酶降解过程是将0.5-3.0％重量壳聚糖溶在醋酸溶液中，降解用酶是几丁质酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、壳聚糖酶，或其复合物，酶相对壳聚糖的用量为0.5-3.0％重量；反应温度15-60℃，pH3.0-7.0。
3．按照权利1所述酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于所述超滤过程是当反应液黏度降至40～50％后，将酶解液从反应釜泵入膜分离器中，膜分离器以超滤模式操作，膜的切割分子量为2000-10000，小于膜切割分子量的分子透过膜，未透过部分返回反应釜继续酶解。
4．按照权利1所述酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于所述纳滤过程是将透过超滤器的酶解液泵入纳滤器，纳滤器选择卷式平板膜，膜对MgSO4的截留率为80-95％，单糖、二糖和大量水透过膜，未透过部分为活性壳寡糖的浓缩液。
5．按照权利1、2、3或4所述酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于反应与分离连续操作，或者间歇操作。
6．按照权利5所述酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，其特征在于连续操作时原料连续补料或间歇补料。
全文摘要
一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法,其特征在于生产过程如下:(1)以酶降解壳聚糖制备壳寡糖;(2)采用中空纤维或平板超滤器与降解反应结合原位即时分离出活性寡糖;(3)再用纳滤器过滤超滤液,分离出高浓度活性壳寡糖。本发明实现了反应分离一体化,防止了活性寡糖的二次降解。由于过程实现连续操作,降解酶可以连续使用,提高了效率,降低了成本,有利于实现产业化。
文档编号C07H3/00GK1302809SQ00110009
公开日2001年7月11日 申请日期2000年1月5日 优先权日2000年1月5日
发明者杜昱光, 张铭俊, 王毓福, 曲天明, 张虎, 白雪芳, 虞星炬 申请人:中国科学院大连化学物理研究所