新型微生物壳聚糖酶的研究技术的制作方法
【专利摘要】新型微生物壳聚糖酶的研究技术，研究的是大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，一般以壳聚糖为诱导物它们的降解产物为阻遏物，因此当以壳聚糖作为唯一碳源时,微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。根据此理论,筛选产壳聚糖酶微生物多采用“透明圈平板法”：即采用以壳聚糖为唯一碳源和氮源的固体培养基平板进行富集培养,限制大多数不能利用壳聚糖的微生物生长,而能产生壳聚糖酶的微生物由于能利用壳聚糖的降解产物进行生长繁殖。由于壳聚糖被微生物降解,于是在白色不透明胶体壳聚糖平板上能够产壳聚糖酶的微生物的菌落周围就会形成一个透明圈,通过比较透明圈直径和菌落直径的比值,就可以初步定量的确定产壳聚糖酶活力的大小。由于天然菌株产壳聚糖酶的能力一般较低,现在大多都使用诱变育种。
【专利说明】新型微生物壳聚糖酶的研究技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及新型微生物壳聚糖酶的研究技术，具体的说，是一种减少能源浪费的方法，属于环保领域。
【背景技术】
[0002]壳聚糖(Chitosan，简称CTS)学名为聚(1，4) _2_氨基_2_脱氧-β-D-葡萄糖，是甲壳素脱乙酰化而得到的一种生物高分子，是目前唯一商品化的碱性多糖。由于壳聚糖具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性，因此在农业、医疗卫生等方面有广泛的用途[I]。但是壳聚糖的分子量大，水溶性较差，在人体内不易吸收，使其应用受到限制。近年来研究发现壳聚糖的降解产物壳寡糖(Ch10ligosaccharides)具有独特的生理功能，如抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿等显著特点，使其有着更为广阔的应用前景。酶法制备壳寡糖由于具有条件温和、无污染，酶解产物较易控制等优点，成为当前甲壳素学科中最重要的一个分枝。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于，解决大多数微生物产壳聚糖酶的活性低，生产过程中酶活损失大，因此造成壳寡糖生产成本相对较高，影响壳聚糖酶的工业应用。
[0004]发酵液经离心去菌体、(NH4)2S04盐析、Q-Sepharose FastFlow阴离子交换、SephacrylS-1OO凝胶过滤后，SDS-PAGE电泳显示只有I条带，酶的分子质量为66200u，纯化倍数为28.9倍，收率为47.6%。Aktuganov等[15]对Bacillussp.739产的壳聚糖酶进行了分离纯化研究:发酵液经离心、(NH4) 2S04盐析、DEAE-S印hadexA-50阳离子交换层析后，活性蛋白在SDS-PAGE上仅呈I条带，酶分子质量为46000U。孙菲等[16]对菌株JHOl产的壳聚糖酶进行了分离纯化:发酵液经抽滤、浓缩、DEAE Cellulose 52离子交换层析后，在SDS-PAGE上只有I条蛋白质谱带，分子质量是30000 U，酶回收率为66.3%，纯化倍数为
11.70 倍。
[0005]由于大多数微生物产壳聚糖酶的活性低，在生产过程中酶活损失大，因此造成壳寡糖生产成本相对较高，影响壳聚糖酶的工业应用。经过固定化后的壳聚糖酶其稳定性得到了提高，并可循环使用，在壳聚糖酶的研究中，固定化是一个重要的方向。潘晓榕等[17]采用吸附交联法对假单胞菌(Pseudomonas) CUY8产壳聚糖酶固定时,最佳pH值为4.0,最佳温度65°C，米氏常数为14.71mg/ml半衰期为45d ;采用包埋法活得的壳聚糖酶的最佳pH值为5.5，最佳温度35°C，米氏常数为5.91mg/ml半衰期为37d.。固定后的壳聚糖酶较游离酶相比有明显优势。段彬等[18]固定化细胞产酶的研究结果表明，多孔玻璃可以有效吸附无花果沙雷氏菌(Serrratia.ficaria CH-0203)菌细胞,在最适发酵条件下(pH 6.5,培养基与载体的总体积48mL，载体与培养基的比例为1.5g/4.0mL，吸附时间是2(T26h)，发酵液酶活达到4.5 U/mL，比游离细胞发酵提高了 16 % ;采用半连续发酵的方式，固定化的细胞可以稳定发酵产酶120 h左右。固定化细胞产酶的效率大大高于游离细胞。
【具体实施方式】
[0006]本发明新型微生物壳聚糖酶的研究技术，在农业生产中，壳寡糖可以诱导植物产生光谱抗性，增强植物自身的防卫能力。抑制多种病源微生物的生长；还可以作为新型植物生长调节剂，促进植物生长，提高发芽率和抗病性。Hzdwiger和Beckman研究发现,豌豆的内果皮内含有的壳聚糖酶能够降解F.solan1.f.sp.pisi和F.solan1.f.sp.phaseoli的细胞壁生成壳聚糖和壳寡糖，对F.solan1.f.sp.pisi和F.solan1.f.sp.phaseoli具有杀菌作用，并且还可以作为激发子，诱导植物产生植保素[19]。裘迪红等[20]的研究发现，用低聚壳聚糖处理水稻、玉米，出芽率和产量都明显上升。用壳聚糖处理冬小麦种子，可增产5°/Γ30%，品质也有提高，如蛋白质增加3.36%，湿面筋增加21.5%，干面筋增加20%。
【权利要求】
1.新型微生物壳聚糖酶的研究技术，其特征在于，壳聚糖酶是降解壳聚糖的专一性酶，将壳聚糖降解为低分子量的壳寡糖，即由2?10个氨基葡萄糖通过β -1, 4-糖苷键连接而成的低聚糖，壳寡糖以其独特的生物学功能，在食品、农业、医药等领域有着广泛的用途。
2.根据权利要求1所述的新型微生物壳聚糖酶的研究技术，其特征在于，壳寡糖可作为人体肠道的微生态调节剂，服用壳寡糖能使肠道内的双歧杆菌、乳杆菌等有益军的数量明显增高；壳寡糖具有爽口的甜味，不易被体内消化液吸收，具有很好的保湿性和耐热性，几乎不产生热量，是糖尿病人理想的功能性甜味剂；壳寡糖还具有很好的防腐性，可作为食品防腐剂；由于低聚壳聚糖有许多亲水的游离胺基及羟基，对水有很高的亲和力和持水性，因此可永固果蔬的保鲜，起到保湿，增湿和防腐的作用。
3.根据权利要求1所述的述新型微生物壳聚糖酶的研究技术，其特征在于，在农业生产中，壳寡糖可以诱导植物产生光谱抗性，增强植物自身的防卫能力。
4.根据权利要求1所述的述新型微生物壳聚糖酶的研究技术，其特征在于，在医药方面，小分子壳寡糖具有优良的抗肿瘤活性，特别是六聚糖具有很强的抑制肿瘤的作用。
【文档编号】C12N9/42GK104419693SQ201310403882
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】王维烨 申请人:天津市聚贤科技孵化器有限公司