一种中国对虾dwd抗菌肽分子的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，还公开了该DWD抗菌肽在制备抗菌蛋白与蛋白酶抑制剂蛋白方面的应用。利用本发明制备的重组中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）抗菌肽能够直接抑制常见细菌的生长，而且可以抑制细菌生长过程中分泌的蛋白酶的活性，可以在食品抗菌生物试剂、医用抗生素替代品方面具有较大的应用前景。
【专利说明】—种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域(DWD)的抗菌肽分子的制备方法，以及这种DWD抗菌肽分子的抑菌活性与蛋白酶抑制剂活性的应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]长期以来，在我国食品和药品行业存在着一个难以解决的问题，那就是食品行业和医药行业广泛使用的保鲜剂、抗菌剂、抗生素带来的严重后果。食品行业目前广泛使用的保鲜剂、抗菌剂多数属于化学药品和试剂，这些化学药品和试剂与食品的包装存在于一个空间，一旦被人体吸收将造成十分不良的后果；医药行业被广泛使用的抗生素，目前已经暴露出了滥用抗生素从而不断刺激病菌浸染和致病能力增强的后果，因此，在食品和药品行业寻找绿色、安全、对人体健康没有影响的生物类抗菌物质，已经是一个科学研究的热点问题了。
[0003]在动物的进化史上，低等的动物不像我们人类具有特别发达的后天获得性免疫系统，它们仅仅具有一个固有的、特定的先天免疫系统，正是因为这个较为低等的先天免疫系统的防御功能，才使得数量众多的、进化地位低等的无脊椎动物进化到今天仍然存在于地球上，这也说明了这个低等的先天免疫系统防御功能的强大之处。通过不断研究，存在于低等无脊椎动物体内先天免疫系统的神秘面纱逐渐被揭开，原来在先天免疫系统中主要存在着细胞免疫和体液免疫两种方式，当病毒、细菌、真菌入侵这类动物机体的时候，这两种免疫途径几乎是同时发挥功能的。其中，值得一提的是先天免疫系统体液免疫途径中的抗菌肽分子是清除入侵细菌和真菌的主要免疫效应分子，而且，抗菌肽分子几乎是体液免疫途径中多种信号传导途径的最后表达出来的那个执行清除功能的效应分子，针对革兰氏阳性细菌、针对革兰氏阴性细菌以及针对真菌入侵的各种信号传导途径，通过免疫刺激信号的逐级传递和放大，最终激活了相关抗菌肽基因的转录与翻译，从而形式抗菌功能。因此，抗菌肽分子表达量的高低，直接关系到病原是否能够被彻底清除。
[0004]在众多抗菌肽分子中，有一类分子比较特别，这类抗菌肽分子的典型特点就是存在着由8个半胱氨酸残基形成的4对二硫键而折叠形成的一个球状实体结构域,这个结构域被称为乳清酸性蛋白结构域，简称WAP结构域，在不同的分子中WAP结构域的数量有所不同，常见的是存在一个和两个WAP结构的抗菌肽分子。这类具有乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽分子在发挥清除细菌作用的过程，主要是通过分子的活性位点针对细菌细胞壁的特殊结构进行破坏，从而引起细菌细胞壁产生“漏洞”将细胞内溶物释放出来，引起细菌自身的死亡，所以，这类抗菌肽的抗菌活性具有广泛的作用范围。所以，这类抗菌肽具有如下的优点:第一，作用范围广。第二，作用条件温和。第三，不会引起细菌的抗药性问题。第四，对人体无危害，因为它属于蛋白质物质，进入人的肠道之后便可被蛋白酶彻底水解形成氨基酸营养物质。
[0005]中国对虾是我国稀有的水产产品，集中分布在我国东部沿海，也是我国主要的水产经济动物。中国对虾在进化过程中，面临白斑综合症病毒以及各种细菌的侵染能够保持以较大的数量分布在我国东部沿海水域，说明其抗病毒、抗细菌、抗真菌能力特别强大。因此，如果将中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域(DWD)的抗菌肽在体外进行重组表达，获得具有抗菌活性和蛋白酶抑制剂活性的重组分子，它在食品抗菌、医用抗生素替代方面具有较大的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域(DWD)抗菌肽的制备方法，同时提供该DWD抗菌肽抑菌活性和蛋白酶抑制剂活性的研究方法。
[0007]技术解决方案:
[0008]本发明的具体方法如下:
[0009]I)中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆:取冷冻保存的中国对虾3只-5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg-150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，具体方法参照试剂盒说明书。之后，以lyL-2yL中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作为扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的一对引物，PCR反应的程序为:94°C预变性3min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，获得中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液；
[0010]2)中国对虾DWD抗菌肽基因的原核表达载体的构建:取步骤(I)的中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16 μ L，进行内切酶EcoR I和Xho I的双酶切处理，20 μ L的体系中基因表达片段为16 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，同时，取大肠杆菌pET_28a质粒载体溶解液10 μ L进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，20 μ L的体系中质粒载体溶解液为10 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer缓冲液为2 μ L，无菌水6 μ L，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6 μ L，双酶切处理后的大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液2 μ L，再加T4DNA连接酶I μ L和IOX ligationbuffer缓冲液I μ L，在16°C金属浴中进行10h_12h连接，获得连接产物；
[0011]3)转化大肠杆菌克隆菌株DH5CI感受态细胞与阳性克隆子的筛选:将步骤(2)的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，主要是利用“热激法”进行转化，要求卡那霉素的最终质量体积浓度为25 μ g/ μ L，将固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物 DWD-F:5'-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB液体培养基震荡培养10h-12h，获得阳性菌株菌液；
[0012]4)质粒提取:取步骤(3)的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行质粒提取，具体提取方法可以参照试剂盒说明书，获得阳性重组质粒;
[0013]5)转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞与阳性表达菌株的筛选:将步骤(4)的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞(TaKaRa公司产品)，要求卡那霉素的最终质量体积浓度为25 μ g/μ L，将固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基表面的单个白色菌落，以前引物 DWD-F:5'_tac tea gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5'-tactea ctc RaR tct gcg ctt agacgg act g-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行液体震荡培养10h_12h，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rp m-200rpm，培养12h_14h，获得阳性表达菌株菌液；
[0014]6)中国对虾DWD抗菌肽的诱导表达与亲和纯化:将步骤(5)的阳性表达菌株菌液作为诱导表达的母液，从中取ImL菌液在无菌条件下转接到一瓶IOOmL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.3mmol/L,诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后，6000rpm低速离心收集菌体，用20mLlXPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎50min (功率200w,超声破碎Is、间歇2s,全程50min),结束后12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行重组蛋白质的亲和纯化，方法可以参照试剂盒说明书，最后根据蛋白质电泳的结果合并洗脱液，得到目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液；
[0015]7)中国对虾DWD抗菌肽液体抑菌功能检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对IXPBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次IXPBS缓冲液，透析液经过12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行液体抑菌功能检测，方法为:选择大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为液体抑菌试验的菌种，将这些菌种事先进行3mL-5mL的LB液体培养基过夜活化10h-12h，之后，分别取ImL菌液放入洁净的1.5mL eppendof离心管中作为对照样品，分别另取ImL菌液放入洁净的1.5mL eppendof?离心管中作为液体抑菌管，之后要在液体抑菌管里面加入100 μ L的经过滤膜过滤处理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm条件下摇菌培养5h-6h，之后利用分光光度计测定OD595的数值，最后以对照管的OD595作为对照，利用excel分析软件进行数据处理，并且利用t-test检验方法分析显著性差异；
[0016]8)中国对虾DWD抗菌肽蛋白酶抑制剂活性的检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液之后利用截留孔径为3500Da的透析袋对IXPBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次IXPBS缓冲液，透析液经过12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行蛋白酶抑制剂活性的检测，具体方法为:首选在生长繁殖过程中能够分泌蛋白酶的细菌——枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性细菌)和绿脓杆菌(革兰氏阴性细菌)，在LB固体培养基上划线37°C过夜培养(不加抗生素)，然后用经过灭菌的牙签挑去细菌的单克隆，在同一个固体脱脂奶粉培养基(配方为1%的脱脂奶粉与1%的琼脂)上按照十字对角的方式分别接种四个单菌落，在上面覆盖一个经过灭菌的滤纸小圆片(直径为8mm-10mm)，然后，预留一个小圆片作为空白对照，在其他3个小圆片上分别滴加经过滤膜过滤除菌的DWD重组蛋白透析液、过滤除菌的I XPBS缓冲液、过滤除菌的BSA蛋白溶液(与DWD重组蛋白透析液的蛋白质浓度相同)，28°C条件下过夜培养，观察透明圈出现的情况。
[0017]本发明的优点:本发明涉及的一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，通过大肠杆菌原核表达系统重组表达的DWD抗菌肽分子，能够抑制细菌的生长，也可以抑制细菌生长过程分泌的蛋白酶的活性，可以成为抗生素的良好替代产品，因此，在食品抗菌、医用抗生素替代方面具有较大的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]附图1为重组中国对虾DWD抗菌肽蛋白的诱导表达与亲和纯化的蛋白电泳结果图；
[0019]附图2为重组中国对虾DWD抗菌肽蛋白的液体抑菌结果图；
[0020]附图3为重组中国对虾DWD蛋白的枯草芽孢杆菌分泌性蛋白酶活性抑制结果图；
[0021]附图4为重组中国对虾DWD蛋白的绿脓杆菌分泌性蛋白酶活性抑制结果图。
【具体实施方式】
`[0022]实施例1:中国对虾DWD抗菌肽的重组表达与液体抑菌活性检测
[0023]图1中，I为诱导前大肠杆菌总蛋白，2为诱导后大肠杆菌总蛋白，3为纯化后的重组中国对虾DWD抗菌肽蛋白，4为标准蛋白质分子量。
[0024]图2中，I为大肠杆菌对照组，2为大肠杆菌抑菌试验组，3为绿脓杆菌对照组，4为绿脓杆菌抑菌试验组，5为金黄色葡萄球菌对照组，6为金黄色葡萄球菌抑菌试验组，7为白色念珠菌对照组，8为白色念珠菌抑菌试验组，*表示数据之间存在显著性差异。
[0025]I)中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆:取冷冻保存的中国对虾3只_5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg-150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，具体方法参照试剂盒说明书。之后，以lyL-2yL中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作为扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的一对引物，PCR反应的程序为:94°C预变性3min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，方法为:将切下的胶带放入洁净的1.5mL离心管中，加入400 μ L solution SN溶解液，在55°C -65°C条件下孵育5min-10min,间隔要求每间隔Imin晃动一次离心管，使胶带充分溶解，之后将3S柱放回同一个收集管中，继续加入500 μ L Wash Solution洗脱溶液，IOOOOrpm离心Imin,倒去收集管中的废液，重复洗脱一次，倒去收集管中的废液，将3S柱放回同一个收集管中，IOOOOrpm离心2min，将洗涤液充分去掉，将3S柱放入一个新的灭菌的RNase-Freel.5mL洁净的离心管中，加入20 μ L-30 μ L无RNA酶的灭菌水，在超净工作台中室温条件下放置2min，并且使离心管盖子敞开，最后，IOOOOrpm条件下离心Imin,将目的产物收集在离心管中，获得DWD抗菌肽基因表达片段溶解液；
[0026]2)中国对虾具DWD抗菌肽基因的原核表达载体的构建:取步骤(I)的DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16 μ L，进行内切酶EcoR I和Xho I的双酶切处理，20 μ L的体系中基因表达片段为16 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，同时，取大肠杆菌pET_28a质粒载体溶解液10 μ L进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，20 μ L的体系中质粒载体溶解液为10 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各I μ L，IOXH Buffer缓冲液为2 μ L，无菌水6 μ L，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6 μ L，双酶切处理后的大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液2 μ L，再加T4DNA连接酶I μ L和IOX ligationbuffer缓冲液I μ L，在16°C金属浴中进行连接10h_12h，获得连接产物；
[0027]3)转化大肠杆菌克隆菌株DH5ci感受态细胞与阳性克隆子的筛选:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，主要是利用“热激法”进行转化，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μ g/μ L，固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DffD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac teaetc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB液体培养 基震荡培养10h-12h，获得阳性克隆菌株菌液；
[0028]4)质粒提取:取步骤(3)的阳性克隆菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行质粒提取，具体提取方法为:按照质粒提取试剂盒的要求，取阳性克隆菌株菌液ImL,在6000rpm条件下低速离心3min-5min,去掉上清，收集细胞沉淀，并且室温条件下立即加入试剂盒中的Solution I溶液300yL (此溶液需要存放在4°C环境)，马上用涡旋震荡器将细胞沉淀充分振荡混匀，继续加入试剂盒中的Solution II溶液300 μ L,要求轻轻混勻至液体清亮，室温条件下静置3min-5min,之后继续缓慢加入试剂盒中的Solution III溶液300 μ L,要求立即混勻，放在冰浴中5min_10min后在室温条件下，12000rpm高速离心5min-10min,并且将上清转移到新的1.5mL洁净的离心管中，并且加入等体积的异丙醇，充分混匀之后再冰浴中放置5min-10min，室温条件下10000rpm-12000rpm离心10min-15min后，去掉上清,用70%乙醇溶液洗漆沉淀2次-3次，室温条件下10000rpm-12000rpm离心5min-10min,弃去上清,室温条件下在超净工作台中干燥质粒沉淀，最后，加入20 μ L-30 μ L灭菌水进行溶解，获得阳性重组质粒；
[0029]5)转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞与阳性表达菌株的筛选:将步骤(4 )的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3 )感受态细胞(TaKaRa公司产品)，那霉素的最终质量体积浓度为25 μ g/ μ L，将固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后弓 I物 DWD-R:5 -tac tea ctc gagtct gcg ctt aga egg actg-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质粒体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行液体震荡培养，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm,培养12h-14h，获得阳性表达菌株菌液；
[0030]6)中国对虾DWD抗菌肽的诱导表达与亲和纯化:将步骤(5)的阳性表达菌株菌液作为诱导表达的母液，从中取ImL菌液在无菌条件下转接到一瓶IOOmL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.3mmol/L,诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后，6000rpm低速离心收集菌体，用20mLlXPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎50min (功率200w,超声破碎Is、间歇2s,全程50min),结束后12000rpm高速离心收集上清液，取3mL-5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行重组蛋白质的亲和纯化，方法为:取出4°C条件下在20%酒精溶液中保存的His-tag凝胶亲和柱，在室温下将酒精流通至胶面之后，用3倍-5倍柱体积的去离子水充分洗柱，再用3倍-5倍柱体积的I XPBS缓冲液充分洗脱柱子，然后用5倍-10倍柱体积的试剂盒中的I X charge Buffer溶液流通洗柱,再用3倍-5倍柱体积的I Xbinding Buffer溶液流通洗柱，之后就是反复上样，要求用3mL-5mL超声波破碎后的高速离心上清液反复流通柱子3次-5次，目的是让重组蛋白与柱子凝胶颗粒充分结合，之后，用5倍-10倍柱体积的I Xbinding Buffer溶液缓慢流通柱子,用3倍-5倍柱体积的I Xwash Buffer溶液缓慢流通柱子来除掉杂蛋白，之后，用6mL的I X elute洗脱溶液进行样品的洗脱，并且用6只1.5mL eppendof离心管收集蛋白洗脱液,每管收集ImL,纯化结果用质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后根据蛋白质电泳的结果合并洗脱液，得到目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液；
[0031]7)中国对虾DWD抗菌`肽液体抑菌功能检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对IXPBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次IXPBS缓冲液，透析液经过12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行液体抑菌功能检测，方法为:选择大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为液体抑菌试验的菌种，将这些菌种事先进行3mL-5mL的LB液体培养基过夜活化10h-12h，之后，分别取ImL菌液放入洁净的1.5mL eppendof离心管中作为对照样品，分别另取ImL菌液放入洁净的1.5mL eppendof?离心管中作为液体抑菌管，之后要在液体抑菌管里面加入100 μ L的经过滤膜过滤处理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm条件下摇菌培养5h-6h，之后利用分光光度计测定OD595的数值，最后以对照管的OD595作为对照，利用excel分析软件进行数据处理，并且利用t-test检验方法分析显著性差异，试验结果如图2所示；
[0032]实施例2:中国对虾DWD抗菌肽的重组表达与蛋白酶抑制剂活性检测
[0033]图3中，I为滤纸片上不加任何物质的对照，2为加15 μ LlXPBS的对照，3为加15 μ L BSA蛋白透析液对照，4为加15 μ L重组DWD蛋白透析液。
[0034]图4中，I为滤纸片上不加任何物质的对照，2为加15 μ LlXPBS的对照，3为加15 μ L BSA蛋白透析液对照，4为加15 μ L重组DWD蛋白透析液。
[0035]I)中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆:取冷冻保存的中国对虾3只-5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg-150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，具体方法参照试剂盒说明书。之后，以lyL-2yL中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg aga ggcccg cta aag c_3 和后弓丨物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt agaegg act g-3'作为扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的一对引物，PCR反应的程序为:94°C预变性3min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，方法为:将切下的胶带放入洁净的1.5mL离心管中，加入400 μ L solution SN溶解液，在55°C -65°C条件下孵育5min-10min,间隔要求每间隔Imin晃动一次离心 管，使胶带充分溶解，之后将3S柱放回同一个收集管中，继续加入500 μ L Wash Solution洗脱溶液，IOOOOrpm离心Imin,倒去收集管中的废液，重复洗脱一次，倒去收集管中的废液，将3S柱放回同一个收集管中，IOOOOrpm离心2min，将洗涤液充分去掉，将3S柱放入一个新的灭菌的RNase-Freel.5mL洁净的离心管中，加入20 μ L-30 μ L无RNA酶的灭菌水，在超净工作台中室温条件下放置2min，并且使离心管盖子敞开，最后，IOOOOrpm条件下离心Imin,将目的产物收集在离心管中，获得DWD抗菌肽基因表达片段溶解液；
[0036]2)中国对虾具DWD抗菌肽基因的原核表达载体的构建:取步骤(I)的DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16 μ L，进行内切酶EcoR I和Xho I的双酶切处理，20 μ L的体系中基因表达片段为16 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，同时，取大肠杆菌pET_28a质粒载体溶解液10 μ L进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，20 μ L的体系中质粒载体溶解液为10 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，无菌水6 μ L，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6 μ L，双酶切处理后的大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液2 μ L，再加T4DNA连接酶I μ L和IOX ligationbuffer缓冲液I μ L，在16°C金属浴中进行过夜连接10h_12h，获得连接产物；
[0037]3)转化大肠杆菌克隆菌株DH5ci感受态细胞与阳性克隆子的筛选:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，主要是利用“热激法”进行转化，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μ g/μ L，固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DffD-F:5 -tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac teaetc RaR tct gcg ctt aga egg actg-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB液体培养基震荡培养10h-12h，获得阳性克隆菌株菌液；[0038]4)质粒提取:取步骤(3)的阳性克隆菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行质粒提取，具体提取方法为:按照质粒提取试剂盒的要求，取阳性克隆菌株菌液ImL,在6000rpm条件下低速离心3min-5min,去掉上清，收集细胞沉淀，并且室温条件下立即加入试剂盒中的Solution I溶液300 μ L (此溶液需要存放在4°C环境)，马上用涡旋震荡器将细胞沉淀充分振荡混匀，继续加入试剂盒中的Solution II溶液300 μ L,要求轻轻混勻至液体清亮，室温条件下静置3min-5min,之后继续缓慢加入试剂盒中的Solution III溶液300 μ L,要求立即混勻，放在冰浴中5min_10min后在室温条件下，12000rpm高速离心5min-10min,并且将上清转移到新的1.5mL洁净的离心管中，并且加入等体积的异丙醇，充分混匀之后再冰浴中放置5min-10min，室温条件下10000rpm-12000rpm离心10min-15min后，去掉上清,用70%乙醇溶液洗漆沉淀2次-3次，室温条件下10000rpm-12000rpm离心5min-10min,弃去上清,室温条件下在超净工作台中干燥质粒沉淀，最后，加入20 μ L-30 μ L灭菌水进行溶解，获得阳性重组质粒；
[0039]5)转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞与阳性表达菌株的筛选:将步骤(4 )的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3 )感受态细胞(TaKaRa公司产品)，那霉素的最终质量体积浓度为25 μ g/ μ L，将固体LB培养基平板在37°C条件下过夜培养10h-12h，之后，挑取固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD-F:
5-tactca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物DWD-R:5 -tac tea ctc gagtct gcg ctt aga egg actg-3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质粒体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行液体震荡培养，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm,培养12h-14h，获得阳性表达菌株菌液；
[0040]6)中国对虾DWD抗菌肽的诱导表达与亲和纯化:将步骤(5)的阳性表达菌株菌液作为诱导表达的母液，从中取ImL菌液在无菌条件下转接到一瓶IOOmL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50μ g/mL，在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.3mmol/L,诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后，6000rpm低速离心收集菌体，用20mLlXPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎50min (功率200w,超声破碎Is、间歇2s,全程50min),结束后12000rpm高速离心收集上清液，取3mL-5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行重组蛋白质的亲和纯化，方法为:取出4°C条件下在20%酒精溶液中保存的His-tag凝胶亲和柱，在室温下将酒精流通至胶面之后，用3倍-5倍柱体积的去离子水充分洗柱，再用3倍-5倍柱体积的I XPBS缓冲液充分洗脱柱子，然后用5倍-10倍柱体积的试剂盒中的I X charge Buffer溶液流通洗柱,再用3倍-5倍柱体积的I Xbinding Buffer溶液流通洗柱，之后就是反复上样，要求用3mL-5mL超声波破碎后的高速离心上清液反复流通柱子3次-5次，目的是让重组蛋白与柱子凝胶颗粒充分结合，之后，用5倍-10倍柱体积的I Xbinding Buffer溶液缓慢流通柱子,用3倍-5倍柱体积的I Xwash Buffer溶液缓慢流通柱子来除掉杂蛋白，之后，用6mL的IXelute洗脱溶液进行样品的洗脱，并且用6只1.5mL eppendof离心管收集蛋白洗脱液,每管收集ImL,纯化结果用质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后根据蛋白质电泳的结果合并洗脱液，得到目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液；
[0041]7)中国对虾DWD抗菌肽蛋白酶抑制剂活性的检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对I XPBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次IXPBS缓冲液，透析液经过12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行蛋白酶抑制剂活性的检测，具体方法为:首选选择在生长繁殖过程中能够分泌蛋白酶的细菌——枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性细菌)和绿脓杆菌(革兰氏阴性细菌)，在LB固体培养基上划线37°C过夜培养(不加抗生素)，然后用经过灭菌的牙签挑去细菌的单克隆，在同一个固体脱脂奶粉培养基(配方为1%的脱脂奶粉与1%的琼脂)上按照十字对角的方式分别接种四个单菌落，在上面覆盖一个经过灭菌的滤纸小圆片(直径为8mm-10mm)，然后，预留一个小圆片作为空白对照，在其他3个小圆片上分别滴加经过滤膜过滤除菌的DWD重组蛋白透析液、过滤除菌的I XPBS缓冲液、过滤除菌的BSA蛋白溶液(与DWD重组蛋白透析液的蛋白质浓度相同)，28°C条件下过夜培养，之后，观察透明圈出现的情况，试验结果如图3和图4所示。·
【权利要求】
1.一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，其特征在于:包含以下步骤: .1)中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆:取中国对虾3只-5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg-150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，之后，以I μ L-2 μ L中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，进行PCR反应来扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，获得中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液； . 2)中国对虾DWD抗菌肽基因原核表达载体的构建:取步骤(I)的中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16 μ L，进行内切酶EcoR I和Xho I的双酶切处理，20 μ L的体系中基因表达片段为16 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，同时，取大肠杆菌pET_28a质粒载体溶解液10 μ L进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，.20 μ L的体系中质粒载体溶解液为10 μ L，内切酶EcoR I和Xho I各lyL，10XH Buffer缓冲液为2 μ L，无菌水6 μ L，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6 μ L，双酶切处理后的大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液2 μ L，再加T4DNA连接酶I μ L和IOX ligationbuffer缓冲液I μ L，在16°C金属浴中进行连接10h_12h，获得连接产物； . 3)转化大肠杆菌克隆菌株DH5ci感受态细胞与阳性克隆子的筛选:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5 α感受态细胞(TaKaRa公司产品)，主要是利用“热激法”进行转化，卡那霉素的最终质量体积浓度为25 μ g/ μ L，固体LB培养基平板在37°C条件下培养10h-12h，之后，挑去固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD-F:5'-tactea gaattc acg aga ggc ccg cta aag c_3 和后引物 DWD-R:5 -tac tea ctc gag tctgcg ctt aga egg act g_3'作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，.72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min_10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB液体培养基震荡 培养10h-12h，获得阳性克隆菌株菌液； 4)质粒提取:取步骤(3)中的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，获得阳性重组质粒； 5)转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞与阳性表达菌株的筛选:将步骤(4)的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μ g/μ L，固体LB培养基要求在37°C条件下过夜培养10h_12h，之后，挑去固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD-F:5'-tac tea gaa ttcacg agaggc ccg cta aag c_3 和后弓丨物DWD-R:5 -tac tea ctc gag tct gcg ctt aga eggact g-3'作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸5min-10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行液体震荡培养，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm，培养12h_14h，获得阳性表达菌株菌液； 6)中国对虾DWD抗菌肽的诱导表达与亲和纯化:将步骤(5)的阳性表达菌株菌液作为诱导表达的母液，从其中取ImL菌液在无菌条件下转接到一瓶IOOmL新鲜的液体LB培养基中，要求卡那霉素的最终质量体积浓度为50 μ g/mL,在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.1mmol/L-0.5mmol/L,诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后,6000rpm低速离心收集菌体，用20mLlXPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min,结束后10000rpm-12000rpm高速离心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化，最后根据蛋白质电泳的结果合并洗脱液，得到目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液； 7)中国对虾DWD抗菌肽液体抑菌功能检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对I XPBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次I XPBS缓冲液，透析液经过10000rpm-12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行液体抑菌功能检测； 8)中国对虾DWD抗菌肽蛋白酶抑制剂活性的检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对I XPBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次I XPBS缓冲液，透析液经过10000rpm-12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行蛋白酶抑制剂活性的检测。
2.根据权利要求1所述的一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，其特征在于:以前引物 DWD-F:5'-tac tea gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c_3' 和后引物 DWD-R:5 -tac tea ctcgag tct gcg ctt aga egg act g-3作为扩增中国对奸DWD抗菌妝基因表达片段的一对引物，PCR反应的程序为:94°C预变性3min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 45s，最后 72°C后延伸 5min_10min。
3.根据权利要求1所述的一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，其特征在于:选择大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为液体抑菌试验的菌种，将这些菌种事先进行3mL-5mL的LB液体培养基过夜活化10h_12h，之后，分别取ImL菌液放入洁净的1.5mL eppendof离心管中作为对照样品，分别另取ImL菌液放入洁净的1.5mL eppendof离心管中作为液体抑菌管，之后要在液体抑菌管里面加入100 μ L的经过滤膜过滤处理的DWD抗菌肽透析后上清液，在37°C、180rpm-200rpm条件下摇菌培养5h_6h，之后利用分光光度计测定OD595的数值，最后以对照管的OD595作为对照，利用excel分析软件进行数据处理，并且利用t-test检验方法分析显著性差异。
4.根据权利要求1所述的一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，其特征在于:首选在生长繁殖过程中能够分泌蛋白酶的细菌——枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性细菌)和绿脓杆菌(革兰氏阴性细菌)，在LB固体培养基上划线37°C过夜培养(不加抗生素)，然后用经过灭菌的牙签挑去细菌的单克隆，在同一个固体脱脂奶粉培养基(配方为1%的脱脂奶粉与1%的琼脂)上按照十字对角的方式分别接种四个单菌落，在上面覆盖一个经过灭菌的滤纸小圆片(直径为8mm-10mm)，然后，预留一个小圆片作为空白对照，在其他3个小圆片上分别滴加经过滤膜过滤除菌的DWD重组蛋白透析液、过滤除菌的IXPBS缓冲液、过滤除菌的BSA蛋白溶液(与DffD重组蛋白透析液的蛋白质浓度相同)，28 °C条件下过夜培养，观察透明圈出现的情况。
【文档编号】C12Q1/02GK103451188SQ201310403797
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杜志强, 王金星, 赵小凡, 张雪峰, 王建英 申请人:内蒙古科技大学