专利名称：基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种新的核酸扩增方法，尤其涉及一种基于dl修饰引物和内 切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，可以用于等温扩增目标核酸，属于基因 工程技术领域。
背景技术：
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种有着众多应用 的常规分子生物学技术。常规PCR主要由三步反应组成1)目标核酸模板分子 的热变性，2)自由引物与变性的目标核酸模板分子间的杂交退火，3)热稳定 性DNA聚合酶催化结合在目标核酸模板分子上的引物的DNA合成反应。常规 PCR的三步反应重复循环进行，实现目标核酸的指数倍数扩增。常规PCR需要 昂贵的热循环仪。等温PCR是一种新型核酸扩增技术，不需要热循环仪。在等 温PCR中，引物与目标核酸模板分子经变性退火，形成互补配对的引物-模板复 合物，在恒定温度(一般是DNA聚合酶的最适反应温度)下由DNA聚合酶催 化DNA合成反应的持续进行。等温PCR需要在DNA合成过程中持续地自动生 成引物-模板复合物(DNA合成反应的有效底物)，以使DNA合成反应能够持续 进行。由于等温PCR不依赖于热循环仪，可以在水浴锅中进行反应，操作空间 大，可以方便的扩大反应体积与通量。
目前常用的等温PCR主要有两种基于滚环复制的等温PCR和基于loop 结构引物的等温PCR [Nucleic Acids Res., 2006， 34:e98; Genome Res., 2001， 11:1095-1099; Nucleic Acids Res., 2000， 28:e63.]。其中基于滚环复制的等温PCR 根据DNA聚合酶的差异，分为phi 29 DNA聚合酶催化的等温PCR和T7 DNA 聚合酶催化的等温PCR。在phi 29 DNA聚合酶催化的等温PCR中，正向引物结 合于环状单链目标核酸模板分子，在37度下phi 29 DNA聚合酶以滚环复制的形 式置换合成长的单链DNA，反向引物结合于滚环复制合成的长的单链DNA，合 成长度各异的双链DNA。与phi29DNA聚合酶类似，T7 DNA聚合酶也以环状 DNA为模板，利用正向引物与反向引物，在37度下合成长度各异的众多双链 DNA。基于loop结构引物的等温PCR以线性DNA为模板，利用4条引物，最 终合成各种长度的双链DNA。
现有等温PCR技术的缺陷主要有1)扩增产物为长度各异的双链DNA混 合物，需要用限制性内切核酸酶消化来形成长度均一的DNA片段;2)phi 29 DNA 聚合酶与T7 DNA聚合酶催化的等温PCR只能扩增长度比较短的环状目标核酸 模板分子，且常常产生非特异性扩增条带；3)虽然基于loop结构引物的等温 PCR可以扩增高度复杂的线状DNA分子，但其扩增片段的长度有限， 一般低于 250 bp; 4)基于loop结构引物的等温PCR需要两对引物，扩增反应操作复杂， 任何一对引物引发的DNA合成反应的失败均会造成目标核酸扩增的失败。
发明内容
本发明的目的在于针对现有等温PCR技术的不足，提供一种基于dl修饰引 物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，该等温PCR操作简便，扩增效 率、扩增片段长度和特异性大大提高，可用于等温扩增长度均一的目标核酸片 段。
为实现这样的目的，本发明通过内切核酸酶V与dl修饰引物实现引物-模板 复合物的再生。在本发明中，用于扩增目标核酸的正向引物与反向引物具有如 下特征整条引物与目标核酸模板分子完全配对，5'端第10-30位含有1-5个dl 核苷酸，dl核苷酸下游具有10-30个核苷酸。等温PCR反应组分包括dl修饰的 正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP共4禾中 脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解 螺旋酶。等温PCR混合物经过最初的热变性、杂交退火后，在恒定温度下进行 PCR。在扩增过程中由内切核酸酶V实现引物-模板复合物的循环再生，引发DNA 合成反应；单链DNA结合蛋白与解螺旋酶可以提高等温PCR的目标核酸扩增 效率。
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本发明方法的具体步骤如下
1、 设计合成用于扩增目标核酸的正向引物与反向引物，正向引物与反向引 物的序列特征是整条引物与目标核酸模板分子完全配对，5'端第10-30位含有 1-5个dl核苷酸，dl核苷酸下游具有10-30个核苷酸；
2、 将用于扩增目标核酸片段的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、 以及dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP共四种脱氧核糖核苷三磷酸加入PCR缓冲液， 配置成无蛋白组分的等温PCR混合物；将DNA聚合酶(例如phi29 DNA聚合 酶、T7DNA聚合酶、没有5'外切酶活性的测序级Taq DNA聚合酶或5'外切酶 活性缺失的Bst DNA聚合酶的Klenow大片段等)、内切核酸酶V、单链DNA 结合蛋白和解螺旋酶共四种蛋白质，以1-5个单位5-500纳克50-10000纳克 5-500纳克的比例混合，根据四种蛋白质的热稳定性，配成等温PCR常温蛋白混 合物或等温PCR耐高温蛋白混合物；
3、 将无蛋白组分的等温PCR混合物在95度热变性5-10分钟，然后降温至 25-37度范围内放置5分钟，进行引物与目标核酸模板分子的杂交退火，形成引 物-模板复合物；然后加入等温PCR常温蛋白混合物，于25-37度范围内进行等 温PCR，反应时间l-24小时;
或者，将无蛋白组分的等温PCR混合物与等温PCR耐高温蛋白混合物直接 混合在一起，在95度热变性5-10分钟，然后降温至42-72度范围内进行等温PCR， 反应时间l-24小时；
4)将等温PCR后的混合物置于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶中，200V条 件下电泳20分钟，检测目标核酸扩增产物。
本发明与现有的等温PCR和热循环PCR技术相比有显著的进步。主要优点 如下(1)扩增反应在25-37度或42-72度范围内的某一恒定温度进行，不需要 热循环仪。(2)利用内切核酸酶V与dl修饰引物实现了引物-模板复合物的循 环再生，再生的引物-模板复合物的DNA合成反应效率与热循环PCR相当。(3) 目标核酸以线性与指数扩增形式同时扩增，扩增速度高于常规PCR。 (4)目标 核酸扩增产物特异性高，虽然dl修饰引物可能在目标核酸模板分子的多处区域
发生部分配对，但只有引物与模板分子完全配对时才能够产生PCR。 (5)目标 核酸扩增片段长度均一，由于在扩增过程中不形成扩增片段的重复串联体，因 此目标核酸扩增片段长度均一。(6)解螺旋酶与单链DNA结合蛋白使得DNA 合成速度与效率大大提高。(7)操作简便、结果稳定，由于不需要热循环仪来 生成引物-模板复合物，也就不需要优化多个目标核酸同时扩增所需要的通用退 火温度，极大的方便了多个目标核酸的同时扩增。(8)操作通量大，在整个操 作过程中不需要热循环仪，仅需要水浴锅这一恒温加热装置，因此可以方便的 增加目标核酸的扩增反应数目和反应体积，进行目标核酸的大规模高产量扩增。 本发明可用于扩增双链目标核酸和RNA反转录的cDNA等单链目标核酸。 扩增反应不需要昂贵的热循环仪来再生引物-模板复合物，操作简便、所需仪器 设备简单，大大扩大了目标核酸扩增的应用场所。主要应用于微生物检测、基 因克隆、法医鉴定等领域。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构 成对本发明的限定。
以下实施例利用5'端第19位为dl修饰核苷酸的正向引物与反向引物，在 DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶的共同作用下， 完成目标核酸的扩增。
实施例1 pUC18质粒中的氨苄青霉素抗性基因的等温PCR扩增
本实施例中的目标核酸模板分子是质粒pUC18，待扩增的目标核酸是质粒 pUC18的氨苄青霉素抗性基因，使用的四种常温蛋白质为phi 29 DNA聚合酶、 大肠杆菌内切核酸酶V、 T7噬菌体的单链DNA结合蛋白和解螺旋酶。具体实 施步骤如下
第一步，设计合成用于扩增质粒pUC18的氨苄青霉素抗性基因的引物序列。 2条引物分别为pUC18-amp-F、 pUC18-amp-R。 2条引物碱基序列如下 pUC18-amp-F: 5, aatattgaaa aaggaagaxt atgagtattc aacatttccg t
pUC18-amp-R: 5' gagtaaactt ggtctgacxg ttaccaatgc ttaatcagtg a
其中，符号X表示dI修饰核苷酸，整条引物与pUC18质粒载体的氨苄青 霉素抗性基因的两端互补配对。引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA 合成公司合成。
第二步，等温PCR混合物的制备。等温PCR混合物由两部分构成无蛋 白组分的等温PCR混合物和由四种蛋白组成的等温PCR常温蛋白混合物。无蛋 白成分的等温PCR混合物组成(40微升)正向引物与反向引物，1.0 ^M;目 标核酸模板分子，5纳克pUC18质粒；dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 200 ^M; 10xphi29DNA聚合酶反应缓冲液，4微升；补加去离子水至总体积为40微升。 四种蛋白构成的等温PCR常温蛋白混合物组成phi 29DNA聚合酶，2.5个单
位；大肠杆菌内切核酸酶V， 50纳克；T7噬菌体单链DNA结合蛋白，500纳 克；T7噬菌体解螺旋酶，50纳克；10xphi29DNA聚合酶反应缓冲液，1微升； 补加去离子水至总体积为IO微升。
第三步，等温PCR混合物的热变性、退火和等温PCR反应。将40微升的 无蛋白组分的等温PCR混合物在95度热变性5-10分钟，然后降温至37度保温 5分钟，使dl修饰引物与pUC18质粒杂交配对，形成最初的引物-模板复合物； 然后加入10微升等温PCR常温蛋白混合物，最终的等温PCR混合物(50微升) 在37度温浴2小时，进行等温PCR的DNA持续合成。
第四步，氨卞青霉素抗性基因扩增结果检测。将等温PCR后的混合物置于 质量浓度为1%的琼脂糖凝胶，凝胶中添加了终浓度为0.5微克/毫升的溴化乙啶。 利用水平电泳仪，在200V电压下电泳20分钟，在紫外光下或凝胶成像系统中 观测氨卞青霉素抗性基因扩增结果，氨卞青霉素抗性基因扩增产物为861 bp的 DNA片断。
等温PCR扩增目标核酸的原理第一步，热变性-退火形成引物-模板复合 物、DNA聚合酶(催化DNA合成反应)与内切核酸酶V (催化引物-模板复合 物的循环再生)的共同作用生成大量单链目标核酸分子；第二步，第一步生成 的单链目标核酸分子与自由引物配对形成新的弓1物-模板复合物，弓I发指数形式 的DNA合成反应，生成大量的单链目标核酸分子；第三步，随着自由引物的
大量减少，以及合成的单链目标核酸分子的大量增加，单链目标核酸分子彼此 杂交配对形成双链DNA扩增产物。单链DNA结合蛋白可以结合反应过程中生 成的大量单链目标核酸分子，使其处于单链状态；解螺旋酶促进引物-模板复合 物起始的DNA合成过程中双链DNA的解链；单链DNA结合蛋白和解螺旋酶 的共同作用可以提高等温PCR的目标核酸扩增效率。
实施例2衣原体基因组中内切核酸酶IV基因的等温PCR扩增
本实施例中的目标核酸模板分子是衣原体基因组DNA，待扩增的目标核酸 是衣原体的内切核酸酶IV基因，使用的四种耐高温蛋白质为TaqDNA聚合酶， 耐高温微生物T. thermophilus的内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶。 具体实施步骤如下
第一步，设计合成用于扩增衣原体内切核酸酶IV基因的引物序列。2条引 物分别为CpendoIV-F、 CpendoIV-R。 2条引物碱基序列如下
CpendoIV-F: 5， agaaaagacc ttgaaattxt atgaaagtac ttcctcctcc c CpendoIV-R: 5， aaaagcactt aaaaaactxc ctaactatct ctgttttttg a
其中，符号X表示dI修饰核苷酸，整条引物与衣原体的内切核酸酶IV基 因两端互补配对。引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合 成。
第二步，等温PCR混合物的制备。等温PCR混合物由无蛋白组分的等温 PCR混合物和等温PCR耐高温蛋白混合物二者混合而成。最终的等温PCR混合 物组成(50微升)正向引物与反向引物，l.OpM;目标核酸模板分子，50纳克 衣原体基因组DNA; dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 200 ^M; TaqDNA聚合酶， 2.5个单位；T. thermophilus的内切核酸酶V, 50纳克；T. thermophilus的单链 DNA结合蛋白，500纳克；T. thermophilus的解螺旋酶，50纳克；10xTaqDNA 聚合酶反应缓冲液，5微升；补加去离子水至总体积为50微升。
第三步，等温PCR混合物的热变性、退火和等温PCR反应。将50微升的 等温PCR混合物在95度热变性5-10分钟，然后降温至60度左右，并在水浴锅 中继续温浴2个小时，进行等温PCR的DNA持续合成。
第四步，衣原体内切核酸酶IV基因扩增结果检测。将等温PCR后的混合 物置于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶，凝胶中添加了终浓度为0.5微克/毫升的溴 化乙啶。利用水平电泳仪，在200V电压下电泳20分钟，在紫外光下或凝胶成 像系统中观测衣原体内切核酸酶IV基因扩增结果，衣原体内切核酸酶IV基因 扩增产物为882 bp的DNA片断。
实施例3人防御素a3mRNA的等温PCR扩增
本实施例中的模板是人总RNA反转录的总cDNA，待扩增的目标核酸是人 防御素a3cDNA基因，使用的四种常温蛋白质为噬菌体T7 DNA聚合酶(结合 了大肠杆菌硫氧还蛋白)、T7单链DNA结合蛋白、T7解螺旋酶和大肠杆菌内切 核酸酶V。
在利用本发明的等温PCR扩增人防御素a3 cDNA基因之前，需要预先通过 反转录反应制备人总cDNA。反转录反应组成100ul反转录反应混合物中含有 人总RNA3微克，lx反转录缓冲液，0.5mM的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 2 pM的oligo—dT寡核苷酸引物，10个单位的RNase A抑制剂，10个单位M-MLV 反转录酶。于37度反应60分钟。柱层析除去没有掺入的脱氧核糖核苷三磷酸， 回收总cDNA，并溶于100 ul水，测定总cDNA浓度。
本发明方法具体实施步骤如下
第一步，设计合成用于扩增人防御素ct3编码基因的引物序列。2条引物分 别为DEFA3-F、 DEFA3-R。 2条引物碱基序列如下
DEFA3-F: 5' gaggatctgt gaccccagxc atgaggaccc tcgccatcctt DEFA3-R: 5， atttttcttt ttctgcaaxc tcagcagcag aatgcccaga g
其中，符号X表示dl修饰核苷酸，整条引物与人防御素a3编码基因的cDNA 两端互补配对。引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。
第二步，等温PCR反应混合物的制备。等温PCR反应混合物由两部分构 成无蛋白组分的等温PCR混合物和等温PCR常温蛋白混合物。无蛋白组分的 等温PCR混合物组成(40微升)正向引物与反向引物，1.0 ^M;目标核酸模 板分子，50纳克人总cDNA; dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP， 200 nM; 10xT7DNA
聚合酶反应缓冲液，4微升；补加去离子水至总体积为40微升。等温PCR常温 蛋白混合物组成T7DNA聚合酶，2.5个单位；大肠杆菌内切核酸酶V， 50纳 克；T7单链DNA结合蛋白，500纳克；T7解螺旋酶，50纳克；10xT7DNA聚 合酶反应缓冲液，l微升；补加去离子水至总体积为10微升。
第三步，等温PCR反应混合物的热变性、退火和等温PCR反应。将40微 升的无蛋白组分的等温PCR混合物在95度热变性5-10分钟，然后降温至37度 继续保温5分钟，使dl修饰引物与人防御素a3的cDNA目标核酸模板分子杂交 配对，形成最初的引物-模板复合物；然后加入IO微升的等温PCR常温蛋白混 合物，在37度温浴2个小时，进行等温PCR的DNA持续合成。
第四步，人防御素a3 cDNA基因扩增结果检测。将等温PCR后的混合物 置于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶，凝胶中添加了终浓度为0.5微克/毫升的溴化 乙啶。利用水平电泳仪，在200V电压下电泳20分钟，在紫外光下或凝胶成像 系统中观测人防御素a3 cDNA基因扩增结果，人防御素a3 cDNA基因扩增产物 为285bp的DNA片断。
权利要求
1、一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，其特征在于包括以下步骤1)设计合成用于扩增目标核酸的正向与反向引物序列，正向引物与反向引物的序列特征是整条引物与目标核酸模板分子完全配对，5’端第10-30位含有1-5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30个核苷酸；2)将用于扩增目标核酸片段的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、以及dATP、dTTP、dCTP、dGTP共四种脱氧核糖核苷三磷酸加入聚合酶链式反应缓冲液，配置成无蛋白组分的等温聚合酶链式反应混合物；将DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶共四种蛋白质，以1-5个单位5-500纳克50-10000纳克5-500纳克的比例混合，根据四种蛋白质的热稳定性，配成等温聚合酶链式反应常温蛋白混合物或等温聚合酶链式反应耐高温蛋白混合物；3)将无蛋白组分的等温聚合酶链式反应混合物在95度热变性5-10分钟，然后降温至25-37度范围内放置5分钟，进行引物与目标核酸模板分子的杂交退火，形成引物-模板复合物；然后加入等温聚合酶链式反应常温蛋白混合物，于25-37度范围内进行等温聚合酶链式反应，反应时间1-24小时；或者，将无蛋白组分的等温聚合酶链式反应混合物与等温聚合酶链式反应耐高温蛋白混合物直接混合在一起，在95度热变性5-10分钟，然后降温至42-72度范围内进行等温聚合酶链式反应，反应时间1-24小时；4)将等温聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1％的琼脂糖凝胶中，200V条件下电泳20分钟，检测目标核酸扩增产物。
全文摘要
本发明涉及一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，扩增目标核酸的引物与模板完全配对，5＇端第10-30位含有1-5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30个核苷酸。等温PCR反应组分包括dI修饰的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、dATP、dTTP、dCTP、dGTP共4种脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶。等温PCR混合物经过最初的热变性、杂交退火后，在恒定温度下进行PCR。扩增过程中由内切核酸酶V实现引物-模板复合物的循环再生，引发DNA合成反应；单链DNA结合蛋白与解螺旋酶可提高等温PCR效率。本发明目标核酸的扩增不依赖于热循环仪，操作简便，可用于目标核酸的大规模高产量扩增。
文档编号C12N15/09GK101182514SQ20071004795
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者刘喜朋, 刘建华 申请人:上海交通大学