专利名称：检测超级细菌的环介导等温扩增引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于疾病检测试剂技术领域，具体涉及一种用于检测超级细菌NDMl基因的环介导等温扩增引物及试剂盒。
背景技术：
自然界中存在大量的天然耐药基因，这些基因本来处于原始宿主体内复杂的代谢调控网络中，扮演着信号传导、基因调控的作用。但当它们通过基因水平转移进入新的宿主体内后，由于这些耐药基因很难融入新宿主体内的代谢网络，它的功能发生了变化，表现为对抗生素的耐药性。而人类的抗生素滥用、环境污染，如同筛选压力，选择并进化这些整合有耐药基因病菌，使得后者最终成为超级细菌。而NDMl基因是超级细菌的关键致病基因，在该基因的作用下，超级细菌具备了超强的耐药性能。NDMl基因经研究发现可以通过质粒载体的形式，在不同种类的致病菌体内转移，随着菌体数量的扩繁实现倍增。2010年，在全球范围内多个国家出现了由超强耐药细菌引起的重症感染疾病，该种细菌能够抵抗目前最广义、最强大的抗生素的治疗，使重症患者的治疗无从下手，形成了无药可医的严重局面。经过研究表明，在多种超级细菌体内发现了一种神秘的未知共性基因，而促成多种病原菌也就是超级细菌具备强大耐药性的因素就是这种后来被命名为NDMl基因。更为严重的是，初步判断NDMl基因存在于细菌的质粒上，能够在微生物中自由传播。研究还发现，这种NDMl广泛的存在于印度和巴基斯坦的病例中。携带有该耐药基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，对目前绝大多数抗生素包括内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素都具有耐药性。NDMl能借助质粒在微生物间发牛“水平基因转移”，可能造成该病菌的全球蔓延。目前的病例也证实，NDMl耐药菌病例呈现从南亚向欧洲蔓延的态势。而在现有的检测方法中，一般只是通过药敏实验来判定微生物是否对某一种抗生素具有耐药性，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；同时超级细菌的高危害性又要求能够快速、灵敏的检测出食品、水源中是否存在超级细菌，防止超级细菌对人体或养殖动物的危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测超级细菌NDMl基因的环介导等温扩增引物及试剂盒，即利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法检测NDMl基因的引物和试剂盒，能够快速、特异性强、灵敏度高而且低成本的检测超级细菌NDMl基因。本发明的用于检测超级细菌NDMl基因的环介导等温扩增引物，其上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物的序列分别为SEQ ID N0:1 4。本发明的试剂盒，包括如下组分1)环介导等温扩增反应液A
每 25yL含有 2.5yL IOXThermopol 反应缓冲液、300 500 μ mol dNTPs、2 4mmolMgS04、0. 8 1. 2 μ mol 上游引内物、0. 8 1. 2 μ mol 下有内引物、0. 2 0. 3 μ mol 上游外引物、0. 2 0. 3 μ mol下游内引物和1 1. 5M甜菜碱；其中所述的IOXThermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8. 8的Tris-HCl、 IOOmmolKClUOOmmol NH42S04、20mmol MgSO4 和 1% Triton X-IOO ；2)UNG 酶 υ/μ L ；3)BstDNA 聚合酶 B :8πιο1/μ L ；4)显色剂C 为10 %的荧光染料STOR GREENI。试剂盒中还有用作阳性对照的NDMl质粒DNA。本发明试剂盒的应用方法如下1)样品DNA的提取Α、取200mg待检样品或者1. 0-1. 5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；B、加入1. 0-1. 5mL灭菌双蒸水，混勻，用台式离心机10000-12000转/分离心 5-lOmin，弃上清液；C、加入100-150 μ L灭菌双蒸水，混勻，100°C沸水浴中加热10_15min ；D、然后，用台式离心机10000-12000转/分离心5_10min，取上清至一个新的 1. 5mL离心管中，即为待检模板DNA ；2)进行NDMl基因的环介导等温扩增A、在装有23 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入1 μ L待检模板DNA， 和0. 5μ L的UNG酶，于恒温金属浴上50°C放置3min，然后95°C放置5min，立即置于冰上 Imin ；B.在反应管中加入1 μ L Bst DNA聚合酶B ；C.于恒温金属浴上65°C放置1小时；D.将金属浴调到80°C中止反应，3min后取出；3)显色检测在每个反应管中加入1 μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色， 说明待检细菌不是超级细菌，如果颜色变为绿色，则说明待检细菌为超级细菌。本发明根据NDMl基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为具有超级耐药性的不同菌种所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的NDMl基因的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。 可用于NDMl基因的检测，特别适用于基层医疗机构以及养殖场现场的应用。
具体实施例方式本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA ;(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环 DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA ； (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA 累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。本发明的检测超级细菌的环介导等温扩增引物，是通过比对不同超级细菌的NDMl 基因序列后设计的，其引物序列分别为SEQ ID N0:1 4。本发明的试剂盒，包括如下组分1)环介导等温扩增反应液A 每 25yL含有 2.5yL IOXThermopol 反应缓冲液、300 500 μ mol dNTPs、2 4mmolMgS04、0. 8 1.2 μ mol 上游引内物 FIP、0. 8 1.2 μ mol 下有内引物 ΒΙΡ、0. 2
0.3 μ mol上游外引物F3、0. 2 0. 3 μ mol下游内引物B3和1 1. 5M甜菜碱；其中所述的10 X Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8. 8的Tris-HCl、 IOOmmolKClUOOmmol NH42S04、20mmol MgSO4 和 1% Triton X-IOO ；2) UNG 酶IU/ μ L ；3)BstDNA 聚合酶 B :8mol/y L ；4)显色剂C 为10 %的荧光染料STOR GREENI。应用本发明的试剂盒，按照以下程序对待检样品进行检测(1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取Α.取200mg待检样品或者1. 0-1. 5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；B.加入1.0-1. 5mL灭菌双蒸水，混勻，用台式离心机10000-12000转/分离心 5-lOmin，弃上清液；C.加入100-15(^1^灭菌双蒸水，混勻，1001沸水浴中加热10-151^11;D.然后，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的
1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。(2)进行NDMl基因的环介导等温扩增A.在装有23 μ L LAMP反应液A的反应管中加入1 μ L待检模板DNA，和0. 5 μ L的 UNG酶，于恒温金属浴上50°C放置3min，然后95°C放置5min，立即置于冰上Imin ；B.在反应管中加入1 μ L Bst DNA聚合酶B ；C.于恒温金属浴上65°C放置1小时；D.将金属浴调到80°C中止反应，3min后取出；(3)显色检测在每个反应管中加入1 μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色， 说明待检细菌不是NDMl基因，如果颜色变为绿色，则说明待检细菌携有NDMl基因。 实施例1 对人工合成和构建的NDMl质粒DNA的检测按下列配方制作NDMl基因环介导等温扩增反应的试剂盒1)环介导等温扩增反应液A
每 25yL含有 2.5yL IOXThermopol 反应缓冲液、300 500 μ mol dNTPs、2 4mmolMgS04、0. 8 1.2 μ mol 上游引内物 FIP、0. 8 1.2 μ mol 下有内引物 ΒΙΡ、0. 2
0.3 μ mol上游外引物F3、0. 2 0. 3 μ mol下游内引物B3和1 1. 5M甜菜碱；其中所述的10 X Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8. 8的Tris-HCl、 IOOmmolKClUOOmmol NH42S04、20mmol MgSO4 和 1% Triton X-IOO ；其中所述的引物信息如下SEQ ID NO 1 上游内引物 upstream inner primer GGCAGGTTGATCTCCTGCTTGATTTTTACCGCCTGGTCCGATG，SEQ ID NO :2 下游内引物 downstream inner primer CTGGCGGTGGTGACTCACGCTTTTGCATAAGTCGCAATCCCCG，SEQ ID NO 3 上游夕卜引物 upstream outer primer CGGTGCTGGTGGTCGA,SEQ ID NO :4 下游夕卜弓|物 downstream outer primer GGGGCAAGCTGGTTCGA。2) UNG 酶IU/ μ L ；3)BstDNA 聚合酶 B :8πιο1/μ L ；4)显色剂C 为10 %的荧光染料STOR GREENI。按照⑴、(3)、(4)的程序进行操作(1) NDMl基因质粒DNA模板的合成和构建登录美国国家生物信息中心(NCBI)网站，搜索肺炎克雷伯氏菌ADB65 (KlebsieHa pneumoniae strain ADB65)NDM1 基因(GeneBank :HQ259057. 1)，根据序列由金斯瑞生物公司(GENESCRIPT)合成该基因片段。将合成的NDMl基因和PMC-T载体在连接酶的作用下，16°C温育40min，形成重组质粒；(2)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取A.取200mg待检样品或者1. 0-1. 5mL过夜培养的超级细菌的菌液，置于1. 5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；B.加入1.0-1. 5mL灭菌双蒸水，混勻，用台式离心机10000-12000转/分离心 5-lOmin，弃上清液；C.加入100-15(^1^灭菌双蒸水，混勻，1001沸水浴中加热10-151^11;D.然后，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的
1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。(3)进行NDMl基因的环介导等温扩增A.在装有23yL LAMP反应液A的反应管中加入1 μ L待检质粒DNA模板，和0. 5 μ L 的UNG酶，于恒温金属浴上50°C放置3min，然后95°C放置5min，立即置于冰上Imin ；B.在反应管中加入1 μ L Bst DNA聚合酶B ；C.于恒温金属浴上65°C放置1小时；D.将金属浴调到80°C中止反应，3min后取出；(4)显色检测
在每个反应管中加入1 μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，颜色变为绿色，则说明待检质粒DNA携有NDMl基因。应用本发明的试剂盒对超级细菌中的NDMl基因进行检测，结果表明，显色剂C的颜色变为绿色，证明了本发明引物和试剂盒的准确性，在应用的时候不会产生假阴性，能够准确的检测出含有NDMl基因的超级细菌。实施例2 对不含NDMl基因的样品的检测1)环介导等温扩增反应液A 每 25yL含有 2.5yL IOXThermopol 反应缓冲液、300 500 μ mol dNTPs、2 4mmolMgS04、0. 8 1.2 μ mol 上游引内物 FIP、0. 8 1.2 μ mol 下有内引物 ΒΙΡ、0. 2
0.3 μ mol上游外引物F3、0. 2 0. 3 μ mol下游内引物B3和1 1. 5M甜菜碱；其中所述的10 X Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8. 8的Tris-HCl、 IOOmmolKClUOOmmol NH42S04、20mmol MgSO4 和 1% Triton X-IOO ；其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上2) UNG 酶IU/ μ L ；3)BstDNA 聚合酶 B :8mol/y L ；4)显色剂C 为10 %的荧光染料STOR GREENI。按照(1) (3)的程序进行操作(1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取Α.取200mg待检样品或者1. 0-1. 5mL过夜培养的大肠杆菌菌液，置于1. 5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；B.加入1.0-1. 5mL灭菌双蒸水，混勻，用台式离心机10000-12000转/分离心 5-lOmin，弃上清液；C.加入100-15(^1^灭菌双蒸水，混勻，1001沸水浴中加热10-15111土11;D.然后，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的
1.5mL离心管中，即为待检模板DNA。(2)进行NDMl基因的环介导等温扩增A.在装有23yL LAMP反应液A的反应管中加入IyL待检质粒DNA模板，和0.5μ L 的UNG酶，于恒温金属浴上50°C放置3min，然后95°C放置5min，立即置于冰上Imin ；B.在反应管中加入1 μ L Bst DNA聚合酶B ；C.于恒温金属浴上65°C放置1小时；D.将金属浴调到80°C中止反应，3min后取出；(3)显色检测在每个反应管中加入1 μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，颜色为黄色，说明待检细菌不含有NDMl基因，这个结果也证实了本发明的引物和检测试剂盒在应用的时候不会产生假阳性。
权利要求
1.检测超级细菌的环介导等温扩增引物，其上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物的序列分别为SEQ ID NO :1 4。
2.一种检测超级细菌NDMl基因的环介导等温扩增试剂盒，包括如下组分1)环介导等温扩增反应液A:每 25yL 含有 2.5yL IOXThermopol 反应缓冲液、300 500 μ mol dNTPs、2 4mmol MgS04、0. 8 1. 2 μ mol上游引内物、0. 8 1. 2 μ mol下有内引物、0. 2 0. 3 μ mol上游外引物、0. 2 0. 3 μ mol下游内引物和1 1. 5M甜菜碱；其中所述的IOXThermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8. 8的Tris-HCl、IOOmmol KClUOOmmol NH42S04、20mmol MgSO4 和 1% Triton X-IOO ；2)UNG 酶IU/ μ L ；3)Bst DNA 聚合酶 B :8mol/μ L ；4)显色剂C为10%的荧光染料STOR GREEN I ；其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物的序列分别为SEQ ID NO :1 4。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括有作为阳性对照的NDMl质粒DNA。
4.权利要求2所述的试剂盒的应用方法如下1)样品DNA的提取Α、取200mg待检样品或者1. 0-1. 5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min,弃上清液；B、加入1.0-1. 5mL灭菌双蒸水，混勻，用台式离心机10000-12000转/分离心5-lOmin，弃上清液；C、加入100-150μ L灭菌双蒸水，混勻，100°C沸水浴中加热10_15min ；D、然后，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA;2)进行NDMl基因的环介导等温扩增A.在装有23μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入IyL待检模板DNA，和 0. 5μ L的UNG酶，于恒温金属浴上50°C放置3min，然后95 °C放置5min，立即置于冰上 Imin ；B.在反应管中加入1μ L Bst DNA聚合酶B ；C.于恒温金属浴上65°C放置1小时；D.将金属浴调到80°C中止反应，3min后取出；3)显色检测在每个反应管中加入1 μ L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是超级细菌，如果颜色变为绿色，则说明待检细菌为超级细菌。
全文摘要
本发明涉及检测超级细菌NDM1基因的环介导等温扩增引物和试剂盒，其上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物的序列分别为SEQ ID NO1～4。本发明根据NDM1基因的基本保守区的六个序列设计了环介导等温扩增引物，该保守基因序列为具有超级耐药性的不同菌种所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的NDM1基因的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于NDM1基因的检测，特别适用于基层医疗机构以及养殖场。
文档编号C12Q1/04GK102181568SQ20111012257
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者吴兴海, 林黎明, 王英超 申请人:吴兴海