芥末成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开芥末成分环介导等温扩增（LAMP）引物、试剂盒及检测方法，其碱基序列如SEQ?ID?NO.19～24；采用LAMP检测技术，建立了适用于食品中芥末致敏原特异性检测的方法，本发明所述方法操作简单，不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，检测效率达到传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。
【专利说明】芥末成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种芥末成分环介导等温扩增(LAMP)引物、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病，引起变态反应的抗原被称为变应原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分会引起6%至8%的儿童和2%的成人的过敏反应，严重的会危及生命。预包装食品由于多是成分复杂的深加工产品，如果含有致敏原成分而又未能明确告之，就有可能引起过敏，危害消费者的健康安全。目前大约有160多种食品致敏原，芥末为常见的致敏原之一。2003年以来，欧盟、美国、香港等发达国家和地区相继制定了预包装食品致敏原标识要求的法规，并已于2005年起陆续发布和实施，对我国食品出口贸易造成了明显影响。由于目前我国在食品致敏原成分检测方法领域技术薄弱，随着越来越多国家和地区对食品致敏原成分标识法规的全面实施，食品标签的致敏原成分标识要求和符合性检验将会成为我国食品出口贸易的重要障碍。
[0003]芥(mustard)是十字花科(Cruciferae)数种草本植物的统称,或指其辣味种子所制成的调味品。主要品种是:白芥(Sinapis alba，或黄芥)，原产于地中海地区；棕芥(Brassica juncea,或芥菜),原产于喜马拉雅山区。
[0004]目前，致敏原成分检测方法主要有酶联免疫法、聚合酶链式反应法、色谱质谱法、表面等离子共振免疫法等。但是不同的方法的检测限存在较大的区别，因此机构之间、国家之间应该采用一种检测结果较为精确、重复性较好的标准方法。目前较多国家所认可的方法是酶联免疫法。但是酶联免疫法也受许多因素制约，如被测食品母体、检测人员、试剂盒
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[0005]随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的新型鉴定技术已日益得到广泛应用。环介导等温扩增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基础上创建的一种较理想的手段，LAMP引物包括两个外引物和两个内引物，特异结合靶序列上的6个特异区域。内引物FIP包含Flc (与Fl区域互补)和F2序列，内引物BIP包含Blc (与BI区域互补)和B2序列，外引物为F3和/或B3序列，本发明在内外引物的基础上引入环引物BLP，大大缩短了反应时间，具体LAMP的引物组成及对应区域信息见图1。其特点是:①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性:采用六个区段，四条引物，扩增特异性高，可以根据是否扩增来判断目标基因的存在与否；③快速、高效扩增:扩增在不到Ih即可完成，且产率高；④灵敏度高:扩增模板可达10拷贝或更少；⑤鉴定简便:在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可用肉眼观察判断扩增与否；另外，它利用恒温和低反应温度(63°C )，减少细胞损伤，检测人员实际操作非常简便。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测、致敏原成份检测等领域具有广阔的应用前景。
[0006]本项目拟在前期研究的基础上，将LAMP检测技术应用于食品中过敏原成分芥末的检测，针对芥末反转录酶RT基因，应用六条特异引物在恒温的条件下、简易的设备中，仅用一小时左右有效的完成筛查任务，结果判断简单，既能节省时间，又可大大降低检测成本，适用于基层实验室，可作为传统PCR方法的有益补充。
【发明内容】
[0007]本发明的技术方案为:通过考察并锁定芥末成分靶基因，然后设计合成4套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID N0.1~24 ;，优化体系，最后确定一套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID N0.19~24 ;进而确定了 LAMP方法的技术参数，最后验证引物特异性、灵敏度、稳定性。
[0008]本发明的具体技术方案如下:本发明涉及一种检测芥末成分的环介导等温扩增引物，其碱基序列为SEQ ID N0.19~24，如下:
[0009]F3:cggcctttac taggaggt (SEQ ID N0.19)
[0010]B3:ttcgagaatc gagcaacg (SEQ ID N0.20)
[0011]FIP(Flc+F2):tcgacttagg catccttacg gattgagccg agggtcataa (SEQ IDN0.21)
[0012]BIP(Blc+B2):agataatatt ggccgagcac ccgtaataga actcacgatc cagg (SEQID N0.22)
[0013]FLP:ccagtattcg gactctcgg (SEQ ID N0.23)
[0014]BLP:aatacccttg ctacgtcaat gt (SEQ ID N0.24)
[0015]本发明的另一方面涉及一种芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其中，检测试剂盒包括检测引物:SE Q ID N0.19~24。
[0016]优选的情况下:对于上述芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒中，每25ul反应体系中包括:
[0017]SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6yM，SEQ ID NO:19 ~20 各 0.2 y M，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 ii M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20,IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y I SYT0-9。
[0018]上述试剂盒在使用过程中，除了按上述反应体系加入上述试剂之外，还需要加入模板DNA和蒸馏水(补足25 ii L反应体系)，再进行LAMP扩增反应。
[0019]本发明的另一方面在于，公开一种利用上述芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，来检测芥末成分的方法，其方法步骤包括:
[0020]①提取待测样品的基因组DNA ;
[0021]②以步骤①提取的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测:
[0022]每25 ii L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20 各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 y M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y ISYTO-9, 2 ill DNA模板、蒸馏水:余量；
[0023]反应条件为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环。
[0024]③检测结果以扩增曲线进行判断。
[0025]本发明的另一方面在于，公开一种利用上述的环介导等温扩增引物在检测芥末成分方面的应用。
[0026]本发明的创新特征是:
[0027]本发明将LAMP检测技术应用于对芥末内源特异基因检测，针对芥末内源特异基因，应用特异引物在恒温的条件下、简易的设备中，仅用一小时左右有效的完成筛查任务，结果判断简单，既能节省时间，又可大大降低检测成本，适用于基层实验室，可作为传统PCR方法的有益补充。
[0028](I)本研究针对芥末内源特异基因(RT gene for reverse transcriptase)设计了四套引物，从中筛选出一套出峰时间早，信号强的引物RT-4，将反应条件控制在63°C，45min进行检测,成功建立了芥末成分的LAMP检测方法；
[0029](2)进行了引物RT-4的灵敏度实验，结果显示该引物检测限可达0.5% ；
[0030](3)进行了引物RT-4的引物特异性，结果显示该引物特异性良好，对南美对虾、濑尿虾、沙虾、草虾有检出，均无非特异扩增；
[0031](4)进行了引物RT-4的稳定性实验，结果显示引物5%，1%及0.5%的稳定性均良好。
·[0032](5)进行了引物RT-4的实际样品实验，结果显示引物对南美对虾、蜢子虾酱、熟虾酱能检出，但对芥末粉、芥末青豆、芥末沙拉汁、青芥辣、辣根可检出，对芝麻沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺、不能检出。性能参数等同于传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业标准应用推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1:LAMP的引物组成及对应区域信息；
[0034]图2 =RT-1弓丨物的LAMP反应结果
[0035]图3:RT_2弓丨物的LAMP反应结果；
[0036]图4:RT_3弓丨物的LAMP反应结果；
[0037]图5:RT-4弓丨物的LAMP反应结果；
[0038]图6: LAMP弓丨物RT-4的灵敏度；
[0039]图7:RT-4引物特异性鉴定图；
[0040]图8:5%精密度实验图；
[0041]图9:1%精密度实验图；
[0042]图10:0.5%精密度实验图；
[0043]图11:0%精密度实验图；
[0044]图12:实际样品检测图；【具体实施方式】
[0045]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0046](I)LAMP 反应试剂:
[0047]Bst DNA 大片段聚合酶(Bst DNA polymerase large fragment), New EnglandBiolabs 公司；
[0048]甜菜碱(Betaine)、MgCl2,Sigma 公司；
[0049]dNTPs,宝生物工程(大连)有限公司；[0050](2) SYT0-9 突光染料，Invitrogen 公司；
[0051](3)LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3、反向环引物BLP)，生工生物工程(上海)有限公司。
[0052](3)突光定量 PCR 仪，7500, Applied Biosystems ；
[0053](4)本发明所述的对照样品以及LAMP反应体系中所使用的各种溶剂均由常规途径制备或者商业途径获得。
[0054]实施例1
[0055](I)LAMP引物设计步骤如下:
[0056]①查阅芥末相关文献，了解不同品系芥末中的特异基因，选取RT基因(AJ415649.1—Brassica nigra partial RT gene for reverse transcriptase fromgypsy-like retroelement13G42-26)为芥末特异基因；
[0057]②在NCBI网站中查找所挑选的基因序列；
[0058]③利用DNAMAN软件对查到的各序列进行比对，比对结果表明RT基因具有一定的保守性；
[0059]①设计4套特异引物，即芥末LAMP引物RT-1，芥末LAMP弓丨物RT-2，芥末LAMP弓丨物RT-3，芥末LAMP引物RT-4，碱基序列如下:
[0060]芥末LAMP弓丨物RT-1
[0061]F3gcatgaattg ctcctagtct (SEQ ID N0.1)
[0062]B3cgtacctctt tccctcca (SEQ ID N0.2)
[0063]FIP(Flc+F2)gtggtggtgt tggagtctcg aatgatcaat gaggctccg (SEQ ID N0.3)
[0064]BIP(Blc+B2)cgtgagactc caacaacacc atcttcttcc tccacaggg (SEQ ID N0.4)
[0065]FLP gtgttggagt cgcatactca (SEQ ID N0.5)
[0066]BLP actgccacca gttgatctg (SEQ ID N0.6)
[0067]芥末LAMP 弓 I 物 RT-2
[0068]F3gtgagactcc aacaacacc (SEQ ID N0.7)
[0069]B3ccatatgcct agacaacaaa ac (SEQ ID N0.8)
[0070]FIP(Flc+F2)gcgtacctct ttccctccaa atctgccacc agttgatctg (SEQ IDN0.9)
[0071]BIP(Blc+B2)acgcagcctg agatcattac agtctatctc tagatggatg ctcc (SEQ IDN0.10)
[0072]FLP tcttcttcct ccacagggt (SEQ ID N0.11)[0073]BLP ttggtgtact tgggtgagc (SEQ ID N0.12)
[0074]芥末LAMP弓丨物RT-3
[0075]F3ttgagccgag ggtcataa (SEQ ID N0.13)
[0076]B3agttcagtat gacttcttcg tc (SEQ ID N0.14)
[0077]FIP(Flc+F2)agcaccctcg agaggatggt cccgagagtc cgaatac (SEQ ID N0.15)
[0078]BIP(Blc+B2)cccggtgtcg accaatacca acctcacaac gatctcct (SEQ ID N0.16)
[0079]FLP cgacttaggc atccttacgg SEQ ID N0.17)
[0080]BLP cgtcaatgtc ctggatcgt (SEQ ID N0.18)
[0081 ]芥末 LAMP 弓 I 物 RT-4
[0082]F3cggcctttac taggaggt (SEQ ID N0.19)
[0083]B3ttcgagaatc gagcaacg (SEQ ID N0.20)
[0084]FIP(Flc+F2)tcgacttagg catccttacg gattgagccg agggtcataa (SEQ IDN0.21)
[0085]BIP(Blc+B2)agataatatt ggccgagcac ccgtaataga actcacgatc cagg (SEQ IDN0.22)
[0086]FLP ccagtattcg gactctcgg (SEQ ID N0.23)
[0087]BLP aatacccttg ctacgtcaat gt (SEQ ID N0.24)
[0088](2 ) LAMP反应体系的建立
[0089]①精提DNA的实验方法参考《分子克隆实验指南第三版》(萨姆布鲁克D.W拉塞尔著.科学出版社2002 [美]J.黄培堂等译)。
[0090]精提DNA的浓度及纯度的测定:
[0091]取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀释至lmL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算获得:
[0092]C=AXNX50/1000 式中:
[0093]C-DNA 浓度(μ g/ μ L)
[0094]A——260nm处的吸光值
[0095]N——核酸稀释倍数
[0096]IOD260nm = 50 μ g/mL 双链 DNA，当 0D26(l/0D28。比值在 L 7 ~L 9 之间时，适宜于 LAMP检测。
[0097]②按照步骤①的方法制备芥末DNA (IOOng/ μ L)，并将其作为阳性模板，ddH20作为阴性对照，分别用各套引物(RT-l、RT-2、RT-3、RT-4)的内外引物进行LAMP反应，反应体系如下:
[0098]25 μ L的LAMP反应体系，其成分包括:FIP和BIP各1.6 μ M，F3和/或83各0.2 μ M，FLP 和 / 或 BLP 各 0.8μΜ，20πιΜ Tris-HCl (pH8.8), IOmM KCl,6mM MgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM 甜菜碱，1.6mM dNTP, 8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 μ 1SYT0-9, 2 μ I DNA模板。
[0099]具体操作时先在冰上准备LAMP反应混合液，扩增反应体系如下:12.5 μ L反应液RM，8 μ L超纯水DW，I μ L引物PM，I μ L Bst酶，0.5 μ I SYT0-9以及2 μ L模板。将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23 μ L，再分别加入2 μ L模板DNA或阴阳性对照模板，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，60个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物，结果如图2~5所示:
[0100]设计的4套引物中，图2中的RT-1引物约36miη出峰，图3中的RT-2引物无扩增，图4中的RT-3引物约13min出峰，图5中的RT-4引物约Ilmin出峰，选择出峰稍早的RT-4引物，初步将反应时间定在45min进行特异性和灵敏度等实验。
[0101]实施例2RT-4引物灵敏度实验
[0102]按照实施例1所述方法分别精提样品芥末和芹菜(购自农贸市场)的DNA:
[0103]将芥末DNA用芹菜DNA分别稀释到质量比为10%, 5%, 1%，0.5%, 0.1%，0.05%, 0.01%几个梯度，每个稀释度分别取2 μ I进行LAMP实验，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以RT-4作为LAMP引物，进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，以确定LAMP反应的灵敏度。
[0104]以确定LAMP反应的灵敏度，同时根据最低灵敏度出峰时间及假阳性最早出峰时间，确定反应时间。反应结果如下图6所示:
[0105]从图6中可以看出，将芥末DNA稀释至不同浓度梯度，RT-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化，检测灵敏度可达0.5%，最低检出限出峰时间约在19min，可以将反应时间确定在45min。
[0106]由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0107]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0108]②芥末DNA用芹菜DNA分别稀释到质量比为0.1% (0.1ng/μ L), 0.05% (0.05ng/μ L)，的时候，为平直的线，没有扩增峰出现，引物RT-4无法检测。
[0109]③芥末DNA用芹菜DNA分别稀释到质量比为5%(5ng/ μ L), 2%(2ng/ μ L), 1%( lng/μ L),0.5% (0.5ng/yL)几个梯度时候，分别扩增出实线的峰，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化；证明引物RT-4能够检测模板为浓度为0.5%以上的(含DNA浓度为0.5ng/ μ L)，约19min出峰。
[0110]因此，确定LAMP引物RT-4的模板检测灵敏度为0.5% (0.5ng/l.! L)。
[0111]实施例3 LAMP引物特异性实验
[0112]按照实施例1所述方法分别精提下述样品(购自农贸市场)的DNA:
[0113]芥末、西芹、芹菜、花生、黄大豆、黑芸豆、黑芝麻、白芝麻、小麦、大米、熊猫豆、绿豆、黄芸豆、玉米、红芸豆、白芸豆、荞麦仁、奶花芸豆、亚麻籽、红小豆、大白芸豆、豌豆、紫花芸豆、黑米、白豌豆、薏米仁、高粱、燕麦、拟南芥、小白菜、花椰菜、上海青、胡萝卜、白萝卜、韭菜、大白菜、油菜、奶白菜。
[0114]分别以精提的上述各样品DNA (提取后，样品DNA的浓度均为lOOng/μ L)作为LAMP反应的模板，用RT-4作·为LAMP引物，进行LAMP反应，其反应体系同实施例2，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C15s，63°C 458，45个循环，于631: 45s处收集荧光信号，验证LAMP反应的特异性，利用荧光定量PCR仪观察反应结果。[0115]图7中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0116]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0117]②芥末DNA检测的时候，扩增出实线的峰，证明引物RT-4能够检测模板为芥末的样品。
[0118]③西芹、芹菜、花生、黄大豆、黑芸豆、黑芝麻、白芝麻、小麦、大米、熊猫豆、绿豆、黄芸豆、玉米、红芸豆、白芸豆、荞麦仁、奶花芸豆、亚麻籽、红小豆、大白芸豆、豌豆、紫花芸豆、黑米、白豌豆、薏米仁、高粱、燕麦、拟南芥、小白菜、花椰菜、上海青、胡萝卜、白萝卜、韭菜、大白菜、油菜、奶白菜DNA样品扩增曲线为平直的线，没有扩增峰出现，引物RT-4无法检测。
[0119]因此，确定LAMP引物RT-4只对芥末特异性检出，特异性良好。用其继续进行下述的精密度实验。
[0120]实施例4精密度稳定性实验
[0121](一)5%精密度实验
[0122]将芥末DNA用芹菜DNA稀释到5% (5ng/ μ L)作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作为阳性对照，以RT-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察5%精密度LAMP反应的稳定性。20份平行样品检测结果如图8:
[0123]图8中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0124]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0125]②将芥末DNA用芹菜DNA稀释到5ng/ μ L作为模板，进行检测的时候，20份样品均扩增出实线的峰，证明引物RT-4能够检测模板为5ng/y L的芥末样品。
[0126]上述结果显示出5% (5ng/yL)精密度的稳定性良好。
[0127](二)1%精密度实验
[0128]将芥末DNA用芹菜DNA稀释到1% (Ing/ μ L)作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作为阳性对照，以RT-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察1%精密度LAMP反应的稳定性。检测结果如图9:
[0129]图9中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0130]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；[0131 ] ②将芥末DNA用芹菜DNA稀释到Ing/ μ L作为模板，进行检测的时候，20份样品均扩增出实线的峰，证明引物RT-4能够检测模板为Ing/μ L的芥末样品。
[0132]上述结果显示出l%(lng/y L)精密度的稳定性良好。
[0133](三)0.5%精密度实验
[0134]将芥末DNA用芹菜DNA稀释到0.5% (0.5ng/ μ L)作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作为阳性对照，以RT-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察
0.5%精密度LAMP反应的稳定性。
[0135]图10中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0136]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0137]②将芥末DNA用芹菜DNA稀释到0.5%(0.5ng/ μ L)作为模板，进行检测的时候，20份样品均扩增出实线的峰，证明引物RT-4能够检测模板为0.5ng/yL的芥末样品。
[0138]上述结果显示出0.5% (0.5ng/ μ L)精密度的稳定性良好。
[0139](四)阴性精密度实验
[0140]以ddH20代替D NA模板作为0%精密度和阴性对照模板，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作为阳性对照，以RT-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察0%精密度LAMP反应的稳定性。检测结果如图11:
[0141]图11中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0142]①20份模板为ddH20的阴性样品均为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果;
[0143]②将提取的芥末DNA (lOOng/μ L)作为阳性对照，进行检测的时候，扩增出实线的峰，证明引物RT-4能够检测阳性的芥末样品，引物有效。
[0144]上述结果显示出0%精密度的稳定性良好。
[0145]实施例5实际样品实验
[0146]以熟虾酱、蜢子虾酱、芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺的DNA作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以芥末DNA (IOOng/ μ L)作为阳性对照，以RT-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，反应体系按照实施例2的方法进行，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，观察实际样品检测情况。
[0147]图12中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0148]①模板为ddH20的阴性样品均为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果;
[0149]②将提取的芥末DNA (lOOng/μ L)作为阳性对照，进行检测的时候，扩增出实线的峰，证明引物有效。
[0150]③将提取的IOOng/μ L样品DNA (1:芥末粉，2:芥末青豆，3:芥末沙拉汁，4:青芥辣，5:辣根)作为模板，进行检测的时候，扩增出实线的峰，引物RT-4对芥末粉、芥末青豆、芥末沙拉汁、青芥辣、辣根实际样品有检出，与实际结果相符。
[0151]④将提取的IOOng/μ L非芥末DNA (芝麻沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺、熟虾酱、蜢子虾酱)作为模板，进行检测的时候，扩增出平滑的直线，无扩增曲线，证明引物RT-4对芝麻沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺、熟虾酱、蜢子虾酱实际样品无检出，与实际结果相符。
[0152]通过反复试验，以上实验数据显示，本项目研制的芥末成分LAMP检测方法(反应体系和反应条件如实施例2)，适用于芥末致敏原的检测，定性检测低限为0.5%，检测的稳定性达到100%，灵敏度达到0.5%，特异性达到100%，均符合推广应用的实际要求。能够应用于实际工作，尤其 适用于大量样品快速初筛和品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。
【权利要求】
1.一种检测芥末成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQ IDN0.19 ~24。
2.一种芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物:SEQ IDN0.19 ~24。
3.根据权利要求2所述的芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，在检测试剂盒中:
每 25 ii L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8iiM，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y ISYT0-9,2u I DNA 模板。
4.利用权利要求2所述试剂盒检测芥末成分的方法，其特征在于，检测步骤包括: ①提取待测样品的基因组DNA； ②以步骤①提取的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测:
每 25 ii L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 y M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y ISYT0-9, 2 ill DNA模板、蒸馏水:余量； 反应条件为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s, 45个循环。
5.如权利要求1所述的环介导等温扩增引物在检测芥末成分方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103571944SQ201310437149
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】曹际娟, 徐君怡, 孙铭英, 曹冬梅 申请人:曹际娟, 徐君怡, 孙铭英, 曹冬梅