专利名称：致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增引物对与检测方法
技术领域：
本发明涉及细菌的分子生物学检验技术，具体地说是针对表达呕吐毒素的致病性 蜡样芽孢杆菌设计环介导等温扩增(LAMP)所需的特异LAMP引物对，特别是致病性蜡样芽 孢杆菌的环介导等温扩增检测方法。
背景技术：
蜡样芽孢杆菌广泛分布于自然界中，在许多生熟食品中常见。当食物中所含的蜡 样芽孢杆菌数量超过IO6个/克时，食物中毒发病率高于60%，奶粉中污染蜡样芽孢杆菌数 达到100个/克可令婴儿发病。蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒临床上可分为腹泻型和呕吐 型综合症。引起腹泻型综合症是由于该菌产生腹泻毒素所致，该毒素在56°C时5分钟即可 灭活，且对胰蛋白酶敏感，因而可预防；而引起呕吐型综合症与某些蜡样芽孢杆菌菌株表达 一种小分子量、热稳定的多肽——呕吐毒素cereulide有关，该毒素对热稳定，活性不受胃 蛋白酶的干扰，即使微量表达也会对人体有较大危害，不易防范，常引起暴发性食物中毒。 此类中毒潜伏期为0. 5 6小时，以恶心、呕吐症状为主，偶伴有肠痉挛或腹泻等。各国已 提出对各类食品中该菌的污染进行检测要求。蜡样芽孢杆菌传统的检测方法包括革兰氏染色镜下形态观察，生化性状检测如进 行葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、V-P试验、L-酪氨酸分解试验、溶菌酶试验及卵磷脂 酵试验等。此类传统检测方法耗时长，操作繁琐，灵敏性低，不利于目前对大量食品样品进 行快速检测的现实要求。随着科学技术的发展，现在已分别建立了以PCR为基础的分子生物学检测技术如 RT-PCR、荧光PCR，及以ELISA为主的免疫学检测法。这些检测方法快捷、灵敏，准确度较高。 但是，对表达缺乏抗原性的cereulide呕吐毒素的致病性蜡样芽孢杆菌仍没有建立有效的 检测方法，仅见采用液相色谱/质谱直接针对cereulide毒素蛋白进行检测，而该方法需要 商品化的cereulide标准品。这些针对蜡样芽孢杆菌的现代检测方法均需一定的设备和技 术要求，且试剂费用较昂贵，难以推广普及。蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素cereulide与位于该菌质粒pCER270上的呕吐毒素 合成酶cesA/B基因表达有关，针对这类致病菌的基因检测是灵敏有效的。环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种比普通 PCR 法更为高效且灵敏 的基因分子检测技术。在申请号为200810152850. 8的专利中已涉及到针对蜡样芽孢杆菌 16S 23S rRNA区间编码序列的LAMP检测，因为所有的蜡样芽孢杆菌都含有该序列，其中 也包括一些蜡样芽孢杆菌的益生菌株，因而具有蜡样芽孢杆菌广谱检测性，却缺乏针对性， 更不能确定产毒的致病菌株。因此，特别是建立针对表达呕吐毒素的致病性蜡样芽孢杆菌 的LAMP快速检测有重要的实际与现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对表达呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌特定基因的环介导等温扩增检测所需引物试剂与方法。本发明提供一种用于检测致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增(LAMP)特异引 物对，是针对表达呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌的LAMP引物对。所述的致病性蜡样芽孢杆菌携带有质粒pCER270。所述的含有质粒PCER270的致病性蜡样芽孢杆菌具有呕吐毒素合成酶A (cesA)和 B(cesB)基因。所述的LAMP引物对针对的靶序列包括cesA或cesB基因；所述引物对包括内引物 对(ces-FIP、BIP)和外引物对(ces-F3、B3)，且可使靶基因序列进行环形特异扩增，扩增片 段大小呈梯度变化。一种用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的LAMP试剂盒，包括
(1)环介导等温扩增反应基本体系；(2)环介导等温扩增反应所需的内外引物对；(3)说明书。呕吐型蜡样芽孢杆菌环介导等温扩增的检测方法，包括(1)扩增反应总体系1· 6μπιο1 FIPU. 6ymol ΒΙΡ、0. 2 μ molF3、0. 2 μ mol Β3、 20mmol Tris-HCl (PH 8. 8) UOmmol KCl、2mmol MgSO4UOmmol (NH4) 2SO4,0. 1 % Triton X-100U. 4mmol dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、4. 0 μ L模板DNA，加双蒸水补至总体积为25 μ 1。(2)扩增反应时Mg2+浓度为2-12mM，反应温度为60-65°C，反应时间为20-70分钟。(3)扩增反应程序将除Bst DNA聚合酶以外的所有反应物混勻后95°C水浴5分 钟，迅速放在冰上冷却5分钟，冷却后加入Bst DNA聚合酶，65°C水浴箱孵育反应60分钟， 80°C孵育10分钟终止反应。(4)阳性结果的判断白色沉淀的观察各反应后的EP以5000rpm离心5分钟，在EP管底可见白色沉淀 为阳性结果。与染料反应观察反应结束后的产物中加入SYBR Green染料，阳性结果紫外灯下 会呈现出绿色。凝胶电泳的观察将扩增产物点样于含终浓度0. 5μ g/ml的溴化乙锭(EB)的 1. 5%琼脂糖凝胶上，80V电压，电泳40分钟，于紫外灯下观察。阳性结果呈典型的梯状条 带，阴性则无扩增条带。所述的内外引物对如cesA-1 :cesA I-FIP :5’ -TGGCGAATCCTATTTGAAGATATCA-GAGCACAATTTCTTCTCCAC-3，cesAl-BIP :5，-GACAACCAAATGATGCACAGCA-AGGTCCTGTCTTGAAGGC-3，cesAl-F3 :5， -AAGGAGTTTGTCTTTTTCGG-3，cesAl-B3 :5， -CGAACAACTTCAGCGACA-3，cesA-2 :cesA2_FIP :5’ -GAGGAACTGATTATGCGTGTATCTT-CTTGTGATACAAAATACGCTCA -3，cesA2-BIP :5，-TCATAGCTATGCAATTCACCTAGTG-AATTATCCAATTGATGCCCAA-3，cesA2-F3 :5， -CATCTAGTATTTTCAATATCGTCTG-3，
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图1是针对靶基因的6个区域设计4条引物示意2是SYBR Green染料与扩增产物结合显绿色为阳性结果，阴性结果无颜色变化
图3是对扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，阳性结果呈梯状条带，阴性无扩增 条带图4是LAMP的特异性检测。M为DNA marker (DL2000)；泳道1无DNA模板，2为 非蜡样芽孢杆菌DNA为模板，3为不带毒蜡样芽孢杆菌菌株DNA为模板的LAMP扩增，4为带 毒蜡样芽孢杆菌菌株DNA为模板的LAMP扩增，5是泳道4的产物酶切后电泳结果。图5是LAMP的灵敏性电泳检测。M为DNA marker (DL100)；泳道1_9 以无菌水从 KT1-IiT9以10倍系列稀释浓度为1. 1 X IO9CfuAil带毒蜡样芽孢杆菌原液后的LAMP产物电 泳结果，当稀释至10_9倍时，未检出阳性条带。
图6是LAMP的灵敏性染色检测。1_9号EP管分别是以无菌水从Κ^-ΙΟ—9以10倍 系列稀释浓度为1. 1 X IO9CfuAil带毒蜡样芽孢杆菌原液后的LAMP产物加入SYBR Green染 色结果，当稀释至10_7倍时，未检出阳性条带。10号管无DNA模板扩增产物加入SYBR Green 染色结果呈阴性。本发明所具有的有益效果本发明所述的检测引物经过对非蜡样芽孢杆菌菌种、不带呕吐毒素基因的蜡样芽 孢杆菌菌株、及带毒蜡样芽孢杆菌菌株分别检测，结果显示特异性引物只扩增出带毒菌株， 且阳性扩增产物可被特异的限制性核酸内切酶识别切割。而通过系列梯度稀释菌液鉴定所 用引物灵敏性，显示其检出限为llcfu/ml。本发明的特异性LAMP引物具有明显的高特异性 和灵敏度。本发明所提供的特异的环介导等温扩增(LAMP)引物对表达呕吐毒素的致病性 蜡样芽孢杆菌的阳性扩增，该特异扩增属微量检测，需要的样本材料少，耗材小，成本低，仅 需要简单的水浴箱、离心机、电泳仪等设备。该LAMP特异引物针对致病性蜡样芽孢杆菌的 检测具有简便、成本低，具有高特异性、灵敏度及检出效率等特点。
具体实施例方式本发明的技术方案是通过以下步骤来实现的(1)寻找蜡样芽孢杆菌表达呕吐毒素的基因序列，并通过DNASTAR比对序列特异 性与保守性；(2)针对特异区间的基因序列设计LAMP内、外引物；(3)摸索LAMP引物扩增最佳反应条件；(4)用不同菌株DNA作为模板，检测LAMP引物扩增的特异性；(5)系列梯度稀释模板DNA，鉴定LAMP引物扩增的灵敏性；(6)对扩增产物进行凝胶电泳或荧光染料分析或白色沉淀肉眼观察检测结果。呕吐毒素cereulide合成与蜡样芽孢杆菌菌株中携带的质粒pCER270上的呕吐毒 素合成酶cesA/B基因表达相关，本发明以cesA/B基因作为靶序列，为了使设计的LAMP引 物具有特异性，进行该序列DNASTAR比对，利用引物设计软件设计出多组LAMP引物，每组 LAMP引物包括一对外引物(ces_F3和ces_B3)、一对内引物(ces_FIP和ces_BIP)。环介导等温扩增反应体系如下1. 6 μ molFIP、L 6 μ molBIP、0. 2 μ molF3、0. 2 μ molB3、20mmolTris-HCl(PH 8. 8)、 IOmmol KCl、2mmolMgS04、IOmmol (NH4) 2S04、0. 1 % Triton X-100、1. 4mmol dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、4. OyL模板DNA，加双蒸水补至总体积为25 μ 1。
优化的环介导等温扩增反应条件为Mg2+浓度以2mM为宜，LAMP扩增温度为65°C，时间为60分钟。环介导等温扩增的程序为(1)将除Bst DNA聚合酶以外的所有反应物在95°C水浴5分钟；
(2)迅速放在冰上冷却5分钟；(3)冷却后加入Bst DNA聚合酶，65°C孵育60分钟；(4) 80°C孵育10分钟终止酶活性即完成了 LAMP反应。环介导等温扩增产物阳性结果检测方法包括(1)白色沉淀的肉眼观察此法适用于样本中含较多目地菌的DNA模板。产物以 5000rpm离心5分钟，在EP管底可见白色沉淀。在扩增过程中伴随目的扩增产物的增加，同 时生成另一种称为焦磷酸镁的白色沉淀物质。阳性扩增产物生成越多，白色沉淀就生成越 多，以致可肉眼见。(2)与染料的显色反应观察此法可较灵敏的判断阳性扩增结果。具体是在反应 结束后的产物中加入SYBR Green染料，阳性结果会呈现出绿色为主的颜色变化，扩增产物 的多少决定了绿色变化的深浅。因为扩增产生大量核苷酸链中可嵌入SYBR Green分子，并 使其产生绿色荧光，因而在紫外光下可见。(3)凝胶电泳梯状条带观察此法可灵敏地检测出低至10个拷贝以下的DNA模板 扩增的阳性结果。将扩增产物点样于含终浓度0. 5μ g/ml的溴化乙锭(EB)的1. 5%琼脂糖 凝胶上，80V电压，电泳40分钟，于紫外灯下观察。阳性结果呈典型的梯状条带，阴性则无扩 增条带。阳性梯状条带的产生是由于针对目的模板特异序列设计的LAMP引物在DNA聚合 酶的作用下，对目的模板进行扩增，且由于引物的交叉设计使扩增片段形成环形结构，该结 构可被反复扩增并新形成，最终形成以环形片段长度为级差的大小不等的扩增片段，因而 电泳呈现出梯状条带。下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明实施例一材料1.细菌菌株非蜡样芽孢杆菌菌株、不带毒蜡样芽孢杆菌、带毒蜡样芽孢杆菌2.试剂Bst DNA聚合酶、dNTP、TaqI内切酶、SYBR Green、琼脂粉、溴化乙锭、DNA Marker、LAMP引物合成3.仪器离心机、水浴箱、电泳仪/槽、凝胶成像系统或紫外灯箱方法1.细菌DNA提取(1)取细菌纯培养物100μ L于12000r/min离心5min，弃上清。(2)加入100 μ L无菌水混勻，于100°C中水浴IOmin裂解，冰浴2min。(3) 4°C 12000r/min离心5min，上清液_20°C保存或取4. 0 μ L上清液用于LAMP扩增。2. LAMP引物设计访问Genbank网络数据库查询蜡样芽孢杆菌pCER270的cesA/B基因序列，通过 DNASTAR比对，选择序列高度保守且特异区，用引物设计软件设计并引入酶切位点。
3.环介导等温扩增反应体系在 EP 管中加 入 1.6ymolFIP、1.6ymolBIP、0.2ymolF3、0.2ymolB3、 20mmolTris-HCl(PH 8· 8)、IOmmolKCl、2mmol MgSO4UOmmol (NH4) 2SO4,0. 1% Triton X-100、 1. 4mmol dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、4. O μ L模板DNA，加双蒸水补至总体积为25 μ 1，离心 混勻。4.环介导等温扩增反应条件优化(1)优化Mg2+浓度Mg2+浓度范围设定为2_12mM，以2mM的梯度来确定最适浓度；(2)优化反应温度反应温度依次设为60、63、65°C来确定最适温度；(3)优化反应时间反应时间依次设为20-70分钟，以10分钟的梯度来确定最适 时间。5.环介导等温扩增程序(1)将除Bst DNA聚合酶以外的所有反应物混勻后95°C水浴5分钟；(2)迅速放在冰上冷却5分钟；(3)冷却后加入Bst DNA聚合酶，65°C水浴箱孵育反应60分钟；(4)80°C孵育10分钟终止反应。6.环介导等温扩增引物的特异性检测通过带毒与不带毒蜡样芽孢杆菌菌株及非蜡样芽孢杆菌菌株DNA的LAMP扩增及 扩增产物的酶切分析检测LAMP特异性。切酶时将各阳性扩增产物同内切酶混勻于37°C酶 切过夜。7.环介导等温扩增引物的灵敏性检测采用系列稀释法检测LAMP的灵敏性，即用过滤除菌超纯水将菌液按10倍梯度稀 释至10_9倍，每一稀释浓度的菌液进行平板培养计数和LAMP反应，根据平板菌落计数结果 与阳性扩增，计算检出限。8.环介导等温扩增产物检测(1)白色沉淀的观察各反应后的EP以5000rpm离心5分钟，在EP管底可见白色 沉淀为阳性结果。(2)与染料反应观察反应结束后的产物中加入SYBR Green染料，阳性结果紫外 灯下会呈现出绿色。(3)凝胶电泳的观察将扩增产物点样于含终浓度0. 5 μ g/ml的溴化乙锭(EB)的 1. 5%琼脂糖凝胶上，80V电压，电泳40分钟，于紫外灯下观察。阳性结果呈典型的梯状条 带，阴性则无扩增条带。结果1.构建参比模板的LAMP引物，其中一组引物序列如下cesA-F3 :5， -AAGGAGTTTGTCTTTTTCGG-3，cesA-B3 :5， -CGAACAACTTCAGCGACA-3，cesA-FIP :5，-TGGCGAATCCTATTTGAAGATATCA-GAGCACAATTTCTTCTCCAC-3，cesA-BIP :5，-GACAACCAAATGATGCACAGCA-AGGTCCTGTCTTGAAGGC-3，2.环介导等温扩增引物反应条件优化结果最适的Mg2+浓度为2mM，该LAMP反应 以65 °C，60分钟为宜。
3.环介导等温扩增引物的特异性检测结果上述引物只是将带毒的蜡样芽孢杆 菌DNA扩增出典型梯状条带的电泳阳性结果，且与SYBR Green染料呈现绿色变化，该阳性 扩增产物可被预设的TaqI酶切；而不带毒的蜡样芽孢杆菌及非蜡样芽孢杆菌扩增结果均 为阴性(图4)。表明该引物有良好的特异性。4.环介导等温扩增引物的灵敏性检测结果用无菌水梯度稀释浓度为 1. lX109cfu/ml蜡样芽孢杆菌菌液，通过凝胶电泳显示当菌液稀释至10_8时仍可检测出阳 性条带(图5)，表明该带毒蜡样芽孢杆菌LAMP引物对其扩增检出限达到llcfu/ml。而用 SYBR Green染料则最低可检出菌液稀释至10_7倍(图6)。
权利要求
一种用于检测致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增(LAMP)特异引物对，其特征在于表达呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌的LAMP引物对。
2.根据权利要求1所述的致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增(LAMP)特异引物对， 其特征在于，所述的致病性蜡样芽孢杆菌携带有质粒PCER270。
3.根据权利要求2所述的致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增(LAMP)特异引物 对，其特征在于，所述的含有质粒PCER270的致病性蜡样芽孢杆菌具有呕吐毒素合成酶 A(cesA)和 B(cesB)基因。
4.根据权利要求1所述的致病性蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增(LAMP)特异引物对， 其特征在于，所述的LAMP引物对针对的靶序列包括cesA或cesB基因；所述引物对包括内 引物对(ces-FIP、BIP)和外引物对(ces-F3、B3)，且可使靶基因序列进行环形特异扩增，扩 增片段大小呈梯度变化。
5.一种用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的LAMP试剂盒，其特征在于，包括(1)环介导等温扩增反应基本体系；(2)环介导等温扩增反应所需的内外引物对；(3)说明书。
6.一种适用于呕吐型蜡样芽孢杆菌环介导等温扩增的检测方法，其特征在于，包括(1)扩增反应总体系1.6iimol FIPU. 6umol BIP、0. 2 ii molF3、0. 2 ii mol B3、20mmol Tris-HCl (PH8. 8) UOmmol KCl、2mmol MgS04、lOmmol (NH4) 2S04、0. 1 % Triton X-100、 1. 4mmol dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、4. Ou L模板DNA，加双蒸水补至总体积为25 yl。(2)扩增反应时Mg2+浓度为2-12mM，反应温度为60_65°C，反应时间为20-70分钟。(3)扩增反应程序将除BstDNA聚合酶以外的所有反应物混勻后95°C水浴5分钟，迅 速放在冰上冷却5分钟，冷却后加入Bst DNA聚合酶，65°C水浴箱孵育反应60分钟，80°C孵 育10分钟终止反应。(4)阳性结果的判断白色沉淀的观察各反应后的EP以5000rpm离心5分钟，在EP管底可见白色沉淀为阳性结果。与染料反应观察反应结束后的产物中加入SYBR Green染料，阳性结果紫外灯下会呈 现出绿色。凝胶电泳的观察将扩增产物点样于含终浓度0. g/ml的溴化乙锭(EB)的1. 5%琼 脂糖凝胶上，80V电压，电泳40分钟，于紫外灯下观察。阳性结果呈典型的梯状条带，阴性则 无扩增条带。
全文摘要
本发明涉及致呕吐型食物中毒的蜡样芽孢杆菌的环介导等温扩增检测所需特异引物对及方法。所述的引物对可制得一种LAMP检测试剂盒，所述的试剂盒可用于表达呕吐毒素的致病性蜡样芽孢杆菌的快速检测。具体解决方案是以呕吐型蜡样芽孢杆菌携带的质粒pCER270的cesA/B基因为靶序列，设计涵盖整个靶序列的多组环介导等温扩增(LAMP)内外引物对。本发明包括致呕吐型蜡样芽孢杆菌cesA/B基因特异性LAMP引物对、优化的反应条件、环介导等温扩增程序、最低检出限的测定及阳性结果鉴定。本发明对呕吐型蜡样芽孢杆菌所采用的环介导等温扩增方法，具有快速高效、灵敏性特异性高、简便实用等优点。
文档编号C12Q1/68GK101831493SQ20091027267
公开日2010年9月15日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者付云洁, 刘志国, 房国梁, 李琦 申请人:武汉工业学院