虾成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开虾成分环介导等温扩增引物、试剂盒及检测方法，其碱基序列如SEQ?ID?NO.17～20；采用LAMP检测技术，建立了适用于食品中虾成分特异性检测的方法，本发明所述方法操作简单，不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，检测效率达到传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。
【专利说明】虾成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种虾成分环介导等温扩增(LAMP)引物、试剂盒及检测方法。
【背景技术】[0002]食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病，引起变态反应的抗原被称为变应原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分会引起6%至8%的儿童和2%的成人的过敏反应，严重的会危及生命。预包装食品由于多是成分复杂的深加工产品，如果含有致敏原成分而又未能明确告之，就有可能引起过敏，危害消费者的健康安全。目前大约有160多种食品致敏原，甲壳类动物为常见的致敏原之一。在可供食用的甲壳类动物中，最普遍为人类消费的是虾。虾也是最常见引起过敏反应的种类。2003年以来，欧盟、美国、香港等发达国家和地区相继制定了预包装食品致敏原标识要求的法规，并已于2005年起陆续发布和实施，对我国食品出口贸易造成了明显影响。由于目前我国在食品致敏原成分检测方法领域技术薄弱，随着越来越多国家和地区对食品致敏原成分标识法规的全面实施，食品标签的致敏原成分标识要求和符合性检验将会成为我国食品出口贸易的重要障碍。
[0003]虫下(shrimp)属节肢动物门(Arthropoda)甲壳亚门(Crustacea),种类很多，包括青虾、河虾、草虾、小龙虾、对虾、明虾、基围虾、琵琶虾、龙虾等。
[0004]目前，致敏原成分检测方法主要有酶联免疫法、聚合酶链式反应法、色谱质谱法、表面等离子共振免疫法等。但是不同的方法的检测限存在较大的区别，因此机构之间、国家之间应该采用一种检测结果较为精确、重复性较好的标准方法。目前较多国家所认可的方法是酶联免疫法。但是酶联免疫法也受许多因素制约，如被测食品母体、检测人员、试剂盒等。随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的新型鉴定技术已日益得到广泛应用。环介导等温扩增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基础上创建的一种较理想的手段，LAMP引物包括两个外引物和两个内引物，特异结合靶序列上的6个特异区域。内引物FIP包含Flc (与Fl区域互补)和F2序列，内引物BIP包含Blc (与BI区域互补)和B2序列，外引物为F3和/或B3序列，本发明在内外引物的基础上引入环引物BLP，大大缩短了反应时间，具体LAMP的引物组成及对应区域信息见图1。其特点是:①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性:采用六个区段，四条引物，扩增特异性高，可以根据是否扩增来判断目标基因的存在与否；③快速、高效扩增:扩增在不到Ih即可完成，且产率高；④灵敏度高:扩增模板可达10拷贝或更少；⑤鉴定简便:在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可用肉眼观察判断扩增与否；另外，它利用恒温和低反应温度(63°C )，减少细胞损伤，检测人员实际操作非常简便。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测、致敏原成份检测等领域具有广阔的应用前景。
[0005]本发明拟在前期研究的基础上，将LAMP检测技术应用于食品中过敏原成分虾的检测，针对虾线粒体12S rRNA基因，应用四条特异引物在恒温的条件下、简易的设备中，仅用一小时左右有效的完成筛查任务，结果判断简单，既能节省时间，又可大大降低检测成本，适用于基层实验室，可作为传统PCR方法的有益补充。
【发明内容】
[0006]本发明的技术方案为:通过考察并锁定南美白对虾成分靶基因，然后设计合成4套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID N0.1~20 ;，优化体系，最后确定一套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID N0.17~20 ;进而确定了 LAMP方法的技术参数，最后验证引物特异性、灵敏度、稳定性。本发明的具体技术方案如下:
[0007]本发明涉及一种检测虾成分的环介导等温扩增引物，其碱基序列为SEQ IDN0.17~20，如下:
[0008]F3 tagaaaccga cctggctc(SEQ ID N0.17)
[0009]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.18)
[0010]FIP(Flc+F2)gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQ IDN0.19)
[0011]BIP(Blc+B2)ccttaattca acatcgaggt cgacagcgta atcttctttg agag (SEQ IDN0.20)
[0012]本发明的另一方面涉及一种虾成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其中，检测试剂盒包括检测引物:SEQ ID N0.17~20。
[0013]优选的情况下:对于上述虾成分的环介导等温扩增法检测试剂盒中，每25ul反应体系中包括:
[0014]SEQ ID NO: 19 ~20 各 1.6 μ M，SEQ ID NO: 17 ~18 各 0.2 μ M，20mM ρΗ8.8 的Tris-HCl, IOmM KCl,6mM MgSO4,10mM(NH4)2S04，0.l%Tween20，IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8UBst 大片断 DNA聚合酶，0.5μ I SYT0-9。
[0015]上述试剂盒在使用过程中，除了按上述反应体系加入上述试剂之外，还需要加入模板DNA和蒸馏水(补足25 μ L反应体系)，再进行LAMP扩增反应。
[0016]本发明的另一方面在于，公开一种利用上述虾成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，来检测虾成分的方法，其方法步骤包括:
[0017]①提取待测样品的基因组DNA ;
[0018]②以步骤①提取的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测:
[0019]每25μL 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO: 19 ~20 各 L 6 μ M，SEQ ID NO:17 ~18 各 0.2 μ M，20mM ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20,IM甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst大片断DNA聚合酶，0.5 μ I SYT0-9,2y I DNA模板、蒸馏水:
余量；
[0020]反应条件为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s,45个循环。[0021]③检测结果以扩增曲线进行判断。
[0022]本发明的另一方面在于，公开一种利用上述的环介导等温扩增引物在检测虾成分方面的应用。
[0023]本发明的创新特征是:
[0024]本发明将LAMP检测技术应用于虾12S rRNA特异基因检测，针对南美白对虾12SrRNA特异基因，应用特异引物在恒温的条件下、简易的设备中，仅用一小时左右有效的完成筛查任务，结果判断简单，既能节省时间，又可大大降低检测成本，适用于基层实验室，可作为传统PCR方法的有益补充。
[0025](I)本研究针对南美白对虾12S rRNA特异基因设计了四套引物，从中筛选出一套出峰时间早，信号强的引物12S rRNA-4，将反应条件控制在63 °C，45min进行检测，成功建立了虾成分的LAMP检测方法；
[0026](2)进行了引物12S rRNA-4的灵敏度实验，结果显示该引物检测限可达0.5% (含DNA 浓度为 0.5ng/yL)；
[0027](3)进行了引物12S rRNA-4的引物特异性，结果显示该引物特异性良好，对(IOOng/ μ L)黄花鱼、扇贝、黄金鲽鱼、虾夷贝、南美鳕鱼、狭鳕鱼、柳叶鱼、牛眼蛤、沙丁鱼、白舰子、杂色蛤、北极虾、鳕蟹、庸鲽鱼、文蛤、真鳕鱼、蛇鲅鱼、贻贝、金枪鱼、章鱼、鲐鲅鱼、牡蛎、鲽鱼、马哈鱼、比目鱼、鲱鱼均无非特异扩增；
[0028](4)进行了引物12S rRNA-4的稳定性实验，结果显示引物5%(含DNA浓度为5ng/μ L)，1% (含DNA浓度为lng/ μ L)及0.5% (含DNA浓度为0.5ng/ μ L)的稳定性均良好。
[0029](5)进行了引物12S rRNA-4的实际样品实验，结果显示引物对芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺不能检出，对南美白对虾DNA、熟虾酱、蜢子虾酱有检出。性能参数等同于传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业标准应用推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1:LAMP的引物组成及对应区域信息；
[0031]图2:12S rRNA-1引物的LAMP反应结果
[0032]图3:12S rRNA-2引物的LAMP反应结果；
[0033]图4:12S rRNA-3引物的LAMP反应结果；
[0034]图5:12S rRNA-4引物的LAMP反应结果；
[0035]图6:LAMP 引物 12S rRNA-4 的灵敏度；
[0036]图7:12S rRNA-4引物特异性鉴定图；
[0037]图8:5%精密度实验图；
[0038]图9:1%精密度实验图；
[0039]图10:0.5%精密度实验图；
[0040]图11:0%精密度实验图；
[0041]图12:实际样品检测图；。【具体实施方式】
[0042]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0043](I)LAMP引物设计步骤如下:
[0044]①查阅南美白对虾相关文献，了解不同品系南美白对虾中的特异基因，选取12SrRNA基因为南美白对虾特异基因；
[0045]②在NCBI网站中查找所挑选的基因序列；
[0046]③利用DNAMAN软件对查到的各序列进行比对，比对结果表明12S rRNA基因具有一定的保守性；
[0047]①设计4套特异引物，即虾LAMP引物12S rRNA_l，虾LAMP引物12S rRNA-2,虾LAMP引物12S rRNA-3，虾LAMP引物12S rRNA_4，碱基序列如下:
[0048]虾LAMP 引物 12S rRNA-1
[0049]F3 gatagaaacc gacctggc (SEQ ID N0.1)
[0050]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.2)
[0051]FIP(Flc+F2) gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQID N0.3)
[0052]BIP(Blc+B2) aggatacctt aattcaacat cgagacagcg taatcttctt tgagag (SEQID N0.4)
[0053]BLP gtcgcaaccc ttcctgtcg (SEQ ID N0.5)
[0054]虾LAMP 引物 12S rRNA-2
[0055]F3 atagaaaccg acctggct (SEQ ID N0.6)
[0056]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.7)
[0057]FIP(Flc+F2) gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQID N0.8)
[0058]BIP(Blc+B2) aggatacctt aattcaacat cgaggcgtaa tcttctttga gagtccat(SEQ ID N0.9)
[0059]BLP tcgcaaccct tcctgtcg (SEQ ID N0.10)
[0060]虾LAMP 引物 12S rRNA-3
[0061]F3 tagaaaccga cctggctc (SEQ ID N0.11)
[0062]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.12)
[0063]FIP(Flc+F2) gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQ IDN0.13)
[0064]BIP(Blc+B2) ccttaattca acatcgaggt cgcgcgtaat cttctttgag agtc (SEQ IDN0.14) [0065]BLP aacccttcct gtcgatatg (SEQ ID N0.15)
[0066]BLP cagcaggagg gtggctacca (SEQ ID N0.16)
[0067]虾LAMP 引物 12S rRNA-4
[0068]F3 tagaaaccga cctggctc (SEQ ID N0.17)
[0069]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.18)[0070]FIP(Flc+F2)gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQ IDN0.19)
[0071]BIP(Blc+B2)ccttaattca acatcgaggt cgacagcgta atcttctttg agag (SEQ IDN0.20)
[0072](2 ) LAMP反应体系的建立
[0073]①精提DNA的实验方法参考《分子克隆实验指南第三版》(萨姆布鲁克D.W拉塞尔著.科学出版社2002 [美]J.黄培堂等译)。
[0074]精提DNA的浓度及纯度的测定:
[0075]取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀释至lmL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算获得:
[0076]C=AXNX50/1000 式中:
[0077]C-DNA 浓度(μ g/ μ L)
[0078]A——260nm处的吸光值
[0079]N——核酸稀释倍数
[0080]IOD260nm = 50 μ g/mL 双链 DNA，当 0D26(l/0D28(l 比值在 1.7 ~1.9 之间时，适宜于 LAMP检测。
[0081]②按照步骤①的方法制备南美白对虾DNA (lOOng/yL)，并将其作为阳性模板，ddH20 作为阴性对照，分别用各套引物(12S rRNA-ΙU2S rRNA-2U2S rRNA-3U2S rRNA-4)的内外引物进行LAMP反应，反应体系如下: [0082]25 μ L的LAMP反应体系，其成分包括:FIP和BIP各1.6 μ M，F3和/或83各0.2 μ M，FLP 和 / 或 BLP 各 0.8μΜ，20πιΜ Tris-HCl (pH8.8), IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM 甜菜碱，1.6mM dNTP, 8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 μ 1SYT0-9, 2 μ I DNA模板。
[0083]具体操作时先在冰上准备LAMP反应混合液，扩增反应体系如下:12.5 μ L反应液RM，8 μ L超纯水DW，I μ L引物PM，I μ L Bst酶，0.5 μ I SYT0-9以及2 μ L模板。将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23 μ L，再分别加入2 μ L模板DNA或阴阳性对照模板，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，60个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物，结果如图2~5所示:
[0084]设计的4套引物中，图2中的12S rRNA-1引物有出峰，图3中的12S rRNA-2引物有出峰，图4中的12S rRNA-3引物有出峰，图5中的12S rRNA-4引物约27min出峰可用，可以初步将反应时间定在60min进行特异性和灵敏度等实验。
[0085]实施例2RT-4引物灵敏度实验
[0086]按照实施例1所述方法分别精提扇贝和南美白对虾(购自农贸市场)的DNA:
[0087]将南美白对虾DNA用扇贝DNA分别稀释到质量比为10%，5%，1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%,0.01%几个梯度，每个稀释度分别取2 μ I进行LAMP实验，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以12S rRNA-4作为LAMP引物，进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s,45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，以确定LAMP反应的灵敏度。[0088]以确定LAMP反应的灵敏度，同时根据最低灵敏度出峰时间及假阳性最早出峰时间，确定反应时间。反应结果如下图6所示:
[0089]从图6中可以看出，将南美白对虾DNA稀释至不同浓度梯度，12S rRNA_4作为LAMP引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化，检测灵敏度可达0.5%，最低检出限出峰时间约在32min，可以将反应时间确定在60min。
[0090]由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0091]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0092]②南美白对虾DNA用扇贝DNA分别稀释到质量比为0.1%，0.05%的时候，为平直的线，没有扩增峰出现，引物12S rRNA-4无法检测。
[0093]③南美白对虾DNA用扇贝DNA分别稀释到质量比为5%，2%，1%，0.5%几个梯度时候，分别扩增出实线的峰，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化；证明引物12S rRNA-4能够检测模板为浓度为0.5%以上的(含DNA浓度为0.5ng/ μ L)，约36min出峰。
[0094]因此，确定LAMP弓丨物12S rRNA-4的模板检测灵敏度为0.5% (0.5ng/ μ L)。
[0095]实施例3LAMP弓丨物特异性实验
[0096]按照实施例1所述方法分别精提下述样品的DNA:
[0097]南美白对虾、青虾、基围虾、草虾、沙虾、濑尿虾、黄花鱼、扇贝、黄金鲽鱼、虾夷贝、
南美鳕鱼、狭鳕鱼、柳叶鱼、牛眼`蛤、沙丁鱼、白舰子、杂色蛤、鳕蟹、庸鲽鱼、文蛤、真鳕鱼、蛇鲅鱼、贻贝、金枪鱼、章鱼、鲐鲅鱼、牡蛎、鲽鱼、马哈鱼、海蟹、河蟹
[0098]分别以精提的上述各样品DNA (提取后，样品DNA的浓度均为IOOng/μ L)作为LAMP反应的模板，用12S rRNA-4作为LAMP引物，进行LAMP反应，其反应体系同实施例2，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为630C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，验证LAMP反应的特异性，利用荧光定量PCR仪观察反应结果。
[0099]图7中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0100]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0101]②南美白对虾DNA检测的时候，扩增出实线的峰，证明引物12S rRNA-4能够检测模板为南美白对虾的阳性样品，且对青虾、基围虾、草虾、沙虾、濑尿虾样品也能特异性检出，特异性较好。
[0102]③黄花鱼、扇贝、黄金鲽鱼、虾夷贝、南美鳕鱼、狭鳕鱼、柳叶鱼、牛眼蛤、沙丁鱼、白舰子、杂色蛤、鳕蟹、庸鲽鱼、文蛤、真鳕鱼、蛇鲅鱼、贻贝、金枪鱼、章鱼、鲐鲅鱼、牡蛎、鲽鱼、马哈鱼、海蟹、河蟹DNA样品扩增曲线为平直的线，没有扩增峰出现，引物12S rRNA-4无法检测。
[0103]因此，确定LAMP引物12S rRNA_4只对南美白对虾、青虾、基围虾、草虾、沙虾、濑尿虾特异性检出，特异性较好；用其继续进行下述的精密度实验。
[0104]实施例4精密度稳定性实验
[0105](一)5%精密度实验
[0106]将南美白对虾DNA用扇贝DNA稀释到5% (5ng/yL)作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以南美白对虾DNA( IOOng/ μ L)作为阳性对照，以12S rRNA-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s,I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s, 45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察5%精密度LAMP反应的稳定性。20份平行样品检测结果如图8:[0107]图8中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0108]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0109]②将南美白对虾DNA用扇贝DNA稀释到5% (5ng/yL)作为模板，进行检测的时候，20份样品均扩增出实线的峰，证明引物12S rRNA-4能够检测模板为5ng/μ L的南美白对虾样品。
[0110]上述结果显示出5% (5ng/yL)精密度的稳定性良好。
[0111](二)1%精密度实验
[0112]将南美白对虾DNA用扇贝DNA稀释到1% (Ing/ μ L)作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以南美白对虾DNA( IOOng/ μ L)作为阳性对照，以12S rRNA-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s,I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s, 45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察1%精密度LAMP反应的稳定性。检测结果如图9:
[0113]图9中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0114]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0115]②将南美白对虾DNA用扇贝DNA稀释到1% (Ing/ μ L)作为模板，进行检测的时候，20份样品均扩增出实线的峰，证明引物12S rRNA-4能够检测模板为Ing/μ L的南美白对虾样品。
[0116]上述结果显示出1% (lng/μ L)精密度的稳定性良好。
[0117](三)0.5%精密度实验
[0118]将南美白对虾DNA用扇贝DNA稀释到0.5% (0.5ng/yL)作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以南美白对虾DNA (IOOng/ μ L)作为阳性对照，以12S rRNA-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为630C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察0.5%精密度LAMP反应的稳定性。
[0119]图10中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0120]①模板为ddH20的阴性对照为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果；
[0121]②将南美白对虾DNA用扇贝DNA稀释到0.5% (0.5ng/μ L)作为模板，进行检测的时候，20份样品均扩增出实线的峰，证明引物12S rRNA-4能够检测模板为0.5ng/ μ L的南美白对虾样品。
[0122]上述结果显示出0.5% (0.5ng/yL)精密度的稳定性良好。
[0123](四)阴性精密度实验
[0124]以ddH20代替DNA模板作为0%精密度和阴性对照模板，以南美白对虾DNA( IOOng/μ L)作为阳性对照，以12S rRNA-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s, 45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，20个平行样品观察0%精密度LAMP反应的稳定性。检测结果如图11:
[0125]图11中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0126]①20份模板为ddH20的阴性样品均为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果;
[0127]②将提取的南美白对虾DNA (lOOng/μ L)作为阳性对照，进行检测的时候，扩增出实线的峰，证明引物12S rRNA-4能够检测南美白对虾样品，引物有效。
[0128]上述结果显示出0%精密度的稳定性良好。
[0129]实施例5实际样品实验
[0130]以熟虾酱、蜢子虾酱、芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺的DNA作为模板，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以南美白对虾DNA (IOOng/μ L)作为阳性对照，以12S rRNA-4作为LAMP引物进行LAMP扩增，反应体系按照实施例2的方法进行，参照荧光PCR仪使用说明书，设置反应程序为:保温阶段为63°C 30s，I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环，于63°C 45s处收集荧光信号，观察实际样品检测情况。
[0131]图12中由于附图中原彩色的曲线扩增图，转变为黑白色之后，无法明确指示各样品的扩增情况，因此以文字描述其图片内容，具体信息如下:
[0132]①模板为ddH20的阴性样品均为平直的线，没有扩增，说明本发明没有假阴性结果;
[0133]②将提取的南美白对虾DNA (lOOng/μ L)作为阳性对照，进行检测的时候，扩增出实线的峰，证明引物有效。
[0134]③将提取的lOOng/μ L熟虾酱、蜢子虾酱作为模板，进行检测的时候，扩增出实线的峰，引物12S rRNA-4对熟虾酱、蜢子虾酱实际样品有检出，与实际结果相符。
[0135]④将提取的IOOng/μ L非南美白对虾DNA(芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺)作为模板，进行检测的时候，扩增出平滑的直线，无扩增曲线，证明引物12S rRNA-4对芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻酱、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水饺、猪肉芹菜水饺实际样品无检出，与实际结果相符。
[0136通过反复试验，以上实验数据显示，本发明研制的虾成分的LAMP检测方法(反应体系和反应条件如实施例2)，适用于虾成分的检测，定性检测低限为0.5%，检测的稳定性达到100%，灵敏度达到0.5%，特异性达到100%，均符合推广应用的实际要求。能够应用于实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。
【权利要求】
1.一种检测虾成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQ ID N0.17~20。
2.一种检测虾成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物:SEQID N0.17 ~20。
3.根据权利要求2所述的检测虾成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，在检测试剂盒中: 每 25 μ L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:19 ~20 各 L 6 μ Μ, SEQ ID NO:17 ~18各 0.2μΜ，20πιΜ ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM (NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 μ I SYT0-9,2y I DNA 模板。
4.利用权利要求2所述试剂盒检测虾成分的方法，其特征在于，检测步骤包括: ①提取待测样品的基因组DNA； ②以步骤①提取的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测: 每 25 μ L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:19 ~20 各 L 6 μ Μ, SEQ ID NO:17 ~18各 0.2μΜ，20πιΜ ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM (NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst大片断DNA聚合酶，0.5 μ I SYT0-9,2y I DNA模板、蒸馏水:余量; 反应条件为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s,45个循环。
5.如权利要求1所述的环介导等温扩增引物在检测虾成分方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103468816SQ201310433789
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】徐君怡, 曹际娟, 徐杨, 史媛媛 申请人:徐君怡, 曹际娟, 徐杨, 史媛媛