鉴定虫草的环介导等温扩增方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及虫草的鉴定方法和试剂盒及其应用，尤其涉及冬虫夏草的鉴定方法与 试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草（Cordyceps sinensis)，又名中华虫草，是中国传统的名贵中药材，是 由肉座菌目、麦角菌科、虫草属的冬虫夏草菌，寄生于高山草甸土中的蝠蛾幼虫，使幼虫身 躯僵化直至其死亡。经过一个冬天，到第二年春天来临，霉菌菌丝开始生长，到夏天时长出 地面，由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成，即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核(幼虫尸 体）构成的复合体。冬虫夏草主要产于中国青海、西藏、四川、云南、甘肃和贵州等省及自治 区的高寒地带和雪山草原。
[0003] 真正的冬虫夏草均为野生，生长在海拔3000米至5000米的高山草地灌木带上面 的雪线附近的草坡上。由于冬虫夏草具有极高的药用和营养价值，而真正野生的冬虫夏草 产量小，供不应求，其商业价值不断增长。为确保真正的冬虫夏草药用品质和商业价值，对 真正的冬虫夏草的鉴定是非常重要的。
[0004] 冬虫夏草通常含有虫草酸约7%，碳水化合物约28. 9%，脂肪约8. 4%，蛋白质约25%， 脂肪中82. 2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素 B12、麦角脂醇、六碳糖醇、生物碱等。目 前还没有发现冬虫夏草中含有特异的化合物能够作为特异化学标志物来对其进行鉴定，因 此至今未发现可以采用化学的方法来鉴定冬虫夏草。基于多聚酶链式反应（PCR)开发的鉴 定方法因需要热循环仪和电泳仪等设备而使得鉴定成本提高，同时实验过程费时耗力，也 有待进一步改进。
【发明内容】
[0005] 第一方面，本申请提供一种鉴定虫草的环介导等温扩增（LAMP)方法，包括，
[0006] 提取欲鉴定虫草样品的DNA，作为DNA模板，
[0007] 提供用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis或C. sinensis)的特异序列而设计的，
[0008] 将所述引物与DNA模板与接触，在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增，
[0009] 确定所述扩增产物或副产物的存在，例如通过肉眼或荧光或紫外光照射观察所述 产物或副产物，或通过核酸染料溴化乙錠 、SYBR Green、EvaGreen、GelRed等在自然光线下 和（或）紫外光线下观察所述扩增产物。如果存在所述的产物或副产物，所鉴定的虫草样 品即为冬虫夏草。
[0010] 在一些实施方案中，如果所述方法得到的产物或副产物不存在，所述方法则进一 步包括将所述DNA模板与针对假冬虫夏草的特异序列的引物接触，从而鉴定所述虫草样品 为假冬虫夏草，在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii或 C. gunnii)或虫甬虫草（Cordyceps miIitaris 或 C. miIitaris)〇 toon] 第二方面，提供一种利用环介导等温扩增方法鉴定虫草的试剂盒，其包含用于环 介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis或)的特异序 列而设计的。
[0012] 在一些实施方案中，所述试剂盒还包括针对假冬虫夏草的特异序列的引物。在一 些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii)或蛹虫草（Cordyceps militaris)。在一些实施方案中，所述试剂盒用于实施第一方面所述的方法。
【附图说明】
[0013] 图1显示了利用内部控制引物对冬虫夏草（C. sinensis)、古尼虫草（C. gunnii)和 蛹虫草（C.militaris)DNA样品进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲 线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。
[0014] 图2显示了利用针对冬虫夏草特异序列所设计的引物对冬虫夏草样品 (T2973，T2975和T2996)、古尼虫草样品（T2983和T2984)和蛹虫草样品（T3004)DNA进行环 介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲 线进入平台期）情况。
[0015] 图3显示了利用针对古尼虫草特异序列所设计的引物对古尼虫草样品（T2983和 T2984)、冬虫夏草样品（T2973，T2975和T2996)和蛹虫草样品（T3004)DNA进行环介导等温 扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平 台期）情况。
[0016] 图4显示了利用针对蛹虫草特异序列所设计的引物对蛹虫草样品（T3004)、冬虫 夏草样品（T2973, T2975和T2996)和古尼虫草样品（T2983和T2984)DNA进行环介导等温 扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平 台期）情况。
[0017] 图5显示利用内部控制引物对冬虫夏草（T2973，T2975和T2996)、古尼虫草 (Τ2983和Τ2984)和蛹虫草（Τ3004)样品DNA进行环介导等温扩增（LAMP)、以及利用针对冬 虫夏草特异序列所设计的引物对冬虫夏草（T2973, T2975和T2996)DNA样品进行环介导等 温扩增后得到的DNA，通过用溴乙非啶标记的1%凝胶电泳的结果。其中M为IOObp的DNA 梯状分子标志，并指示了 SOObp所处的位置。
[0018] 图6显示显示了利用针对古尼虫草特异序列所设计的引物对古尼虫草（T2983和 T2984)DNA样品进行环介导等温扩增、以及利用针对蛹虫草特异序列所设计的引物对蛹虫 草（T3004)DNA样品进行环介导等温扩增后得到的DNA，通过用溴乙非啶标记的1%凝胶电泳 的结果。其中M为IOObp的DNA梯状分子标志，并指示了 800bp所处的位置。
[0019] 图7显示了上述环介导等温扩增增后，通过核酸染料在自然光线下和紫外光线下 所观察到的结果。
[0020] 图1-7中所示"neg"为阴性对照。
[0021] 图8为LAMP引物设计的示意图。
【具体实施方式】
[0022] 第一方面，本申请提供一种鉴定虫草的环介导等温扩增方法，包括，
[0023] 提取欲鉴定虫草样品的DNA，作为DNA模板，
[0024] 提供用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis)的特异序列而设计的，
[0025] 将所述引物与DNA模板与接触，在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增，
[0026] 确定所述扩增产物或副产物的存在，例如通过肉眼或荧光或紫外光照射观察所述 产物或副产物，如果存在，所鉴定的虫草样品即为冬虫夏草。在一些实施方案中，所述副产 物为焦磷酸镁沉淀，或者是通过核酸染料溴化乙錠 、SYBR Green、EvaGreen、GelRed等在自 然光线下和（或）紫外光线下观察所述扩增产物。
[0027] 在一些实施方案中，如果所述方法得到的产物或副产物不存在，所述方法则进一 步包括将所述DNA模板与针对假冬虫夏草的特异序列的引物接触，从而鉴定所述虫草样品 为假冬虫夏草，在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii) 或虫甬虫草（Cordyceps militaris)。
[0028] 在一些实施方案中，所述环介导等温扩增环介导等温扩增LAMP的引物是针对预 鉴定的虫草特异序列中6个不同区域设计的4个引物，例如，如图8所示，针对所述特异序 列3'端的？3、？2、83、82以及5'端的？1(：、81(：、82、83等6个不同区域或位点设计4种引 物。所述4种引物包括：（I) FIP :上游内部引物，由FlC区和F2区组成，F2区能与虫草特 异序列的F2C互补或严紧杂交，FlC区与特异序列的FlC区序列相同；（2) F3引物：上游外 部引物，由F3区组成，并能与虫草特异序列的F3C区互补或严紧杂交；（3) BIP :下游内部 引物，由BlC区和B2区组成，B2区能与虫草特异序列的B2C互