一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 猪细小病毒（PorcineParvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，其特征 是孕猪在怀孕前期受到感染时，经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起母猪流产、胚胎死亡、 胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻，以及新生仔猪大量死 亡。
[0004]PPV最早是从培养猪细小病毒病的细胞中发现的一种小DNA污染病毒，1967年Carwtright等从不妊症，流产和死产猪中分离出PPV，随后发现该病毒呈世界性分布，是引 起猪胚胎和胎儿死亡的主要病原之一。我国在1953年首次从上海分离到该病毒，此后全国 各地均有本病发生的报道。PPV对养猪业危害较大，感染率高，在我国经产母猪及种公猪感 染率高达92%。近年来，随养猪业的发展，大型集约化猪场的相继出现，该病呈明显扩大上升 的趋势，给我国乃至全球养猪业带来巨大的经济损失。
[0005] 猪细小病毒病是危害我国养猪生产的重要疫病之一，对猪细小病毒病密切监测和 快速诊断，有利于该病的防治。目前，PPV的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。 常规方法是病毒的分离鉴定，其结果准确可靠，但常规鉴定方法存在操作复杂，需要复杂的 仪器设备，所需时间长的缺点，不利于猪细小病毒病的快速诊断。分子生物学的方法是通过 聚合酶链式反应（PCR)方法检测猪细小病毒病病毒的特异性基因，虽然PCR方法较常规方 法快速准确，但需要设计特异性强的引物和昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要 进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检 测 。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪细小病毒的方法，公开一种 快速、实时定量的检测猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技 术方案为：一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2X反应缓冲 液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细小病毒DNA模板，所述的LAMP引物 包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引物FIP(SEQIDN0:3)与BIP (SEQIDN0:4)和环引物LF(SEQIDN0:5)与LB(SEQIDN0:6);; 其中引物的序列分别为： F3GAAACCTAAATCCACCAACAT B3GGAGGCAGTCCTAGAGATC FIPACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC BIPGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT LFATGTCACTGTGTAGTCCTGTTTGT LBTATCACTTTGACACAAAACCACTAA 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0007] 所述的猪细小病毒DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒从疑似猪细 小病毒病变组织或猪细小病毒培养物中提取的猪细小病毒基因组DNA。
[0008] 所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0009]所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgS04 15-28mM、 (NH4)2S04 18-28mM、Tween20 0· 5-1. 5 %、Betaine1. 3-3. 5M和dNTPs2. 4-4. 8mM，其配 制方法在pH为8. 6左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似猪细小病毒病变组 织或猪细小病毒培养物中是否含有猪细小病毒，具体检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 猪细小病毒DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
[0011] 所述的LAMP反应体系建立以25μL计， 2X反应缓冲液 12. 5yL Bst DNA聚合酶 1 μL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol B3 5pmol LF 20 pmol LP 20 pmol 猪细小病毒DNA 2 μL 超纯水 补足25μL。
[0012] 所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
[0013] 所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应 温度为63°C、反应在10-15分钟间出现扩增。
[0014] 本发明的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本发明的LAMP方法特异性检测出猪细小病毒，所检测的阴性对照病毒和水对照均无 阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪 器。
[0015] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为2. 16X10-8ng/μL，而使用本发明的LAMP检测方法，检 测限约为2. 16X10-10ng/μL，是普通PCR的100倍。
[0016] 3)迅速获得结果 普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在 反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获 取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在13分钟左右出现扩 增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过 肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明 显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫 外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像 或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时 内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反 应前加入的1丐黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本发明的 LAMP检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行 荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[0018] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度仪来实时分析LAMP反应的结果，不 同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求 出各时间的猪细小病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明LAMP方法特异性检测结果；其中1 :猪细小病毒；2 :猪圆环病毒II型；3 : 伪狂犬病毒；4 :猪瘟病毒；5 :蓝耳病病毒；6 : 口蹄疫病毒；7 :传染性胃肠炎病毒；8 :流行 性腹泻病毒；9:空白对照(水)。猪细小病毒反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株 对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增，为阴性结果。
[0020] 图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪细小病毒敏 感性检测的结果，其中 1 :2· 16X10ng/yL;2 :2· 16ng/yL;3 :2. 16X10-lng/yL;4 : 2. 16X10-2ng/μL; 5 ：2. 16Xl〇-3ng/μL；6 ：2. 16Xl〇-4ng/μL；7 ：2. 16Xl〇-5ng/μL； 8 :2. 16X10-6ng/μL;9 :2. 16X10-7ng/μL;10 :2. 16X10-8ng/μL;11 :2. 16X10-9 ng/μL;12 :2. 16X10-10ng/μL;13 :water。猪细小病毒原始DNA的起始浓度为2. 16X10 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限 约为2. 16X10-10ng/yL，而普通PCR方法检测限约为2. 16X10-8ng/yL。
[0021] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪细小病毒基因组DNA为模板的 反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0022] 图5是本发明猪细小病毒定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度 值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪细小病毒拷贝数。
【具体实施方式】
[0023] 1、材料的准备 猪细小病毒、猪圆环病毒II型、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、传染 性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒；为市售疫苗毒或广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMP DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204 ;病毒基因组DNA/RNA提取试 剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0552。
[0024] 2、LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的猪细小病毒VP2基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物， LF和LB为环引物；其中F3、B3为猪细小病毒PCR检测引物，其中 F3GAAACCTAAATCCACCAACAT B3GGAGGCAGTCCTAGAGATC FIPACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC BIPGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT LFATGTCACTG