TGTAGTCCTGTTTGT LBTATCACTTTGACACAAAACCACTAA 3、病毒基因组DNA提取 使用康为世纪生物科技有限公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取猪细小 病毒DNA或者疑似猪细小病毒感染的病变组织的基因组DNA，以及对照病毒的基因组RNA/ DNA〇
[0025] 4、LAMP反应体系建立 按照试剂盒说明书，按25μL体系配置： 2X反应缓冲液 12. 5yL Bst DNA聚合酶 1 μL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol B3 5pmol LF 20 pmol LP 20 pmol 猪细小病毒DNA 2 uL 超纯水 补足25 μL LAMP反应在以实时浊度仪（LA-320C，日本荣研公司）进行密闭全程监控的形式监测 本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达0.1 浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63°C做 为反应温度。
[0026] 5、LAMP检测方法 1)特异性检测 使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪细小病毒、猪圆环病毒II型、伪狂犬病毒、 猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒的基因组RNA/ DNA，作为LAMP反应的模板，进行各LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验LAMP方法的特 异性。
[0027] 2)敏感性检测 提取的猪细小病毒基因组DNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成 12个稀释度，以各DNA稀释度作为模板，进行本发明的LAMP方法扩增和常规PCR扩增，对比 本发明的LAMP方法和普通PCR对检测猪细小病毒的敏感性。
[0028] 3)荧光可视化检测 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙 黄绿素商用染料，63°C下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线 分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
[0029] 实施例1LAMP检测方法的特异性结果 对1株猪细小病毒、7株对照病毒和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，猪细小病 毒反应管在13分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照 反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。
[0030] 实施例2LAMP检测方法的敏感性结果 猪细小病毒原始DNA的起始浓度为2. 16X10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后， 进行LAMP和PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的LAMP法检测限约为 2. 16X10-10ng/yL，而常规PCR法检测限为 2. 16X10-8ng/yL。
[0031] 实施例3LAMP检测方法的荧光可视化检测结果 根据浊度仪监控优化的条件，反应器加入荧光染料，63°C反应60分钟后，在紫外灯下 观察，图4为观察结果，左管为以猪细小病毒基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右 管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的LAMP方法可以方便基层使用，只需使用 试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63°C60分钟，即 可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
[0032] 实施例4猪细小病毒定量标准曲线的绘制 以猪细小病毒DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体PMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林 抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒pMD18-T-VP2 的起始浓度，作为标准样品，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释12个稀释度，取各 稀释度2μL作为模板进行LAMP扩增， 设置对照：浓度为 2. 155X101ng/μL、2. 155ng/μL、2. 155X10-1ng/μL、 2.155X10-2ng/μL、2.155X10-3ng/μL、2. 155X10-4ng/μL、2. 155X10-5ng/μL、 2.155X10-6ng/yL、2. 155X10-7ng/yL、2. 155X10-8ng/yL、2. 155X10-8ng/yL、 2. 155X10-9ng/μL和 2. 155X10-10ng/μL的重组质粒pMD18-T-VP2 标准样品各一个， 因为样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为〇. 1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪 捕捉到的值与时间（如表1)做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=〇. 5136X-7. 3876,如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0. 9898,呈良好的线性关系。以时间为X值，可 求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为ΙΟ-y，再乘以基数2. 155,即为2. 155xl〇-y ng/yL。 依据拷贝数换算公式copies/μ L= (6.02 x 1023 x (ng/ul x 10-9)) / (DNA length x 660)，DNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+204=2897 bp，将其换 算成拷贝数（copies/μ L) :6.02 X 1023 X (2. 155xl〇-y X 10-9)/ (2897 X 660)，简化 之后为：6. 78x 108 x 10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为35分钟时，带入所 建立的标准曲线方程，求出Y等于10. 588,则浓度为10-10. 588,再乘以基数2. 155,即为该 试验样品的浓度2. 155X10-10. 588ng/yL，则其拷贝数为：6.78x 108 xlO-10. 588=6. 78X 10-2. 588copies/yL，从而达到定量的效果。
[0033] 表1样品浓度负对数值与PPV-LAMP浊度值时间线性关系表
【主权项】
1. 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2X 反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细小病毒DNA模板，所述的 LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引物FIP(SEQIDNO: 3)与BIP(SEQIDNO:4)和环引物LF(SEQIDNO:5)与LB(SEQIDNO:6); 其中引物的序列分别为： F3GAAACCTAAATCCACCAACAT B3GGAGGCAGTCCTAGAGATC FIPACTGGTACTGCATTTTCTATTGTGTGACAATCACAACAAATAACAGAC BIPGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGTGTTTGCCATGAGTGAGT LFATGTCACTGTGTAGTCCTGTTTGT LBTATCACTTTGACACAAAACCACTAA 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇2. 根据权利要求1所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪 细小病毒DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪细小病毒培养物或疑 似感染猪细小病毒的临床病变组织的基因组DNA。3. 根据权利要求1所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧 光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。4. 根据权利要求1所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2X 反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgS04 15-28mM、（NH4)2S04 18-28mM、 Tween20 0· 5-1. 5%、Betaine1. 3-3. 5M和dNTPs2. 4-4. 8mM〇5. -种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，兽医临床上用于检测 疑似猪细小病毒病变组织或猪细小病毒培养物中是否含有猪细小病毒，具体检测步骤包 括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 猪细小病毒DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。6. 根据权利要求5所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所 述的LAMP反应体系建立以25μL计， 2X反应缓冲液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1μL FIP 40pmol BIP 40pmol F3 5pmol B3 5pmol LF 20pmol 猪细小病毒DNA 2μL 超纯水 补足25μL。7. 根据权利要求5所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所 述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。8. 根据权利要求5所述的猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所 述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
【专利摘要】本发明公开一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst？DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪细小病毒DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。其应用包括使用该试剂盒检测猪细小病毒病变组织样品和猪细小病毒病原定性研究。检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出猪细小病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪细小病毒带来便利。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公开号】CN105349702
【申请号】CN201510869700
【发明人】陈忠伟, 何颖, 赵武, 卢冰霞, 梁家幸, 秦毅斌, 段群棚, 李斌, 周英宁, 蒋冬福, 杨思仪, 苏乾莲
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月27日