一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪戊型肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]戊型肝炎OfepatitisE)是一种由戊型肝炎病毒（HEV)引起的急性病毒性肝炎， 主要通过粪-口消化道传播。戊型肝炎呈全球分布，以暴发流行或散发感染的形式存在， 在世界范围内，无论HEV在这个地区是否流行，猪感染HEV的现象非常普遍。HEV主要 包括1~4个基因型，其中，基因4型具有人兽共患的性质，在人群和猪群中，主要以 基因4型HEV感染为主。研究发现从猪体内分离的基因4型HEV能够感染人，反之亦 然，并且基因4型HEV对人的致病性较其他基因型更强，危害也更大。
[0003] 戊型肝炎从1955~1956年在印度新德里第一次HE大暴发至今，已广泛分布于亚 洲、非洲及中美洲等发展中国家。我国HE的高发地区新疆，曾在1986~1988年间暴发该 病，是世界上一次大规模的流行，共计发病119280例，死亡707例。1997年Meng从猪体内 分离出1株野生型HEV，发现其与人类的HEV有极高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴， 因此推测猪可能是HEV感染的一个动物宿主。目前研究表明，HEV在猪群中普遍存在，已经 被世界卫生组织认定是发展中国家的一个重要公共卫生问题，从而引起公众对公共健康 和食品安全的普遍关注。因此，对猪源戊型肝炎诊断方法的研究十分必要。
[0004]对戊型肝炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪戊型肝炎病毒的关键。目前实验 室诊断HEV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、血清中和实验、免疫荧光 等；②分子生物学方法。血清学方法存在假阳性过多的问题和现象，并且不适于HEV急性感 染的早期做出快速准确的诊断。分子生物学方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，虽然PCR方 法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进 行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了提供一种为基层快速、准确并且实时地检测猪戊型肝炎病毒 的方法，提供一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，从而解决基层检测猪戊 型肝炎病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题。为实现本发明目的所使用的技术方案为： 一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2X反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪戊型肝炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引 物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引物FIP(SEQIDN0:3)与BIP (SEQIDNO：4)； 其中： F3TGCTTGACTTTGCACTCGA B3TCAGTGCTATACCACGACCA FIPACGCGCGCTACTCGAATAACGGAGTTCCGCAATTTGACACC BIPACGGCACTGCAGAGCTAACTACCACCAACACCATTAGTCCCA 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 以上所述的猪戊型肝炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取 的猪戊型肝炎的RNA。
[0007] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0008]以上所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgS04 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0·4-0. 8%、Betaine1·5-3. 0M和dNTPs 2. 5-4mM，其配制方法在pH为8. 7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0009] -种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测 疑似猪戊型肝炎病毒以及疑似猪戊型肝炎病变组织或猪粪便排泄物中是否感染有猪戊型 肝炎病毒，具体检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪戊型肝炎病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系建立 (4) RT-LAMP检测方法。
[0010] 以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μ1计， 2X反应缓冲液 12. 5yL EM 1 yL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol B3 5pmol 猪戊型肝炎病毒RNA 5 μL 超纯水 补足25 μL。
[0011] 以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。
[0012] 以上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应温度为63 °C、反应在20分钟前后出现扩增。
[0013] 本发明的实质性特点和进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测出猪戊型肝炎病毒，而所检测的阴性对照病 毒和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、 无需昂贵复杂的仪器。普通RT-PCR法需先进行反转录（RT)，然后再以RT产物为模板进行 PCR反应，使用了两个反应程序，而RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程 序，一个小时即可完成扩增。
[0014] 2)灵敏度高 提取的猪戊型肝炎病毒RNA原始浓度为6. 310X10ng/μL，普通PCR检测方法的灵敏 度为6. 31X10-6ng/yL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法，检测限约为6. 31X10-8ng/ μL，敏感性是普通PCR的100倍。
[0015] 3)迅速获得结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应 方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA 提取到获取试验结果，需要5-6小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在23分钟 左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，依据反应管浊度值的变化情 况即可判读结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线 显像分析或者反应结束后加入荧光染料来判读结果，从病毒基因组DNA/RNA提取到获得最 终结果可在2-3小时内完成。
[0016] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在 反应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖，能有效避免实验 环境的污染。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管 的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果， 不需要开盖，能有效避免污染。
[0017] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果， 不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可 求出各时间的猪戊型肝炎病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明猪戊型肝炎病毒RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1:猪戊型肝 炎病毒；2 :猪瘟病毒；3 :猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；4 : 口蹄疫病毒；5 :伪狂犬病毒；6 : 传染性胃肠炎病毒；7 :流行性腹泻病毒；8 :猪细小病毒；9 :空白对照(水)。结果显示猪戊型 肝炎病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
[0019] 图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪戊型肝炎 病毒敏感性检测的结果。其中 1 :6· 31X10ng/yL;2 :6· 31ng/yL;3 :6. 31X10-lng/yL; 4 ：6. 31X10-2ng/μL； 5 ：6. 31Xl〇-3ng/μL；6 ：6. 31Xl〇-4ng/μL；7 ：6. 31Xl〇-5ng/ yL;8:6.31X10-6ng/yL;9:6.31X10-7ng/yL;10:6.31X10-8ng/yL;ll:水。猪 戊型肝炎病毒基因组RNA的起始浓度为6. 31X10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行 RT-LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为6. 31X10-8ng/μL，而普 通PCR方法检测限约为6. 31X10-6ng/μL。
[0020] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪戊型肝炎病毒基因组RNA为模 板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0021] 图5是本发明猪戊型肝炎病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的 浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪戊型肝炎病毒 拷贝数。
【具体实施方式】
[0022] 1、材料的准备 猪戊型肝炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、 传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、猪细小病毒，均为市售疫苗，或为广西兽医研究所分 离鉴定和保存。RT-LAMPRNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP246 ;病 毒基因组RNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
[0023] 2、RT_LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的戊型肝炎病毒部分0RF2基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软 件PrimerExplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内 引物，其中F3、B3为猪瘟病毒RT-PCR检测引物，其中 F3TG