检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片以及检测方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，FMD)、猪水泡病（Swinevesicular disease,SVD)分别是由口蹄疫病毒（Foot-andnouthdiseasevirus,FMDV)、猪水泡病病 毒（Swinevesiculardiseasevirus,SVDV)引起的哺乳动物的急性、高度接触性传染病， 其中，口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)有3种分型，具体是口蹄疫病毒 0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型。口蹄疫病毒和猪水泡病病毒都可以感染猪， 发病率极高，并能够形成大范围的流行，能引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组 织（0ΙΕ)列为法定报告动物疫病。这三种疾病均以猪舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上 皮发生水疱为主要症状，因此在临床症状上无法对这三种疾病进行区分，必须通过病原学 进行鉴别诊断。
[0003]目前，对这三种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别三种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行三种疫病快速检测的方法，同时对口蹄疫病毒进行分型检测。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测口蹄疫病 毒和猪水泡病病毒的基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇miCDNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的基因芯片，它包括固相载体以及固 定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQIDN0 :1~4所示任意一个或者任意多个基因 片段，用于分别检测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒AsiaI型和/或猪水泡 病病毒。
[0007] 其中，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQIDN0 :13~14所示。
[0008] 本发明检测口蹄疫病毒和/或猪水泡病病毒的试剂盒，它包括前述基因芯片以及 扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQIDN0 :5~6、SEQIDN0 :7~8、SEQIDN0 :9~10和 /或SEQIDNO:11~12所示引物对，用于分别扩增口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口 蹄疫病毒AsiaI型，和/或猪水泡病病毒。
[0009] 其中，所述引物对中，上游引物与下游引物的摩尔比为1:1。
[0010] 其中，所述SEQIDN0 :5、7、9、11所示上游引物标记有荧光染料。
[0011] 本发明还提供了SEQIDN0 :1~4所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检 测口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/或猪水泡病病毒的基因芯 片的用途。
[0012] 其中，所述还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :13~14所示。
[0013]本发明还提供了SEQ ID NO :5~6、SEQ ID NO :7~8、SEQ ID NO :9~10和/或 SEQ ID N0 :11~12所示引物对以及SEQ ID N0 :1~4所示任意一个或者任意多个基因片 段所示基因片段在制备检测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型和/ 或猪水泡病病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂，SEQ ID N0 :1~4所示基因 片段为检测探针。
[0014] 本发明基因芯片和试剂盒可以同时检测口蹄疫病毒和猪水泡病病毒，而且能对口 蹄疫病毒进行分型检测，特异性强，灵敏度高耗时短，检测快速，可以迅速掌握畜禽疫病的 感染情况临床应用前景良好。
[0015] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0016] 图1芯片矩阵设计
[0017] 图2水化温度优化
[0018]图3封闭液配比优化。1: 0· 5 % BH4Na, 25 % Ethanol ;2: 0· 25 % BH4Na, 25 % Ethanol；
[0019] 3:0% BH4Na, 25% Ethanol；4:0. 5% BH4Na, 15% Ethanol；5:0. 25% BH4Na, 15% Ethanol ；:0 % BH4Na, 15% Ethanol；7:0.5 % BH4Na, 0%Ethanol；8:0. 25 % BH4Na, 0 % Ethanol；9:0% BH4Na,0%Ethanol.
[0020] 图4探针筛选矩阵设计
[0021] 图5 口蹄疫0型探针筛选
[0022] 图6 口蹄疫Asia I型探针筛选
[0023] 图7 口蹄疫A型探针筛选
[0024] 图8猪水泡病探针筛选
[0025]图9口蹄疫0型芯片灵敏度。A: 10-3 ;B: 10-4 ;C: 10-5 ;D: 10-6.
[0026]图10口蹄疫A型芯片灵敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0027]图11 口蹄疫Asia I型芯片灵敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0028]图12 猪水泡病芯片灵敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0029]图13口蹄疫0型引物的特异性实验。1 :FMDV-0 ;2:FMDV-A ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10Negative control
[0030]图14口蹄疫A型引物的特异性实验。1:FMDV-A ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10Negative control
[0031]图15口蹄疫Asia I型引物的特异性实验。：FMDV-Asia I ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ; 4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10Negative control
[0032]图16猪水泡病引物的特异性实验。1:SVDV ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ;4:FMDV-Asia I ; 5:VSV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV； 10Negativecontrol
[0033] 图17 口蹄疫0型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司IMO,醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯f醛基基片
[0034] 图18 口蹄疫A型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiO醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯^醛基基片
[0035] 图19 口蹄疫AsiaI型不同厂家芯片检测比对。Α:上海百傲科技有限公司BaiOM 醛基基片；B:北京博奥生物有限公司晶芯s'醛基基片
[0036] 图20猪水泡病不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiOl醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯醛基基片
【具体实施方式】
[0037] 一、实验材料和仪器
[0038] 1. 1材料试剂：
[0039]
[0040] 1· 2主要仪器
[0041 ]
[0042] 1.3实验试剂的配制
[0043]引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100μΜ的 引物贮存液，使用时按照1 :4(引物贮存液：灭菌超纯水）的体积比将其稀释成20μΜ的引 物使用液；
[0044] 10g/L琼脂糖凝胶：称取lg琼脂糖凝胶，加入lOOmLlXΤΑΕ电泳缓冲液中，微波炉 加热3min，溶解完全后加入10mg/mL的EB5μL，震荡混勾，倒入胶槽内，待凝固后点样；
[0045] 营养肉汤培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加 入相应比例的去离子水，121°C灭菌20min，备用；
[0046] 营养琼脂培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加 入相应比例的去离子水，121 °C灭菌20min，备用。
[0047] 20XSSC:称取NaCl，175. 2g，柠檬酸三钠·2Η20，100· 5g，溶解于少量mini-Q超纯 水中，用5MHC1调pH至7. 0,最后用Mini-Q双蒸水定容到1L;
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