检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片和检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。
【专利说明】检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以 及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以及检 测方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的偶蹄动 物的一种急性，热性，高度传染性疫病，主要特征是在口腔粘膜、蹄部、乳房、皮肤出现水疱， 继而发生溃疡的一类传播速度极快的传染病。该病严重危害畜牧业生产，影响国际贸易和 国家声誉，受到了各国政府的普遍关注，被国际兽疫局列为法定通报的动物传染病，我国将 其列为一类重大动物疫病之首。FMD易感动物包括牛、绵羊、山羊、胳驼和猪等 70多种家养 和野生偶蹄类动物。该病曾在全球范围广泛流行，给世界养殖业造成巨大的经济损失。近 年来，我国曾发生过〇型、A型、Asial型3个血清型的FMD疫情：2005年?2007年发生多 起Asial型口蹄疫疫情；2009年武汉、上海和北京发生A型FMD疫情；2009年和2010年在 中国台湾与香港自治区相继发生0型FMD疫情，在2010年广东省广州市的白云区发生〇型 FMD疫情，至2010年末我国大陆的9个省的18个地方发生0型FMD疫情。此外，在健康牛 群中发现有带毒情况。我国周边的印度、越南、阿富汗等国家FMD流行情况比较复杂，国外 毒株多次传入我国，对我国FMD的防控造成巨大的威胁。FMD传染性强，危害巨大，快速、准 确的诊断对FMD的防控具有重要意义。
[0003]猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS) 又称猪监耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRSV)，引起猪的高度接触性传染病。按临床表现的不同可分为经典猪蓝耳病 和高致病性猪蓝耳病。经典猪蓝耳病以母猪繁殖障碍、早产、流产、死胎、木乃伊胎和仔猪呼 吸综合征为特征；高致病性猪蓝耳病以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障 碍为特征，仔猪、育肥猪和成年猪均可发病和死亡，其中仔猪发病率可达 100 %，死亡率可达 5〇%以上，母猪流产率可达3〇%以上。我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名 录》将高致病性猪蓝耳病列为一类动物疫病。目前，该病已广泛流行于世界上所有养猪的国 家和地区，是危害养猪业最严重的疾病。 PRRSV自上世纪90年代传入我国以来，给养猪业造 成了巨大的损失，特别是20〇6年下半年爆发的高致病性猪蓝耳病 （HPRRSV)疫情，造成了巨 大的经济损失。目前，我国pRRSV流行毒株主要为美洲型，经典株和高致病性变异株均在猪 群中广泛存在。
[0004] 口蹄疫（FMD)和猪蓝耳病（猪繁殖与呼吸综合征，PRRS)可造成巨大的经济损失， 对·$ 3个病的防控是猪群疫病防控的重点和首要任务。对发病畜禽进行及时准确地诊断， λ量:开展动物疫病主动监测，掌握畜禽疫病的感染情况，是采取科学防控措施的前提和基 础，也是提，动物疫病科学防控水平的必然要求；同时，通过监测，对病原学阳性动物进行 净化，可有效降低野毒污染，促进畜禽健康。目前针对 FM〇v和pRRSV的病原学检测方法已 有很多报道，对每个病单独检测，费事、耗力，增加了检测成本。生产中迫切需要敏感性高、 特异性强的高通量联合检测技术，以提高检测效率，有效降低劳动强度，节约检测成本。
[0005] 王小强，"用于诊断四种猪疫病病毒寡核苷酸芯片的研制"，西北大学，微生物学， 2007公开了同时检测猪流感病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒（猪繁殖与呼吸 综合征病毒）的基因芯片，该基因芯片检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的最低 检测限分别是：口蹄疫病毒6个/mL，猪繁殖与呼吸综合症病毒5 . 05X 102个/mL。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种新的、灵敏度高的同时检测口蹄疫病毒和 猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片和试剂盒。
[0007] 本发明检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片，它包括固相载体 以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID N0 :5?7所示任意一个或者任意多 个基因片段和SEQ ID N0 :8?10所示任意一个或者任意多个基因片段。
[0008] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肤、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0009] 其中，它还包括阳性对照探针是SEQ ID N0 :12所示的基因片段，阴性对照探针是 SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID N0:14所示的基因 片段。
[0010] 所述荧光染料是cy3荧光染料或Cy5荧光染料。
[0011] 所述固相载体为醛基化玻片。
[0012] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0013] 所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0014] 所述美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型高致病性猪蓝耳病病毒或美洲型 猪蓝耳病经典毒株。
[0015] 本发明检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于：它包 括权利要求1或2所述的基因芯片与扩增口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的 试剂，其中，扩增口蹄疫病毒基因的试剂包括SEQ ID N0 :1?2所示引物对；扩增猪繁殖与 呼吸综合征病毒基因的试剂包括SEQ ID N0 :3?4所示引物对。
[0016] 所述引物对中，SEQ ID N0 :1、3所示上游引物与SEQ ID N0 :2、4所示下游引物的 摩尔比为1:10
[0017] 所述SEQ ID N0 :2、4所示下游引物上标记有荧光染料。
[0018] 所述荧光染料是cy3荧光染料或Cy5荧光染料。
[0019] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0020] 所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型猪蓝耳病病毒。
[0021] 所述美洲型猪蓝耳病病毒是美洲型高致病性猪蓝耳病病毒或美洲型猪蓝耳病经 典毒株。
[0022] 本发明提供了 SEQ ID N0 :5?7所示任意一个或者任意多个基因片段，与SEQ ID NO :8?10所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综 合征病毒的基因芯片中的用途。
[0023] 所述基因芯片还包括阳性对照探针是SEQ ID N0 :12所示的基因片段，阴性对照探 针是SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID N0:14所示的 基因片段。
[0024] 本发明还提供了 SEQ ID N0 :1?2和SEQ ID N0 :3?4所示引物对在制备同时扩 增口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂中的用途。
[0025] 本发明提供了 SEQ ID N0 :1?2和SEQ ID N0 :3?4所示引物对，与SEQ ID N0 : 5?7所示任意一个或者任意多个基因片段、SEQ ID NO :8?10所示任意一个或者任意多 个基因片段在制备检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；其中，2 对引物对为扩增试剂，SEQ ID N0 :5?10所示基因片段为检测探针。
[0026] 所述引物对中，SEQ ID N0 :1、3所示上游引物与SEQ ID N0 :2、4所示下游引物的 摩尔比为1:10。
[0027] 所述SEQ ID N0 :2、4所示下游引物标记有荧光染料。
[0028]所述荧光染料是cy3荧光染料或Cy5荧光染料。
[0029] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0030] 所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是美洲型猪蓝耳病病毒。
[0031]所述美洲型猪蓝耳病病毒是美洲型高致病性猪蓝耳病病毒或美洲型猪蓝耳病经 典毒株。
[0032] 本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒， 特异性强，灵敏度高，两种病毒最低检出浓度的数量级为102C〇PieS/μ L，耗时短，检测快 速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况，有效防控口蹄疫（FMD)和猪蓝耳病的发生，临床应 用前景良好。
[0033] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1寡聚核苷酸芯片探针点样示意图；
[0035]图2定位探针和阴阳性对照探针浓度筛选芯片点样示意图；
[0036] 图3 FMDV检测探针浓度筛选芯片点样分布图；
[0037]图4 Ml:分子量Marker DL1000 ;Μ2:分子量Marker DL2000 ; 1-3 :A、〇、Asial FMDV RNA扩增产物；4 :PMD20-T对照；5 :PMD3D扩增产物；
[0038]图5克隆基因片段的测序结果；
[0039] 图6 RT-PCR扩增产物电泳结果。M :100bp的分子量Marker ;1、2 :CH1_R株和 JXA1-R株RNA扩增结果；3 :阴性对照；4、5 :质粒PMDP和PMDHP扩增结果；6:pMD_20T载体 对照；
[0040]图7克隆基因片段序列；
[0041]图8阳性对照标记物靶基因（PC2)和探针（PC1)的结果；
[0042]图9阳性对照标记物（PC2)浓度和探针（PC1)浓度对杂交信号的影响；
[0043]图1〇单重和多重RT-PCR扩增产物电泳结果。Μ : lOObp的分子量Marker ; 1，3, 5, 7, 9:单重 RT-PCR 扩增结果；2, 4, 6, 8, 10 :多重 RT-PCR 扩增结果；1、2 :FMDV ;7、 8:CH1-R ;9、10:JXA1-R ;
[0044]图11多重不对称RT-PCR标记产物杂交结果。1 :FMDV ;2:CH1-R ;3 JXA1-R ; [0045]图12 FMDV 3D片段标记物与检测探针在不同温度下的杂交结果；
[0046]图13猪蓝耳病经典株（CH1_R)标记物在不同温度下的杂交结果；
[0047]图14高致病性猪蓝耳病变异株（JXA1-R)标记物在不同温度下的杂交结果； [0048]图15特异性检测结果；
[0049]图16不同稀释度质粒PMD3D(FMdv)的基因芯片检测结果。1#?10#: 10X稀释的 质粒 PMD3D,浓度分别为 8· 34X109 ?8. 34X10°copies/u L ;
[0050]图17不同稀释度质粒PMDP(PRRSV)的基因芯片检测结果。1#?10#: 10X稀释的 质粒 PMDP,浓度分别为 3· 76X 109 ?3. 76X10〇copies/y L ;
[0051]图18不同稀释度质粒pMDhp(HPRRSV)的基因芯片检测结果。1#?10#:10X稀释 的质粒 PMDHP,浓度分别为 3. 65X109 ?3. 65X10〇copies/y L。
【具体实施方式】
[0052] 一、实验材料和仪器
[0053] 材料准备
[0054] 1. 1 毒株
[0055] A型、0型、Asial型FMDV标准抗原：中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄 疫抗体液相阻断ELISA试剂盒；美洲型高致病性猪蓝耳病病毒（HPRRSV，JXA1-R株）、美洲 型猪蓝耳病经典毒株（PRRSV，CH1-R株）、猪伪狂犬病毒（PRV):来自商品弱毒疫苗；猪圆 环病毒（PCV-2)、猪细小病毒（PPV)、猪乙型脑炎病毒（JEV)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒 (BVDV) :四川农业大学保存；20份临床不稳定猪群组织样品，四川省动物疫病预防控制中 心保存。
[0056] 1. 2主要试剂
[0057] RT-PCR-步法扩增试剂盒PrimeScript one st印 RT-PCR kit、载体pMD-20T购自 TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，质粒提取试剂盒TIAN pure Midi Plasmid Kit， 感受态细胞DH5a购自天根公司；RNA、DNA柱式提取试剂盒购自北京世纪元亨。
[0058] Baio@醛基载玻片、Baio@2X点样缓冲液、Baio@杂交缓冲液，均购自上海百傲 科技有限公司；洗涤液1(2\55(：，0.1%508)、洗涤液11(0.2\55(：，0.1%305)、洗涤液 III (0. 2XSSC)、0. 5% NaBH40. lmol/L 磷酸盐缓冲液等。
[0059] 1. 3主要仪器
[0060] 基因芯片点样仪（Microgrid II Compact, BioRobotics，UK);基因芯片扫描仪 (GenePix Personal 4100A，Axon Instruments Inc.，USA);紫外交联仪（CL-508,Uvitec， UK);高速冷冻离心机（Sigma，Germany);普通梯度PCR仪（BI0-RAD，USA);震荡培养箱 (THZ-92C，上海博讯实业有限公司）；核酸蛋白质检测仪（Ependorf Biophotometer，德 国）；隔水式恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。
[0061] 实施例1本发明检测方法
[0062] 1、材料和仪器
[0063]同前述实验材料和仪器。
[0064] 2、实验方法
[0065] 2· 1 PCR引物、检测探针的设计与合成
[0066] 登录GenBank获取FMDV、PRRSV主要基因型（血清型）代表毒株的基因序列，利 用DNAStar软件的MegAlign模块分别进行同源性分析，选取保守基因作为检测靶区，根据 经验，用01ig〇7. 0软件设计扩增引物和寡核苷酸探针。在标记样品时，下游引物选用5-端 Cy3修饰的引物；寡核苷酸探针5'端添加 Poly T15连接臂并氨基化。引物序列见表1，寡 核苷酸探针见表2,经Blast比对后送上海生工合成。
[0067] 表1:引物序列和位置
[0068]
【权利要求】
1. 一种检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片，其特征在于：它包括 固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :5?7所示任意一个或 者任意多个基因片段以及SEQ ID NO :8?10所示任意一个或者任意多个基因片段。
2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括阳性对照探针、阴性对照探 针和/或定位探针，其中，阳性对照探针是SEQ ID NO: 12所示的基因片段，阴性对照探针是 SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID N0:14所示的基因 片段。
3. -种检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于：它包括权 利要求1或2所述的基因芯片与扩增口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的试 齐U，其中，扩增口蹄疫病毒基因的试剂包括SEQ ID NO :1?2所示引物对；扩增猪繁殖与呼 吸综合征病毒基因的试剂包括SEQ ID NO :3?4所示引物对。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中，SEQ ID NO :1、3所示上 游引物与SEQ ID NO :2、4所示下游引物的摩尔比为1:10。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO :2、4所示下游引物标 记有荧光染料。 6. SEQ ID NO :5?7所示任意一个或者任意多个基因片段，与SEQ ID NO :8?10所示 任意一个或者任意多个基因片段在制备检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基 因芯片中的用途。
7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括阳性对照探针、阴性 对照探针和/或定位探针，其中，阳性对照探针是SEQ ID NO :12所示的基因片段，阴性对照 探针是SEQ ID NO :11所示的基因片段，定位探针是标记了荧光染料的SEQ ID NO :14所示 的基因片段。 8. SEQ ID NO :1?2和SEQ ID NO :3?4所示引物对在制备同时扩增口蹄疫病毒和猪 繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂中的用途。 9. SEQ ID NO :1?2和SEQ ID NO :3?4所示引物对，与SEQ ID NO :5?7所示任意 一个或者任意多个基因片段以及SEQ ID NO :8?10所示任意一个或者任意多个基因片段 在制备检测口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；其中，两对引物对 为扩增试剂，SEQ ID NO :5?10所示基因片段为检测探针。
10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述引物对中，SEQ ID NO :1、3所示上 游引物与SEQ ID NO :2、4所示下游引物的摩尔比为1:10。
【文档编号】C12Q1/68GK104232790SQ201410455893
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】文心田, 李金海, 李兴玉, 黄小波, 曹三杰, 文翼平, 伍锐 申请人:四川农业大学