用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的组合物和方法
【专利说明】用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年4月24日提交的美国临时申请号61/637, 547的权益，这个临 时申请特此以其全文引用的方式并入本文中。
[0003] 发明背景
[0004] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)是在世界范围内猪的慢性病毒疾病。PRRS在大多数 猪肉生产国家流行，并且其对养猪业的主要经济损失负责，据估计在美国年损失为6. 64亿 美元（8)。
[0005] 自1990年代晚期以来，改性活的PRRSV(PRRS-MLV)和杀死的病毒疫苗已经可用于 控制疾病，但其中没有一个对猪完全进行保护来对抗异种野外病毒（27)。如同野外病毒一 样，PRRS-MLV也诱导免疫抑制（29、30)。此外，有几个报道是关于疫苗病毒逆转为病毒性 的，导致严重的疾病爆发（31-34)。尽管杀死的PRRSV疫苗是安全的，但其具有较差免疫原 性（35、36)。
[0006] PRRS的临床征象包含呼吸与繁殖功能障碍并且致病物是PRRS病毒（PRRSV) (28)。PRRSV早在在感染后两天并且持续几周通过调节猪的免疫系统来确立疾病（14、15)。 PRRSV所提出的特别挑战是由PRRSV引起的免疫抑制，这归因于病毒介导的重要细胞因子 (IFN-a、IFN-γ和TNF-α )的产生减少，其与白介素（IL)-10和转化生长因子β (TGF-β) 的分泌增加以及F〇xp3+T调控细胞（Tregs)群体的上调相关联（14)。另外，在受感染的猪 中，病毒中和（VN)抗体出现延迟（3-4周），而且其水平保持很低（86)。因此，在本领域中 极大地需要提供针对PRRS的安全而有效的保护和治疗。
[0007] 附图简述
[0008] 图1示出了 ： (A)包封灭活的PRRSV的PLGA纳米粒子的形态。通过标准多重乳液 法制备的PLGA纳米粒子的扫描电子显微照片。纳米粒子的尺寸似乎在200到600nm的范 围内可变。（B)用包封在纳米粒子中的灭活的PRRSV(Nano-KAg)对猪进行粘膜接种疫苗截 止PC15清除了病毒血症。猪未接种疫苗（η = 3)或者用杀死的PRRSV(K-Ag) (η = 3)或 Nan〇-KAg(n = 3)经鼻内接种疫苗一次，并且在DPI 21时用PRRSV VR2332病毒株攻击。分 析在指定的攻击后天数（PC)收集的血清样品以测量PRRSV滴度。每个条形代表了三只猪 的平均值土 SEM。
[0009] 图2示出了经Nano-KAg接种疫苗的病毒攻击的猪的血清和肺中的增强的IgA和 中和抗体滴度。进行分析以确定以下中的PRRSV中和抗体反应：(A)血清；(B)肺，通过免疫 荧光分析法；以及（C)肺裂解物中的抗PRRSV IgA抗体反应，通过ELISA。图中的每个条形 代表了来自三只猪的平均VN滴度或光密度值土SEM。字母'a'、'b'和'c'分别代表了未 接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著 差异（p〈0. 05)。
[0010] 图3示出了用Nano-KAg疫苗经鼻内接种疫苗的猪的血清和肺中的细胞因子反应。 通过ELISA来分析在指定的PC时收集的血清样品的细胞因子：(A) IFN-Y和（B)TGF-f3。 通过ELISA来分析在尸检当天（PC 15)制备的肺裂解物的以下方面：(C) IFN-γ ; (D) IL-6 ; (E)IL-10;(F)TGF-f3 ;以及（G)IL-4。图中的每个条形或数据点代表了来自三只猪的平均 VN滴度或光密度值土SEM。字母'a'、'b'和'c'分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种 疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异（p〈0. 05)。
[0011] 图4示出了 PRRSV特异性回忆细胞因子反应的分析。再刺激指定的单核细胞，并 且通过ELISA来分析所收集的培养上清液的细胞因子：(A到D) IFN- γ ; (E到H) IL-12 ; (I 和J) IL-6 ;以及（Κ和L) TGF- β。从测试值中扣除在没有灭活的PRRSV的情况下培养的免 疫细胞分泌的细胞因子。图中的每个条形代表了来自三只猪的平均细胞因子量土SEM。字 母'a'、'b'和'c'分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg以及K-Ag 对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异（p〈0. 05)。
[0012] 图5示出了 CD和CD8阳性T细胞亚群的细胞计数分析。对指定的单核细胞进行免 疫染色以分析免疫细胞的频率：(A到D) CD3+细胞；(E到H) CD8 +T细胞；（I到L) CD4+T细胞； 以及（M到P)CD4+CD8+T细胞。图中的每个条形代表了来自三只猪的免疫细胞的平均百分比 土SEM。字母'a'、'b'和'c'分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg 以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异（p〈0. 05)。
[0013] 图6示出了先天和调控T细胞的细胞计数分析。对指定的单核细胞进行免疫染色 以确定免疫细胞的频率：(A到D) γ δ T细胞；(E到H)骨髓细胞；（I到K)树突状细胞富含 部分；以及（L、M和N)Tregs。图中的每个条形代表了来自三只猪的免疫细胞的平均百分比 土SEM。字母'a'、'b'和'c'分别代表了未接种疫苗对比K-Ag、未接种疫苗对比Nano-KAg 以及K-Ag对比Nano-KAg猪之间的统计显著差异（p〈0. 05)。
[0014] 图7示出了在体外猪肺泡M s中的Nano-KAg的表征。（A)通过标准多重乳液法 制备的包封PRRSV Ag的PLGA纳米粒子的扫描电子显微照片。共焦显微镜照片：(B)将ΜΦ 用杀死的PRRSV (K-Ag)、Nano-KAg处理，或用PRRSV感染，然后用PRRSV N蛋白质特异性 mAb、接下来用Alexa 488抗小鼠抗体处理；PRRSV N蛋白质在Μφ的核内体中的共定位，（C) 经Nano-KAg处理，以及（D)经PRRSV感染。（E)经Nano-KAg处理的骨髓细胞（CD172+)中 ⑶80/86的上调。每个条形代表了从三只猪收集的模拟的、经K-Ag处理和经Nano-KAg处 理的BAL细胞中对⑶80/86标志物呈阳性的ΜΦ的平均百分比+/-SEM。星号代表了接受 Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异（ρ〈0. 05)。（F)示出如所指示经处理的 ΜΦ中PRRSV-N蛋白质的存在的代表性直方图。在三个独立的试验中获得类似的结果。
[0015] 图8示出了在攻击前研宄中Nano-KAg引发增强的先天反应和抑制的调控反应。 猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次。进行免疫染色以分析免疫细 胞的频率：肺MNC中的（A) NK细胞，（B)树突状细胞，（C) γ δ T细胞，（D)Th/记忆细胞，（E) ⑶8+Τ细胞；以及PBMC中的（H) γ δ T细胞和（I)树突状细胞。通过ELISA来分析从再刺激 的免疫细胞收集的培养上清液的细胞因子：肺MNC中的（F) IL-IO和（G) IL-6 ;以及PBMC中 的（J)IL-IO ;还有血清中的（K)IFN-a。每个条形代表了来自三只猪的平均量土SEM。星 号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异（ρ〈0. 05)。
[0016] 图9示出了经Nano-KAg接种疫苗的丽184攻击的猪中减少的肺病变和病毒负荷。 猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV ΜΝ184 病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。（A)来自指定猪组的代表性猪肺Η&Ε照片。 ⑶来自指定猪组的代表性肺免疫组织化学（IHC)照片，其示出了用诺瓦红（Nova red)染 色的PRRSV N抗原阳性细胞（放大的图像中的星号）。（C)基于受影响的肺区域的百分比 和炎性病变的严重程度对总体肺损伤进行评级。（D)在来自每只猪的10个随机场中对IHC 中的PRRSV N抗原阳性细胞进行计数。通过免疫荧光分析法来测定在指定的DPC时（E)血 清中以及在DPC 15时（F)肺中以荧光焦点单位表示的PRRSV滴度。每个条形代表了来自 三只猪的平均值土SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差 异（p〈0. 05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
[0017] 图10示出了经Nano-KAg接种疫苗的丽184病毒株攻击的猪中增强的PRRSV特异 性IgA和中和抗体反应。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在 PID 21时用PRRSV MN184病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。通过ELISA来测 定㈧肺、(D)血清和（G)鼻拭子中的抗PRRSV IgA抗体反应；以及⑶肺、(E)血清和⑶ 鼻拭子中的IgG抗体反应。通过免疫荧光分析法来测定（C)肺和（F)血清中的PRRSV中和 抗体反应。每个条形代表了来自三只猪的平均光密度值或VN滴度土SEM。星号代表了接受 Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异（p〈0. 05)。在独立的第二个试验中获得 类似的结果趋势。
[0018] 图11示出了 Nano-KAg引发猪肺中增强的先天免疫反应。猪未接种疫苗或者用 K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV MN184病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。通过ELISA来分析肺匀浆的细胞因子（A)IFN-a。通过流式细胞计 数法来分析肺MNC的（B) NK细胞，（D)y δ T细胞，（E)⑶4+T细胞，以及（F)⑶8+T细胞。通 过LDH分析法从细胞毒性功能来分析存在于肺MNC中的（C) NK细胞。图中的每个条形或数 据点代表了来自三只猪的平均值土SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之 间的统计显著差异（Ρ〈〇. 05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
[0019] 图12示出了经Nano-KAg接种疫苗的丽184攻击的猪肺中免疫抑制反应的减少。 猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV ΜΝ184 病毒株攻击并且在DPC15时施以无痛致死术。通过流式细胞计数法来分析肺MNC的（A) Tregs群体。分析肺匀浆的（B) IL-10,（C) TGF-β，以及（D) IFN-α。通过ELISA来分析从 再刺激的肺MNC收集的培养上清液的细胞因子：(E) IL-10,（F) TGF-β，以及（G) IFN-γ。每 个条形代表了来自三只猪的平均值土SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组 之间的统计显著差异（Ρ〈〇. 05)。在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
[0020] 图13示出了经Nano-KAg接种疫苗的丽184病毒株攻击的猪的PBMC和TBLN中增 加的PRRSV特异性回忆细胞因子反应。猪未接种疫苗或者用K-Ag或Nano-KAg经鼻内接 种疫苗一次，在PID 21时用PRRSV ΜΝ184病毒株攻击并且在DPC 15时施以无痛致死术。 通过ELISA来分析从再刺激的PBMC和TBLV MNC收集的培养上清液的细胞因子：(Α和Ε) IL-10,（B)TGF-f3，（C和F)IFN-y，以及（D和G)IL-6。每个条形代表了来自三只猪的平均 值土SEM。星号代表了接受Nano-KAg与接受K-Ag的猪组之间的统计显著差异（p〈0. 05)。 在独立的第二个试验中获得类似的结果趋势。
[0021] 图14示出了通过ELISA针对指定的PRRSV结构蛋白质和总病毒蛋白质对猪的支 气管肺泡灌洗液中PRRSV特异性IgA抗体产生的估算。
[0022] 图15示出了通过ELISA针对总PRRSV蛋白质对血液中PRRSV特异性总IgG抗体 滴度的估算。PC-攻击后天数；接种疫苗-第1次接种疫苗；加强-加强剂量。
[0023] 图16示出了通过免疫荧光分析法对猪肺中PRRSV特异性中和滴度（VNT)的估算。
[0024] 图17示出了通过免疫荧光分析法对猪的血液样品中PRRSV特异性中和滴度（VNT) 的估算。PC-攻击后天数；接种疫苗-第1次接种疫苗；加强-加强剂量。
[0025] 图18示出了通过ELISP0T分析法测定的在猪肺中对指定的PRRSV结构蛋白质和 总病毒蛋白质具特异性的IFN-Y分泌细胞的频率。
[0026] 图19 (A和B)示出了通过定量实时PCR(qRT-PCR)对肺中PRRSV RNA拷贝数的测 定，并且（C和D)示出了通过免疫荧光分析法测定的在猪肺中感染性PRRSV滴度的测定。
[0027] 图20示出了通过免疫荧光分析法测定的在猪的血液样品中感染性PRRSV负荷的 测定。
[0028] 图21示出了通过免疫荧光分析法对猪肺中感染性PRRSV滴度的测定。A和B是阴 性和阳性对照，并且C到H是500 μ g/猪的疫苗剂量类别的指定猪组（η = 3)的肺匀浆中 病毒负荷的代表性照片。
[0029] 图22示出了经纳米粒子包封的PRRSV K-Ag+结核分枝杆菌WCL接种疫苗并且经 异种PRRSV攻击的猪中免疫反应和病毒清除的总结。
[0030] 图23示出了用PLGA纳米粒子包封的PRRSV疫苗经鼻内接种疫苗并且用异种病毒 攻击的猪中抗PRRSV免疫的示意图。
[0031] 图24Α、24Β和24C示出了包封PRRSV KAg的PLGA纳米粒子（NP-KAg)的表征。 (A)用20kV和30, OOOx放大率的Philips XL30-FEG SEM获取照片。（B)在正常生理条件 下表现来自NP-KAg的PRRSV Ag的释放型态。（C)在处理后的指定时间点由猪的PAM细胞 对NP-KAg的吸收。每个免疫荧光照片代表每个处理条件：（i)KAg ; (ii)NP-KAg ; (iii)假的 NP;(iv)细胞对照；(V)经PRRSV(VR2332)感染。在其它两个独立的实验中获得类似的结 果。
[0032] 图25A-25F示出了经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中PRRSV特异性抗体的显著 增加。猪用指定的疫苗与佐剂的组合接种疫苗或未接种疫苗并且用PRRSV MN184攻击。通 过ELISA来分析在指定的PC时收集的肺和血液样品的病毒特异性IgA (A和C)和IgG (B、 D、E和F) : (A和B)BAL液；(C、D)肺匀浆；(E、F)血浆样品。线图中的每个条形和每个符号 指示了三只猪的平均值土SEM。星号和小写字母指示了如方法中所描述的指定组之间的统 计显著差异。在另一个独立的实验中获得类似的结果趋势。
[0033] 图26A-26F示出了经加佐剂的NP-KAg接种疫苗的猪中增强的异种和异基因型 PRRSV中和抗体（VN)滴度。如图例25中所描述对猪接种疫苗并攻击。分析在指定的 PC时收集的肺匀浆（A、B、E-Η)和血浆（C、D)样品的PRRSV VN滴度：(A-D)针对攻击的 PRRSV(MN184)的 VN 滴度；（E、F)PRRSV(1-4-4) ;(G、H)PRRSV(SD03-15)。线图中的每个条形 和每个符号指示了三只猪的平均值土SEM。星号和小写字母指示了如方法中所描述的指定 组之间的统计显著差异。
[0034] 图27A-27I示出了经加佐剂的NP-KAg疫苗（500 μ g/猪的类别）接种疫苗的猪 中增强的Thl-Th2产生和抑制的免疫抑制性细胞因子。如图例25中所描述对猪接种疫苗 并攻击。㈧用杀死的丽184Ag再刺激肺MNC并且通过ELISP0T来测量IFN-γ分泌细胞 (ISC)的频率。通过ELISA来分析肺匀浆的以下方面：(B) IFN-γ ; (D) IL-12 ; (C) IL-6 ; (E) TGF- β ; (F) IL-10。用杀死的MN184Ag再刺激PBMC并且通过ELISA来分析上清液的以下方 面：(G) IL-4 ; (H) IL-6 ; (I) IL-IO。每个条形指示了来自三只猪的每百万个LMNC的ISC的 平均数或细胞因子的平均值土SEM。星号指示了指定猪组之间的统计显著差异。在独立的 第二个实验中获得类似的结果趋势。