一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原。该疫苗组合物在二免后14日用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌感染，可以保护80%以上的猪，抗原之间不会出现相互干扰，取得令人满意的免疫效果。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物，该疫苗组合物用于预防和治疗猪呼吸道疾病综合 征。 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS)，又称猪蓝耳病，是由单股正链RNA猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒引起，以妊娠母猪 的繁殖障碍如流产、死胎、木乃伊胎等及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已 经成为规模化猪场的主要疫病之一。2006年我国部分地区爆发的高致病性猪蓝耳病是由 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病，属于国家二类动物疫 病。该病在我国出现新的流行特点，病毒发生变异，致病力增强，在部分地区出现大规模爆 发流行。临床以高热、皮肤发绀、眼结膜炎、呼吸系统症状、神经症状及死亡为主，表现为发 病快、症状严重、病变明显，死亡率高，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。直至今日，疫 病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于蓝耳病的治疗， 疫苗免疫接种是防制该病的最有效方法。
[0003] 副猪嗜血杆菌病是副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps)引起的猪的多发 性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉泽氏病（Glasser's Disease)。副猪嗜血杆菌可以 影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5?8周龄的 猪，发病率可达40%，死亡率可达50%。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被 毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外， 副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢 性跛行。在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Kieletein -Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清 型；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行。近年来，由于我国 目前饲养技术的调整进行不当，以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐 严重。
[0004] 猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)是由猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)引起的一种慢性、接触性传染病，是一种重要的免疫抑 制性疾病，也是猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC)的 重要病原之一。该病长期危害养猪业，并广泛分布于世界各国。该病主要危害育肥猪，尤其 是14?20周龄的猪生长率降低，使其饲料转化率降低，还可出现食欲减退、发热、咳嗽、呼 吸困难等症状。该病易发生继发感染，如继发猪巴氏杆菌病、猪圆环病毒病、猪流感、猪繁殖 与呼吸综合征、猪胸膜肺炎等，出现呼吸困难，发热等临床症状，甚至死亡。本病一旦传入猪 群，很难彻底清除，并且会造成其他疾病的免疫失败，对于混合感染的PRDC的防控带来了 挑战。
[0005] 临床PRDC中，上述三种病原即猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜 血杆菌常常以混合感染形式出现，临床症状表现为结膜炎、眼睛分泌物增多、发热、食欲下 降或无食欲、呼吸困难、喘气、腹式呼吸、咳嗽、生长缓慢、消瘦、死亡率升高。母猪流产前体 温升高，厌食，尤其第一胎的母猪更为常见。死亡猪剖检呈现心包炎、胸膜炎、腹膜炎和关节 炎，肺部炎症，淋巴结出血、肿大。而目前针对这三种病原的感染的疫苗仅有猪繁殖与呼吸 综合征、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌单苗，无法实现一种疫苗免疫抵抗这三种病原引起 的混合感染。
[0006] 随着病原流行株和混合感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果，现在存在 的问题是如果猪感染或接种了猪繁殖与呼吸综合征病毒，那么猪支原体肺炎疫苗的免疫效 果会明显降低，杨汉春("猪免疫抑制性疾病的流行特点与控制对策"，中国畜牧兽医，2004， 31 (5): 41-43)、万遂如（"防控猪免疫抑制的主要技术措施"，养猪，2009,1:42-46)等研 究发现猪繁殖与呼吸综合征是一种免疫抑制性疾病；庞海洋（"猪繁殖与呼吸综合征研究进 展"，第三届猪病防控学术研讨会会议论文集，第262-265页，2008年）等研究发现猪繁殖与 呼吸综合征病毒感染会降低猪的免疫力（如，通过破坏肺泡巨噬细胞的正常功能）并引发免 疫抑制。因此，当免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗时，会降低与其共同免疫的其他猪疫苗 的免疫效果。所以即使将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗与其他疫苗联合免疫，也难以实现 与单苗免疫相当的效果。
[0007] 现有的免疫程序是首先用猪繁殖与呼吸综合征疫苗接种，但是等到活的猪繁殖与 呼吸综合征从猪体内消失，再接种猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌疫苗，至少需2?3周时 间，且猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌疫苗产生抗体还需要2?3周，不能很好的对仔猪产生 保护。而且目前市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大；另外同时针对控 制猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病疫苗，国内外也还是空白。
[0008] 然而，本发明人在一项重现PRDC时发现，当猪群中只感染猪肺炎支原体及副猪嗜 血杆菌时，并不会引发疾病，只有当猪群中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒的情况下，才会引 发严重的PRDC。表明这些症状的病猪是由这三种病原体协同作用引起，并且，一旦继发感染 副猪嗜血杆菌，各种抗菌药物均难以奏效。因此，需要提供猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体 肺炎和副猪嗜血杆菌病疫苗以解决上述问题。
[0009] 与单一疫苗相比，联合疫苗不仅方便、多效、低成本，还可以减少疫苗接种次数，避 免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部 使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的"冷链"，这种环环相扣的冷链运作，费用极高， 使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的 优越性。
【发明内容】
[0010] 本发明人在重现PRDC时还意外的发现，如果首先用猪支原体肺炎和副猪嗜血杆 菌病灭活疫苗首免，用猪繁殖与呼吸综合征活疫苗-猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病灭活 疫苗二免，可以产生对猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌感染造成的猪 呼吸道综合征产生良好的免疫保护。
[0011] 因此，为解决现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述 疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及免疫量的猪 繁殖与呼吸综合征病毒抗原。
[0012] 优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体全病原抗原、减毒的猪肺 炎支原体抗原、猪肺炎支原体亚单位抗原、猪肺炎支原体重组活载体抗原和猪肺炎支原体 DNA载体的抗原；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌全菌抗原、减毒的副猪嗜 血杆菌抗原、副猪嗜血杆菌亚单位抗原、副猪嗜血杆菌重组活载体抗原和副猪嗜血杆菌DNA 载体的抗原；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒 抗原、减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位抗原、猪繁殖 与呼吸综合征病毒重组活载体抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA载体的抗原。
[0013] 所述"猪繁殖与呼吸综合征抗原"是指含有至少一种抗原的任何组合物，所述抗原 当对猪给药时，可诱导、刺激或增强抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫应答。优选 地，本发明所述疫苗组合物中，猪繁殖与呼吸综合征抗原为全病毒抗原，包括本领域技术人 员熟知的临床分离的野毒株，优选为灭活形式的猪繁殖与呼吸综合征全病毒，改良的猪繁 殖与呼吸综合征活病毒或减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒，含有至少猪繁殖与呼吸综合征 病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫 原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分，猪繁殖与呼吸综合征抗原还可以包含以下组 合物的任一种抗原：如勃林格殷格翰动物保健（美国）有限公司生产的猪繁殖与呼吸综合 征活疫苗（丨ngelv'ac?PRRS MLV);中牧实业股份有限公司成都药械厂、齐鲁动物保健品 有限公司等多家公司生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株）和哈尔滨维科 生物技术开发公司生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（CH-la株）；哈尔滨维科生物技术 开发公司生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH-1R株）；广东大华农动物保健品股份有限 公司等生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）；江苏南农高科技股份有 限公司等生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98);哈药集团生物疫苗有限公司等生产的 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HUN4-F112株）；新疆天康畜牧生物技术股份有限公 司生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-F92株)。
[0014] 所述"副猪嗜血杆菌抗原"是指包含至少一种抗原的任何组合物，所述副猪嗜血杆 菌抗原在对猪给药后可诱导、刺激或增强抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。优选地，所述副 猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌全菌，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野菌 株，优选为灭活形式的副猪嗜血杆菌全菌，改良的副猪嗜血杆菌活菌或减毒的副猪嗜血杆 菌，含有至少副猪嗜血杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合菌株，任何其它含至少副猪嗜血 杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分，副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以 下组合物的任一种抗原：如勃林格殷格翰动物保健（美国）有限公司生产的副猪嗜血杆菌 病灭活疫苗（Z-1517株），西班牙海博莱生物大药厂生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清 1型SV1 +血清6型SV6)，华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业 股份有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清4型MD0322 +血清5型SH0165)，山东 省农业科学院畜牧兽医研究所的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清1型LC株+血清5型LZ 株)。
[0015] 本发明中术语"猪肺炎支原体抗原"是指含有灭活的猪肺炎支原体抗原，所述抗原 接种猪后可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答。猪肺炎支原体包括本领 域技术人员熟知的临床分离的野毒株。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支 原体，优选为灭活形式。猪肺炎支原体抗原还可以包含以下组合物的任一种猪肺炎支原体 抗原，如法国梅里亚的BQ14株(猪克喘)、美国先灵葆雅（英特威）的J株(安百克)、西班牙 海博莱生物大药厂的J株(喜可舒)、美国辉瑞(富道)的瑞富特、哈药集团生物疫苗有限公司 的P-5722-3株(瑞倍适/瑞倍适-旺)、美国普泰克的P株以及P株复合佐剂灭活苗(喘泰 克）以及勃林格殷格翰的J株(茵格发）；国内生产的168株活疫苗。
[0016] 更优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株；所述副猪嗜 血杆菌抗原为灭活的血清4型JS株和血清5型ZJ株；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原 为NVDC-JXA1-R毒株；或者，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体J株；所述副猪 嗜血杆菌抗原为灭活的血清4型MD0322株和血清5型SH0165株；所述猪繁殖与呼吸综合 征病毒抗原为HuN4_F112毒株。
[0017] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)HN0613,已在中国典 型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCC N〇.M2012230。
[0018] 副猪嗜血杆菌血清 4 型（Haemophilus Parasuis Serotype4, Strain JS) JS 株， 已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为CCTCC Ν〇·Μ2011172。
[0019] 副猪嗜血杆菌血清 5 型（Haemophilus Parasuis Serotype5, Strain ZJ) ZJ 株， 已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为CCTCC Ν〇·Μ2011173。
[0020] 猪繁殖与呼吸综合征病毒株NVDC-JXA1-R毒株，该毒株公开于中国专利 CN101307305A，以保藏号CGMCC No. 2467保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心。
[0021] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) J株，保藏于美国菌种保藏中心 ATCC25934。
[0022] 副猪嗜血杆菌血清4型菌株MD0322株和血清5型菌株SH0165株公开于专利申请 CN102329746A。
[0023] 副猪嗜血杆菌血清4型（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株MD0322株，已在中国典 型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期=2011年8月9日，保藏号为CCTCC No. M2011283。
[0024] 副猪嗜血杆菌血清5型（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株SH0165株，已在中国典 型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期=2011年8月9日，保藏号为CCTCC No. M2011284。
[0025] 猪繁殖与呼吸综合征病毒株HuN4-F112毒株，该毒株公开于中国专利申请 CN101280292,以保藏号CGMCC No. 2484保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心。
[0026] 优选地，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包括佐剂，所述佐剂包括纳米化氢 氧化铝胶、矿物油、卡波姆、M0NTANIDE GEL ST、蜂胶、细胞因子、脂质体、免疫刺激复合物、 含CpC脱氧寡核苷酸、纳米化ISA206、ISA760VG、纳米化磷酸铝、皂苷、山梨聚糖、植物油、油 酸乙酯、二(辛酸/癸酸）丙二醇酯、三(辛酸/癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、 山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚 氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共 聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种。
[0027] 优选地，所述猪肺炎支原体抗原108?KTMHDCE/头份；所述副猪嗜血杆菌抗原为 5X 108?8X 109CFU/头份；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为104 5?107_°TCID5(i。
[0028] 更优选地，所述NVDC-JXA1-R全病毒病毒疫苗为每头份病毒含量104 5? 107_°TCID5(I ;更优地，所述全病毒抗原为每头份病毒含量104 5?106 5TCID5(I ;再优选地，所述 全病毒抗原为每头份病毒含量i〇5_°tcid5(i。
[0029] 更优选地，所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为5X 108?8X 109CFU/ 头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为2X 109?4X 109CFU/头份。
[0030] 所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为5 X 108?8 X 109CFU/头份；更优 地，所述副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为2X 109?4X 109CFU/头份。
[0031] 优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原灭活前108? K^MHDCE/头份；更优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活 前1 X 109?2X 109MHDCE/头份。（MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，S卩1MHDCE相当 于1个猪肺炎支原体）。
[0032] 优选地，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包括猪大肠杆菌抗原、猪巴氏杆菌 抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪波氏杆菌 抗原、猪红斑丹毒丝菌抗原；所述疫苗组合物活疫苗部分进一步包括猪瘟病毒抗原、猪细小 病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪乙脑病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪传 染性胃肠炎病毒抗原。
[0033] 本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：1) 培养增殖猪肺炎支原体，灭活；2)培养增殖副猪嗜血杆菌，灭活；3)培养增殖猪繁殖与呼吸 综合征病毒；4)将所述灭活猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原按比例混合，并与所述 猪繁殖与呼吸综合征活病毒抗原分开保藏。
[0034] 本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在预防和治疗猪呼吸道疾病综合 征中的应用，其中，所述应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原和免疫量的副猪嗜血杆菌 抗原免疫猪，然后用免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜 血杆菌抗原二免所述猪。
[0035] 优选地，所述猪首次免疫时为3?4周龄，所述二免与所述首次免疫时间间隔21 天。
[0036] 本发明的又一目的在于提供一种免疫试剂盒，其中，所述试剂盒包括含所述猪肺 炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原的抗原组合物、以及所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗 原，其中，含所述猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原的抗原组合物与所述猪繁殖与呼 吸综合征病毒抗原分开保藏。
[0037] 优选地，所述猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原的抗原为灭活全菌抗原，所 述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为活的全菌抗原。
[0038] 本发明所述的疫苗组合物对3?4周龄猪免疫副猪嗜血杆菌病、猪肺炎支原体灭 活疫苗，21日后用猪繁殖与呼吸综合征活疫苗-副猪嗜血杆菌病、猪肺炎支原体灭活疫苗 组合物二免，二免后14日用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌感 染，可以保护80%以上的猪，抗原之间不会出现相互干扰，取得令人满意的免疫效果。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0040] 本发明实施例中用猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1-R毒株、副猪嗜血杆菌血 清4型JS株、血清5型ZJ株、猪肺炎支原体HN0613株为例说明本发明。
[0041] 菌株(毒株）的来源
[0042] 所选用的猪繁殖与呼吸综合征病毒株为NVDC-JXA1-R毒株以保藏号No. 2467保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0043] 所选用的血清4型副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株JS株，保藏 号为 CCTCC Ν〇·Μ2011172。
[0044] 所选用的血清5型副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株ZJ株，保藏 号为 CCTCC Ν〇·Μ2011173。
[0045] 所选用的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) HN0613株，保藏号为 CCTCC No. M2012230。
[0046] 所选用的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) J株，保藏于美国菌种 保藏中心ATCC25934。
[0047] 所选用的副猪嗜血杆菌血清4型（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株MD0322株， 保藏号为 CCTCC NO.M2011283。
[0048] 所选用的副猪嗜血杆菌血清5型（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株SH0165株， 保藏号为 CCTCC NO.M2011284。
[0049] 所选用的猪繁殖与呼吸综合征病毒株HuN4-F112毒株，保藏号为CGMCC No. 2484。
[0050] 本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得 分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0时，记为0分，1%?25%记为1分，26%?50%记为 2分，51%?75%记为3分，大于75%为4分。
[0051] 本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用 SPSS计算机软件进行AN0VA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。
[0052] 本实施例中的疫苗组合物、三联疫苗或联苗均指预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征 病毒、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，即至少包含猪繁殖与呼吸综合征 抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物。
[0053] 本发明中所用的ρΗ7· 2的PBS液配方为：1000ml蒸馏水中加入NaC19g、 Na2HP04 · 12H206g、NaH2P04. 2H200. 4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集 团。
[0054] 实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗的制备
[0055] 本实施例中用转瓶培养法。用细胞生长液（含5%牛血清MEM培养基，pH值为7. 25) 利用转瓶扩增培养Marc-145细胞。细胞培养至第5天，按Μ. 0.1.为0.001接种蓝耳病病 毒。培养至接毒后第3天即收获病毒液一 20°C保存。按照高致病性猪繁殖与呼吸综合征活 疫苗（JXA1-R株）检验规程进行。测定病毒含量为108_°TCID 5(l/ml。
[0056] 将检验合格的病毒液，混合于同一容器中，按1 :1 (V/V)加入2%明胶、5%糊精、10% 海藻糖、2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、2%牛血清白蛋白、0. 164%磷酸二氢钾、0. 052%磷酸氢二 钠和水组成的耐热保护剂组分，充分混匀，定量分装；分装后迅速进行冷冻真空干燥后即 得成品（每头份病毒含量为i〇 6 5tcid5Q)。
[0057] 在本实施例中，猪繁殖与呼吸综合征病毒猪还可以采用其他毒株（比如HuN4-F112 株，TJM-F92株)，并不局限于实施例中给出的毒株。
[0058] 实施例2副猪嗜血杆菌病、猪肺炎支原体灭活疫苗制备
[0059] 副猪嗜血杆菌病、猪肺炎支原体灭活疫苗，由已经灭活、浓缩并且安检合格副猪嗜 血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株抗原和猪肺炎支原体HN0613株抗原，与Montanide GEL ST 佐剂混合配制得到，混合抗原占疫苗总体积的75%?90%，佐剂含量为10%?25%。
[0060] 1.副猪嗜血杆菌病、猪肺炎支原体种子的制备
[0061] 1. 1副猪嗜血杆菌种子的制备
[0062] 副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株冻干菌种，分别划线接种于含有琼脂粉的 本实验室优选的副猪嗜血杆菌培养基（MHPs)平板上，置37°C培养18?24小时，选取符合 要求的菌落，接种于MHPs液体培养基中，37°C培养12?16小时，作为一级种子。取一级种 子的培养物，按1%的量加入MHPs液体培养基中，37°C培养12?16小时，经检验纯粹后作 为二级种子。
[0063] 副猪嗜血杆菌培养基配方（MHPs):多聚蛋白胨（5g/L)、酵母抽提物（5g/L)、谷氨 酸钠（5g/L)、水解乳蛋白（2.5g/L)、氯化钠（2.5g/L)、磷酸氢二钾（2.0g/L)、葡萄糖（l.Og/ L)，用 NaOH 调 pH 值至 7. 2，116°C 灭菌 30min，再加入猪血清（50ml/L)、l% 的 NADH (10ml/ L)，制备固体培养基时在灭菌前加入琼脂粉（12g/L)。
[0064] 1. 2猪肺炎支原体种子的制备
[0065] 冻干菌种，用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37°C培养 7-10d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37°C培养7-10d，作为一级种 子。取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37°C培养 4-7d，经检验纯粹后作为二级种子。
[0066] 液体培养基的配方（按1065ml计）：牛心浸出液300ml，ddH20360ml，校正pH值到 7. 4, 121°C灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank' s平衡盐溶液（10X)40ml， 0. 25%酚红10ml猪血清200ml，5%水解乳蛋白100ml，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青 霉素10ml，1%醋酸铊溶液25ml。
[0067] 固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar即可。
[0068] 2制苗用菌液的培养
[0069] 2. 1副猪嗜血杆菌菌液的制备在MHPs培养基中，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、 5型ZJ株菌液分别按2% (V/V)接种量加入培养基中分别培养，混匀后置37°C培养16?18 小时，当菌液的浓度〇D_达到2. 5以上、D0值开始上升、pH值降低到6. 5以下时停止培养。 培养结束后，分别从制苗的菌液中取样，根据《中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版)》附 录进行纯粹检验，应纯粹。
[0070] 2. 2猪肺炎支原体菌液的制备：将液体培养基培养的猪肺炎支原体种子液以 1:10(容积比）接种于液体培养基中。37°C下培养3-6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯 粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养（继代次不超过6代）。培养结束后，取样，根据 《中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版)》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验，猪 肺炎支原体菌液为纯粹。
[0071] 3含量测定
[0072] 3. 1副猪嗜血杆菌活菌计数
[0073] 分别从制苗菌液中取样，按照《中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版)》附录用 MHPs平板培养进行活菌计数以确定培养的菌数。
[0074] 3. 2猪肺炎支原体菌体含量测定
[0075] 用PCR方法对培养物进行计数。10倍倍比稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的 最低限量为3 X 1(Γ3 μ g (相当于1000左右个菌体），按稀释的倍数算出菌体数(沈青春，谭青 松，王琴，等.？〇?方法测定他？培养物菌数[刀.中国预防兽医学报，2006,28 (1):55-57)。 培养物含量应为1 X l09-2X l09MHDCE/ml (MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，S卩1MHDCE 相当于1个猪肺炎支原体）。
[0076] 4灭活及检验
[0077] 4. 1副猪嗜血杆菌菌液灭活及检验向上述副猪嗜血杆菌菌液中，按总量的0. 2% (V/V)分别加入甲醛溶液，放置于37°C灭活24小时，期间搅拌3?5次。
[0078] 取已经灭活的2种副猪嗜血杆菌菌液分别5mL接种于100mL MHPs培养基中，37°C 培养24小时，再移植于上述100mL培养基中37°C培养24小时；取灭活的2种副猪嗜血杆 菌菌液0. 5mL划线接种于MHPs平板培养基，37°C培养24小时。两种方法培养后，均应无菌 生长。
[0079] 4. 2猪肺炎支原体菌液的灭活及检验将检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体 积总量缓慢加入终浓度为〇. 2%的甲醛溶液（V/V)，放37°C灭活，其间每隔4小时搅拌一次， 24小时后取出，进行灭活检验。
[0080] 取灭活后菌液10ml接种于100ml液体培养基中37°C培养4-7天，再按相同比例移 植于上述培养基l〇〇ml中37°C培养4-7天；另外，取灭活后菌液0. 5ml接种于固体培养基， 37°C培养7-10天。上述两种方法培养的结果均无菌生长。
[0081] 5 浓缩
[0082] 5. 1将2种副猪嗜血杆菌菌液用密理博（Millipore公司）膜包(分子截留量为 300Kda道尔顿）进行浓缩。浓缩后含量为10 nCFU/ml。
[0083] 5. 2将猪肺炎支原体培养液用密理博（Millipore公司）膜包(分子截留量为 300Kda道尔顿）进行浓缩。浓缩后含量为10 nMHDCE/ml。
[0084] 6 安检
[0085] 取上述三种已灭活浓缩的菌液分别静脉注射18?22g的Balb/C小鼠5只，每只 0. 2ml，三天内5/5健活，方为灭活彻底。
[0086] 7.疫苗的配制：具体成分配比见表1 :
[0087] 表1疫苗具体成分配比
[0088]
【权利要求】
1. 一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的副猪 嗜血杆菌抗原以及免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎 支原体全病原抗原、减毒的猪肺炎支原体抗原、猪肺炎支原体亚单位抗原、猪肺炎支原体重 组活载体抗原或猪肺炎支原体DNA载体的抗原； 所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌全菌抗原、减毒的副猪嗜血杆菌抗原、 副猪嗜血杆菌亚单位抗原、副猪嗜血杆菌重组活载体抗原或副猪嗜血杆菌DNA载体的抗 原； 所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原、减 毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒亚单位抗原、猪繁殖与呼吸 综合征病毒重组活载体抗原或猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA载体的抗原。
3. 根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎 支原体HN0613株；所述副猪嗜血杆菌抗原为灭活的血清4型JS株和血清5型ZJ株；所述 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为NVDC-JXA1-R毒株。
4. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包 括佐剂，所述佐剂包括纳米化氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、MONTANIDE GEL ST、蜂胶、细胞 因子、脂质体、免疫刺激复合物、含CpC脱氧寡核苷酸、纳米化ISA206、ISA760VG、纳米化磷 酸铝、皂苷、山梨聚糖、植物油、油酸乙酯、二辛酸丙二醇酯、二癸酸丙二醇酯、三辛酸甘油 酯、三癸酸甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙 二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或 甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙 烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种。
5. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原108?KTMHDCE/ 头份；所述副猪嗜血杆菌抗原为5X 108?8X 109CFU/头份；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒 抗原为1〇4·5?10 7 °TCID5Q/头份。
6. -种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括： 1) 培养增殖猪肺炎支原体，灭活； 2) 培养增殖副猪嗜血杆菌，灭活； 3) 培养增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒； 4) 将所述灭活猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原按比例混合，并与所述猪繁殖与 呼吸综合征活病毒抗原分开保藏。
7. 根据权利要求1?5任一项所述的疫苗组合物在预防和治疗猪呼吸道疾病综合征中 的应用，其中，所述应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原和免疫量的副猪嗜血杆菌抗原 免疫猪，然后用免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆 菌抗原二免所述猪。
8. 根据权利要求7所述的应用，其中，所述猪首次免疫时为3?4周龄，所述二免与所 述首次免疫时间间隔21天。
9. 一种免疫试剂盒，其中，所述试剂盒包括含所述猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌 抗原的抗原组合物、以及所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，其中，含所述猪肺炎支原体抗 原和副猪嗜血杆菌抗原的抗原组合物与所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原分开保藏。
10.根据权利要求9所述的免疫试剂盒，其中，所述猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌 的抗原为灭活全菌抗原，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为活的全病毒抗原。
【文档编号】G01N33/53GK104096222SQ201310119733
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2013年4月8日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司