专利名称：低致病性的猪的生殖和呼吸综合征活体病毒疫苗及其制备方法
背景技术：
1.发明领域本发明一般涉及给猪施用的低致病性活体病毒疫苗，以使有效免疫从而抵御猪的生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒的感染。更具体的是，本发明涉及这类活体疫苗，以及使猪对PRRS病毒免疫的方法和制备这类疫苗的方法。一种新的、基本分离和纯化的低致病性的PRRS病毒也构成了本发明的部分，其ATCC保藏号为VR2509。
2.现有技术的说明近年来PRRS已成为猪的一种重要的病毒性疾病。PRRS会使怀孕母猪严重地生殖衰退，表现为猪崽早产、流产数增加、干尸化和死产数增加、猪崽数减少及延迟恢复动情期。急性PRRS的生殖症状持续2-4个月，但疾病的呼吸问题会持续多年，导致明显的生产减少。已经报道了对孕后期(妊娠77-95天)母猪/小母猪PRRS病毒感染的发病机理的研究。每个这类研究显示了PRRS病毒导致经胎盘感染和胎儿致病性的能力。但是，胎儿致病性对孕中期的母猪的影响不明显，孕中期感染的子宫中的胎儿仍然很正常。
在野生条件下，有些农场没有显示出疾病的急性生殖问题或慢性的呼吸症状，但其血清学都是PRRS阳性。人们对在这样的情况下缺乏临床疾病体征的基础尚不了解。据推测可能存在低致病性的PRRS病毒毒株，它们会使猪群感染，但没有显示出PRRS的临床征状。不同的研究者已经报道了许多PRRS病毒分离物。所有的都已经显示具有RNA和含脂包膜，但没有使不同动物种的红细胞血凝的能力。
发明综述本发明克服了上述问题并提供了给猪施用改进的活体或改性活体PRRS疫苗。本发明的疫苗包含能给予猪抗烈性野生型PRRS感染的有效免疫的足量活体或改性活体病毒。本文所用的“有效免疫”指疫苗防止猪PRRS感染的能力，所述的感染会引起疾病的明显临床体征。即经免疫的猪对PRRS的血清学可为阳性或不为阳性，但没有任何临床症状。
在较好的形式中，本发明的疫苗包括新的活体病毒，称为MN-Hs，它于1995，7，26被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive，Rockville，美国马里兰州20852)，ATCC保藏号为VR2509。该病毒基本无毒，能给予有效免疫。这里的疫苗可施用于繁殖的母猪、小母猪、公猪或断奶猪崽，这类施用可用任何常规的方法，如肌内注射或口服-经鼻给药。一般来说，疫苗的剂量可含约104-108空斑形成单位的病毒。
更一般的是，本发明也涉及制备PRRS猪疫苗的方法，它涉及首先通过空斑克隆技术得到PRRS病毒株或在MARC-145细胞铺满培养物上的平均空斑直径低于约2毫米的分离物，然后从这类毒株中制备活体疫苗。MARC-145细胞系已保藏在ATCC，其ATCC保藏号为＿＿＿＿。较好的是，本发明的疫苗基本上由这类小直径的空斑病毒组成，它以基本纯化的形式得到。较好的病毒ATCC保藏号VR2509具有这类小的空斑直径，在免疫时基本完全无毒。
附图简述
图1是显示在MARC-145细胞系上的PRRS病毒分离物MN-Hs(＜2mm)的空斑形态和大小的照片；图2是显示在MARC-145细胞系上的PRRS病毒分离物MN-HL(3-5mm)的空斑形态和大小的照片；和图3是显示在MARC-145细胞系上的PRRS病毒分离物MN-W(2-3mm)的空斑形态和大小的照片。
较好实施例的详细叙述下列实施例是分离、鉴定和克隆低致病性PRRS病毒株的较好技术，以及从中产生疫苗的较好技术；应当明白该信息仅供叙述用，不是用来限制本发明的总范围。提及的参考文献并入本文。
实施例1综述在该实施例中，对怀孕的母猪进行猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒的小空斑变异体(MN-Hs)的研究。MN-Hs株最初从小空斑和大空斑(MN-H)病毒混合物的MN-H病毒中克隆。第一个试验是比较对胎儿的致病性，对2个妊娠86天的怀孕母猪分别鼻内接种MN-Hs、MN-HL、野生分离物(MN-W)和细胞培养基(对照)，除了对照母猪外让所有的母猪到期生下小猪。感染的母猪在接种后(PI)7天出现病毒血症，在接种后14天由间接荧光抗体(IFA)试验显示为血清转化。两头被MN-Hs病毒感染的母猪生下了14头活猪崽和5个死猪崽，其中2头被MN-HL病毒感染的母猪生下了全部的25头死猪崽。两头被MN-W感染的母猪产下了10头活猪崽和20头死猪崽。两头对照的母猪在怀孕的107天宰杀时产下了16头正常的猪崽。从6头感染的母猪产下的24头活猪崽中的16头(66.7％)、14头死产中的9头(64.3％)和25头干尸化的3头(12.0％)中分离出病毒。IFA方法显示，有4个MN-HL或MN-W感染的母猪产下的13头死产的血清中的6头其PRRS病毒的抗体滴度范围为116-11，024。接着的实验是重复MN-Hs病毒感染的结果，对2头妊娠86天的怀孕母猪分别鼻内接种MN-Hs、肌内注射接种MN-Hs以及鼻内接种不同的野生分离物(OVL-173)，让所有的母猪到期生下小猪。两头被MN-Hs病毒经鼻内和肌内注射感染的母猪分别产下了15头活猪崽和6个死猪崽，以及25头活猪崽和5头死猪崽，而2头感染OVL-173的母猪产下了6头活的和24头死猪崽。这些结果表明PRRS病毒对猪胎的致病性在病毒分离物间不同，PRRS病毒的MN-Hs毒株是温和致病性病毒。在死产猪崽的血清中检测PRRS病毒抗体是诊断胎儿感染的有用方法。
材料和方法病毒和细胞培养物。本研究使用了三种不同的PRRS病毒分离物。在具有亚临床PRRS体征的农场中从健康繁殖的猪崽血清中得到分离物MN-H。MN-H病毒最初是各种空斑大小的病毒群的混合物。从MN-H病毒中独立地克隆小(MH-Hs)空斑病毒和大(MN-HL)空斑病毒，每个病毒经空斑纯化四次以用于第一实验，再进行六次纯化以用作接着的根据Him等在Am.J.Vet.Res.，521649-1652(1991)中所述的空斑克隆方法的实验。在每个这类空斑传代中，铺满MARC-145(来自非洲绿猴肾细胞系(MA-104)的允许克隆)的细胞单层在60mm×15mm培养皿中生长(细胞被保存在补充有3％胎牛血清(FCS)、0.15％碳酸钠和抗生素的Eagles极限必需培养基(MEM)中(Kim等，Arch.Virol.，133477-483(1993))，并用各个病毒进行接种。让培养物在37℃下培养60分钟，除去上面的接种物，培养物用MEM洗涤一次。此后，向每个培养皿中加入5毫升等分的由等体积2×MEM和补充有50微克二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖/毫升的1.6％煮沸的Noble琼脂(Disco Laboratories)构成的液体培养基，让培养皿在37℃下CO2培养器中再培养5天。在培养末期，通过加入3毫升补充有1％中性红的PBS使空斑培养物可见。用消毒的巴氏吸管挑出选择的空斑，进行克隆，并在未感染的MARC-145细胞单层上接种传代。对于永久染色，小心地除去琼脂，细胞单层用2毫升在20％乙醇中的1％结晶紫染色10分钟。培养皿用自来水淋洗以便于检查空斑。
从具有典型急性PRRS体征的农场的病母猪血清中分离得到PRRS病毒MN-W，从牛津兽医实验室(Worthington，美国明尼苏达州)中得到OVL-173。
动物和实验设计从没有PRRS病毒感染的临床或血清学迹象历史的农场采购妊娠约80天的怀孕母猪。在该农场里母猪已经在一年中接种二次以抵御猪的细小病毒和钩端螺旋体(Leptospira spp.)。知道每头母猪的精确产崽日期。购买后，每头母猪在明尼苏达大学分离的窝里分开饲养。在妊娠86天时，两头母猪的每头经鼻分别用MN-Hs、MN-HL和MN-W病毒接种(2毫升，105.0-5.5TCID50/ml)。剩余的两头母猪用细胞培养基接种作为对照。以一定的间隔收集每头母猪的血清样品用作病毒分离和血清学研究。让六个感染的母猪自然分娩，两头对照的母猪在妊娠107天被屠宰以检查胎儿。分娩时，从活猪崽和死产的猪崽中取出血液和肺样品，并从干尸化的胎儿中取出胸液来进行病毒分离和血清学研究。在第二个实验中，在接种前将MN-Hs病毒经空斑纯化六次。让两头怀孕母猪在86天时经肌内注射接种MN-Hs和鼻内接种MN-Hs，并鼻内接种不同的野生分离物(OVL-173)，让所有的母猪按时分娩。分娩时，测量干尸化或死产猪崽的头-臀长度以估计死亡时间。(Marrable等，J.Agric.Sci.，69443-447(1967))。收集血样和肺部样品，如第一个实验那样分析。
病毒分离和血清学研究。为了分离病毒，将每个血清样品或肺均浆物的上清液放在24-孔培养板上，加入悬浮在补充有3％FCS的MEM中的MARC-145细胞(1-2×55细胞/ml)。对培养物观察PRRS病毒典型的细胞致病作用(CPE)达5-7天。冷冻培养板并冻融两次，将上清液接种到具有新鲜MARC-145细胞悬浮液的96-孔微量滴定板上，培养3-4天 通过用PRRS病毒参照阳性猪血清观察CPE和特定荧光来检查病毒感染的迹象。
通过间接荧光抗体(IFA)方法来试验母猪和猪崽血清的抗体(Yoon等，J.Vet.Diag.Invest.，4144-147(1992))。用MARC-145细胞系制备96-孔试验板，一些血清通过如前所述的血凝抑制(HL)试验(Joo等，Aust.Vet.J.，52422-424(1976))来试验抗体。
结果PRRS病毒分离物在最初的分离中显示出不同的空斑大小。MN-H分离物根据其空斑大小被克隆成不同的MN-Hs和MN-HL群。克隆后，MN-Hs和MN-HL的空斑直径为＜2毫米和3-5毫米，MN-W的直径为2-3毫米(参见附图)。
在被PRRS病毒分离物感染的母猪中观察到非主要临床体征，但在接种后(PI)5天观察到母猪112和153有温和的厌食。从接种后7天的6头母猪中的血清样品和接种后14天6头母猪中一头母猪的血清样品中分离得到病毒。如表1所示，在接种后14天的所有接种母猪中检测到高抗体滴度。
表1 用PRRS病毒分离物感染后86-天孕期母猪的病毒血症和抗体应答接种后天数母猪号 感染病毒0 714 212817 MH-Hs -/-a+/--/1,024-/1,024-/25653 MH-Hs -/- +/--/1,024-/1,024-/1,024冻融两次，将上清液接种到具有新鲜MARC-145细胞悬浮液的96-孔微量滴定板上，培养3-4天。通过用PRRS病毒参照阳性猪血清观察CPE和特定荧光来检查病毒感染的迹象。
通过间接荧光抗体(IFA)方法来试验母猪和猪崽的血清的抗体(Yoon等，J.Vet.Diag.Invest.，4144-147(1992))。用MARC-145细胞系制备96-孔试验板，一些血清通过如前所述的血凝抑制(HL)试验(Joo等，Aust.Vet.J.，52422-424(1976))来试验抗体。
结果PRRS病毒分离物在最初的分离中显示出不同的空斑大小。MN-H分离物根据其空斑大小被克隆成不同的MN-Hs和MN-HL群。克隆后，MN-Hs和MN-HL的空斑直径为＜2毫米和3-5毫米，MN-W的直径为2-3毫米(参见附图)。
在被PRRS病毒分离物感染的母猪中观察到非主要临床体征，但在接种后(PI)5天观察到母猪112和153有温和的厌食。从接种后7天的6头母猪中的血清样品和接种后14天6头母猪中一头母猪的血清样品中分离得到病毒。如表1所示，在接种后14天的所有接种母猪中检测到高抗体滴度。
表2 来自被不同PRRS病毒分离物感染的86-天孕期母猪的分娩结果和病毒分离物
a分娩或屠宰时的妊娠天数b干尸化或死产猪崽的头-臀长度(厘米)
c分离得的样品病毒数/试验样品数d妊娠107天屠宰的母猪以检查胎儿LB-活产；SB-死产；M-干尸化；IN-鼻内；IM-内肌注射；ND-不确定病毒从感染母猪的每胎中一头或多头猪崽中分离出来。从来自实验I的六头感染母猪的单头小猪可以分离病毒，实验I显示约半数胎儿(63头小猪中的28头)经病毒分离检查是阳性。在测试病毒存在的小猪中，24头活产小猪中16头(66.79％)、14头死产小猪中9头(64.3％)和25头干尸化小猪中3头(12.0％)中呈病毒阳性。28头小猪的血清样品为阳性，其中的10头小猪其肺样品在进行病毒分离实验时为阴性。
来自母猪153、147、68和112的死产小猪的血清通过IFA对PRRS病毒的抗体进行试验，通过HL对PPV的抗体进行试验，结果如表3所示。来自13个死产小猪中6头的血清和来自25头干尸化小猪中2头的胸液具有PRRS病毒抗体。IFA滴度范围为1∶16-1∶1,024，但对PPV病毒没有一个血清有抗体。来自母猪17和53的活产的14头小猪中的13头对PRRS病毒(IFA滴度1∶64-1∶1,024)和PPV(HL滴度1∶512-1∶16,384)都有抗体。
表3 检测感染PRRS病毒的母猪产下的死产小猪血清中的PRRS病毒抗体和PPV抗体
头-臀长度(厘米)bIFA或HL滴度的倒数cLB-活产；SB-死产；M-干尸化讨论本研究确证了不同PRRS病毒分离物导致经胎盘感染和对妊娠后期母猪的胎儿的致病作用的能力。但是，在PRRS病毒分离物之间的致病性没有明显的差异。当多产的母猪在妊娠93天鼻内接种PRRS病毒ATCC-VR 2332时，(Christianson，W.T.等，Can.J.Vet.Res.，57262-268(1993))，它们每胎平均为5.8头活猪崽和6.0头死胎。在本研究中。6头被MN-HL或2头野生病毒感染的母猪平均每胎分娩2.7头活的和11.5头死猪崽，这样这些病毒被认为是高度烈性的。ATCC-VR 2332和用于本研究的烈性病毒的致病性是不同的。这可能是由于妊娠期在感染ATCC-VR 2332病毒后7天。同时，6头感染MN-Hs的母猪每胎产下平均9.0头活猪崽和2.7头死猪崽。这些结果明显地与烈性病毒的结果不同，表明MN-Hs病毒是温和致病性毒株。
有趣的是在感染了相同来源的MN-Hs和MN-HL病毒的母猪的分娩结果可有明显的差异。在相同的条件下，MN-Hs和MN-HL病毒各自产下5和25头死猪崽(p＜0.005)。从本结果中可得知，MN-Hs和MN-HL是明显不同的，一个是温和毒株，另一个是高致病性病毒。
从感染PRRS病毒的胎儿中分离病毒相对容易，活产和死产的猪崽分离病毒的比率相似。由于不可能从每胎所有感染的猪崽中回收病毒，为了诊断，可从每胎中至少2头或更多的猪崽中分离病毒。业已发现，从血清中分离病毒比从肺组织样品中分离病毒更方便。
在感染烈性病毒的母猪胎儿中，一头或多头死产的猪崽可检测到对PRRS病毒有特异性的抗体。这些结果显示从死产或吸奶前的猪崽中检测抗体可为诊断异常产仔中PRRS病毒感染的有用方法。该方法在没有病毒分离技术和装置的实验室里是有价值的。在本研究中，13头死产猪崽中的6头对PRRS病毒而不是PPV其抗体滴度呈阳性，这证明检测的抗体来自胎儿，由于PRRS病毒而产生。
现尚不了解为什么感染PRRS病毒的牧群没有临床症状。经验表明，与健康水平较差的牧群相比，具有高健康状态的牧群在PRRS病毒感染前已显示出较温和的临床反应。一般的健康状况和本研究显示的毒株差异可能可以解释临床上显然的差异。另外，可以假定小空斑和大空斑病毒的相互作用可在宿主动物内发生，并改变了致病性。若我们想到尽管农场有高致病性的PRRS病毒MN-HL，但分离得到MN-H病毒在农场没有发生生殖问题，则上述的结论是对的。
实施例2本发明优选的疫苗可施用于繁殖的小母猪、母猪、公猪或断奶的猪崽。可以在任何时候肌内注射给予或口-鼻给予。但是，较好的是在交配前对繁殖的母猪进行免疫以防止整个怀孕期间和在断奶后短期保护小猪的后期养育、生长和完成阶段。
一般来说，本发明的疫苗给予量为2毫升，它含约104-108空斑形成单位(PFU)，更好的是约106PFU。对于繁殖母猪来说，免疫至少持续整个孕期，而对小猪进行断奶后免疫可保护整个阶段。本发明较好的疫苗可以交叉保护的大范围给予。
本发明的疫苗可包括活体或改性活体(弱化)病毒以及常规载体、稳定剂和/或佐剂。
实施例3介绍在该实施例中，检查了由北美PRRSV的MN-Hs毒株构成的疫苗防止3-周龄小猪被烈性北美PRRSV的MN-HL毒株感染引起病毒血症的能力。与感染北美PRRSV有关的呼吸疾病最初是由于被存在于猪圈中的继发性病原体感染而发生。但是，在试验条件下，由于没有这些继发性的病原体存在，被北美PRRSV-感染的猪的呼吸临床症状不再产生。因此，检查病毒血症是北美PRRS感染的最佳指征。没有病毒血症和激发MN-HL毒株表明，被MN-Hs毒株免疫的小猪对MN-HL毒株的感染也免疫。
材料和方法从没有PRRS感染的农场中采购20头3-周龄小猪。20头小猪用MN-Hs毒株经鼻内免疫(2毫升，104.5TCID50/ml)，剩余的8头小猪作为对照。免疫和对照小猪分窝饲养。在免疫后2周对6头免疫小猪(序号81-86)和4头对照小猪(序号93-96)用MN-HL毒株经鼻内激发(2毫升，104.5TCID50/ml)(组I)。剩余的6头免疫小猪(序号87-92)和4头对照小猪(序号97-100)在免疫后6周用相似的方法激发(组II)。每天观察所有小猪的临床症状。另外，从每头小猪每周收集血样供(1)用MARC-145细胞培养物分离病毒(Yoon等，J.Vet.Diag.Invest.，6289-292(1994))和(2)决定血清中性(SN)抗体滴度(Park等，Am.J.Vet.Res.，57320-323(1996))对免疫小猪检测SN抗体表明对烈性北美PRRSV的保护免疫。
结果接种疫苗后，从组I和II的小猪中能分离出疫苗病毒直至接种疫苗后的3周。激发时，组I和II中的任何对照和免疫小猪都观察不到症状。
组I激发时任何小猪检测不到SN抗体，激发后，从免疫和对照小猪中回收激发病毒。此外，免疫和对照小猪都有病毒血症(表1)组II免疫的小猪在免疫后3周产生SN抗体，激发时滴度在1∶2和1∶8之间。激发后，未从免疫的小猪中分离出激发病毒，而对照的小猪有病毒血症(表4)。这些结果显示，免疫的小猪对烈性北美PRRSV有获得性保护免疫。
表4在接种疫苗后2周或6周激发的3-周龄小猪中检测病毒血症和SN抗体猪序号 接种疫苗后周数0 1 2a3 4 5 6a7 8组I81V-/-b-/--/--/--/282V-/--/--/-+/-+/-83V-/--/-+/-+/-+/284V-/--/--/--/-+/-85V-/--/-+/-+/-+/486V-/--/-+/-+/--/493C-/--/--/-+/-+/-94C-/--/--/-+/-+/895C-/--/--/-+/-+/496C-/--/--/-+/-+/-组II87V-/--/--/-+/+-/--/2-/2-/8-/888V-/--/-+/--/--/--/4-/4-/64 -/12889V-/--/-+/--/--/2-/8-/8-/8-/3290V-/--/-+/-+/--/4-/8-/8-/128 -/6491V-/--/-+/--/2-/2-/8-/4-/32 -/6492V-/--/--/--/--/4-/2-/4-/4-/12897C-/--/--/--/--/--/--/-+/-+/-98C-/--/--/--/--/--/--/-+/-+/-99C-/--/--/--/--/--/--/-+/-+/-100C -/--/--/--/--/--/--/-+/--/2V＝接种疫苗后；C＝对照a＝用MN-HL病毒激发b＝病毒分离/SN抗体滴度组I和II的小猪各自在免疫后4周和8周被宰杀。
权利要求
1.一种疫苗，包含ATCC VR2509病毒。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中病毒是活体。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其中疫苗的剂量含104到108PFU。
4.一种给猪免疫以抵御北美猪生殖和呼吸综合征的方法，包括给猪施用权利要求1所述的疫苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其中疫苗是活体。
6.根据权利要求4所述的方法.其中猪是成年繁殖母猪。
7.根据权利要求4所述的方法，其中猪是猪崽。
8.根据权利要求4所述的方法，其中疫苗肌内、鼻内给予或口服给予。
9.一种制备疫苗的方法，包括下列步骤(A)通过空斑克隆得到北美PRRSV毒株；和(B)从步骤(a)得到的毒株中制备疫苗，其中当通过包括下列步骤的方法得到空斑时，毒株产生平均直径小于2毫米的空斑(a)用毒株接种细胞等分物，其中细胞具有ATCC VR2509，其中从保存在Eagle极限必需培养基中的细胞汇合单层得到等分物，Eagle极限必需培养基补充有3％胎牛血清和0.15％碳酸钠，其中等分物包括1-2×105细胞/毫升补充有3％胎牛血清和0.15％碳酸钠的Eagle极限必需培养基；(b)在37℃下使等分物培养60分钟；(c)从等分物中除去接种体；(d)用Eagle极限必须培养基洗涤等分物；(e)将等分物再悬浮于2×Eagle极限必需培养基和1.6％煮沸的补充有250微克二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的Noble琼脂；(f)让等分物铺平板；以及(g)在37℃下在CO2培养器中使等分物再培养5天得到空斑。
10.根据权利要求9所述的方法，其中疫苗包含活体北美PRRSV毒株。
11.根据权利要求9所述的方法，其中制备疫苗的方法包括得到纯化形式毒株的步骤。
12.根据权利要求9所述的方法，其中毒株被称为ATCC VR2509。
13.一种疫苗，包含北美PRRSV毒株，其中当通过包括下列步骤的方法得到空斑时，毒株产生平均直径小于2毫米的空斑(a)用毒株接种细胞等分物，其中细胞具有ATCC VR2509，其中从保存在Eagle极限必需培养基中的细胞汇合单层得到等分物，Eagle极限必需培养基补充有3％胎牛血清和0.15％碳酸钠，其中等分物包括1-2×105细胞/毫升补充有3％胎牛血清和0.15％碳酸钠的Eagle极限必需培养基；(b)在37℃下使等分物培养60分钟；(c)从等分物中除去接种体；(d)用Eagle极限必需培养基洗涤等分物；(e)将等分物再悬浮于2×Eagle极限必需培养基和1.6％煮沸的补充有250微克二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的Noble琼脂；(f)让等分物铺平板；以及(g)在37℃下在CO2培养器中使等分物再培养5天得到空斑。
14.根据权利要求13所述的疫苗，其中疫苗包含活体的北美PRRSV毒株。
15.根据权利要求13所述的疫苗，其中毒株被称为ATCC VR2509。
16.一种分离和纯化的北美PRRSV毒株，其中毒株被称为ATCC VR2509。
17.根据权利要求16所述的毒株，其中毒株是活体。
18.一种分离的和纯化的北美PRRSV毒株，其中当通过包括下列步骤的方法得到空斑时，毒株得到平均直径小于2毫米的空斑(a)用毒株接种细胞等分物，其中细胞具有ATCC VR2509，其中从保存在Eagle极限必需培养基中的细汇合的单层得到等分物，Eagle极限必需培养基补充有3％胎牛血清和0.15％碳酸钠，其中等分物包括1-2×105细胞/毫升补充有3％胎牛血清和0.15％碳酸钠的Eagle极限必需培养基；(b)在37℃下使等分物培养60分钟；(c)从等分物中除去接种体；(d)用Eagle极限必需培养基洗涤等分物；(e)将等分物再悬浮于2×Eagle极限必需培养基和1.6％煮沸的补充有250微克二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的Noble琼脂；(f)让等分物铺平板；以及(g)在37℃下在CO2培养器中使等分物再培养5天得到空斑。
19.根据权利要求18所述的毒株，其中毒株是活体。
全文摘要
本发明提供了给猪施用活体或改性活体PRRS疫苗,它们是低毒的,能有效地免疫以抵御PRRS。优选的疫苗包括平均空斑直径低于约2毫米和低致病性的病毒分离物。优选的疫苗包括小空斑直径毒株,ATCC保藏号VR2509。本发明的疫苗可施用于繁殖的母猪或小母猪和断奶的猪崽,可有效地免疫猪以抵御呼吸和生殖形态的疾病。
文档编号A61K39/155GK1188417SQ96194954
公开日1998年7月22日 申请日期1996年6月19日 优先权日1995年6月21日
发明者H·S·朱 申请人:明尼苏达大学董事会