有效控制猪繁殖与呼吸综合征(prrs)的基于合成肽的标记疫苗和诊断系统的制作方法
【专利摘要】本文公开了针对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的基于肽的标记疫苗以及用于预防、监测和控制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一组免疫诊断测试。本发明不同实施方案所述的疫苗制剂包含来源于PRRSV?GP2、GP3、GP4或GP5蛋白的肽的混合物；每种肽独立地包含B细胞PRRSV中和/受体结合表位，该表位独立地连接人工T辅助细胞表位以增强相应肽的免疫原性；并且其可以补充有代表来源于PRRSV?GP4、GP5、M和核壳蛋白的T辅助细胞表位的肽的混合物，以提供细胞介导的免疫性。在可接受的递送系统中制备此类病毒肽组合物作为疫苗制剂，并且可以在PRRSV攻击时对不含PRRSV抗体的猪提供对感染的交叉保护。
【专利说明】有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的基于合成肽的标
记疫苗和诊断系统
发明领域
[0001] 本公开内容涉及针对猪繁殖与呼吸综合征(Reproductive and RespiratorySyndrome, PRRS)的基于肽的标记疫苗以及用于监测和控制猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的一组免疫诊断测试。_2]发明背景
[0003]猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)于二十世纪八十年代晚期发现，发现其是大母猪(sow)和小母猪(gilt)中严重的生殖不能(severe reproductive failure)的原因，并且是养猪工业中最重要的病原体之一。大母猪和小母猪感染可能导致晚期流产、早产小猪和产下先天虚弱(weak-born)的小猪，而感染的公猪则表现出精子质量降低和精液中的病毒分泌。
[0004]另外，还发现PRRSV参与幼猪中的猪呼吸疾病综合症状，与继发性病毒和细菌感染联合引起呼吸问题。该病毒表现出受限的体内细胞向性，其中肺泡巨噬细胞是主要的靶细胞。
[0005]PRRSV是动脉病毒科(Arteriviridae)和巢状病毒目(Nidovirales)的有包膜的正单链RNA病毒(I)，长度约为15kb，由9个开放阅读框(ORFs)组成。病毒体由核壳核心组成，所述核壳核心由与病毒RNA缔合的核壳蛋白(由开放阅读框7，0RF7)构成。核壳由脂质包膜包绕，在所述脂质 包膜中包埋六种结构蛋白:糖蛋白GP2(0RF2a)、GP3 (0RF3)、GP4 (0RF4)和GP5 (0RF5)，以及非糖基化蛋白M(0RF6)和E (0RF2b)。GP5和M被认为是包膜中最丰富的蛋白，而其余包膜蛋白以较低的量存在。位于基因组5’末端的ORFla和ORFlb编码非结构蛋白。
[0006]与多种其他的RNA病毒相似，PRRSV表现出高基因变异性，这反映在毒力、与免疫系统的相互作用和病毒蛋白的抗原特性的变化。尽管在各基因型中存在高变异性程度，但是通常基于0RF5和/或0RF7序列将病毒毒株分类为欧洲(EU)和北美(NA)基因型。
[0007]PRRSV已经获得了多种允许逃避宿主的保护性免疫性的特性。这些特性为在感染一周或两周后病毒特异性抗体的晚产生；此类抗体在体外不能减少原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)中的病毒复制；非常需要的病毒中和抗体在感染后约三周到四周才以低水平出现，因此出现得太晚而不能影响病毒血症的急性期(1，2)。
[0008]尽管这种病毒中和抗体应答是弱的，但是，在感染发生时存在充分量的此类病毒中和抗体能够提供针对病毒在肺中复制、病毒血症和该病毒的经胎盘传播的保护，这表明PRRSV-特异性的中和抗体能够部分有助于保护性免疫性(2，3)。
[0009]在被感染的、具有中和抗体的猪的血液中发现PRRS病毒血症，这表明单独的体液免疫应答没有提供可靠的保护(solid protection)。已表明细胞介导的免疫性(CMI)在清除PRRSV方面起重要作用(4)。发现在感染的猪中的CMI应答的发生(通过淋巴细胞胚细胞样转变和适应性细胞因子产生(例如，干扰素Y ; IFN-Y)确定)是延迟的，并且在感染后约4-8周在外周血单核细胞(PBMCs)的体外回忆应答中可检测到，其与中和抗体的产生相关(5-7)。IFN-y在针对动物中的多种细胞病变病毒感染的细胞介导的免疫应答中起关键作用。在感染PRRSV的猪中，在淋巴结、肺和外周血单核细胞中检测到IFN-y mRNA(7)。
[0010]在过去的二十年以来，在整个PRRSV结构蛋白质组寻找代表诱发中和抗体的B细胞表位和诱发IFN- Y的T细胞表位的病毒抗原区已经成为兽医病毒免疫学中最有挑战性的课题之一。显示全球PRRSV研究团体的积累的努力产生的此类表位绘图结果的代表性的论文提供在本文中作为参考文献(8-10)。
[0011]尽管修饰的活疫苗(MLV)以及杀死的PRRSV病毒裂解物疫苗是可商购的，但是，对于PRRSV相关疾病的控制仍然是有问题的。由于PRRSV疫苗有效针对同源攻击而非异源攻击，所以一个主要的问题是功效。另外，在本领域中已经报道了关于MLV的安全性问题。修饰的活疫苗不适合用于怀孕的大母猪、小母猪，并且由于接种可能导致精液中疫苗病毒的泄出，因此也不适合用于公猪。修饰的活病毒疫苗可能在接种的动物中持久存在。已经报道了对未接种的动物的传播和因此产生的疫苗病毒诱导的疾病。此外，急需开发允许区分感染的猪和接种的猪的标记疫苗，由此促进对PRRSV感染的追踪和控制。
[0012]总之，急需设计包含不同功能性B和T细胞表位的免疫原性PRRSV肽，所述肽能够诱导保护性抗体和细胞免疫应答，以及设计引入这些设计肽的疫苗制剂，以允许在猪中对PRRSV毒株的交叉保护。随着这些合理设计的且分子表征的免疫原性肽的可获得性，还需要鉴定能够被来自感染的猪的抗体识别的抗原肽，并且使用这些设计肽来开发用于血清学鉴定感染的动物与接种的动物的一组诊断测试，由此的诊断系统，以允许有效地控制PRRSV感染。最后，需要开发用于此类基于肽的标记疫苗和诊断系统的低成本制备和质量控制的方式，以广泛用来有效地监 测和控制PRRS疾病。
[0013]参考文献:
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[0039]本公开内容涉及针对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的基于肽的标记疫苗以及用于预防、监测和控制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一组免疫诊断测试。
[0040]尽管存在关于结构性PRRSV蛋白质组的抗原区的可用的科学信息，但是，由于研究团体在数十年的努力后未能开发出任何成功的针对传染剂的基于肽的疫苗，因此有一些人持有这样的观点，即，对于大部分病原体将不可能产生和合成的肽疫苗。本发明人已经从第一代生物疫苗中学到很多，其中引入选择性PRRSV B和T细胞表位的合理设计途径应该允许验证和开发针对需要的病毒毒株的基于合成肽的PRRSV疫苗以及用于监测和控制所述疾病的成套的诊断测试。重要的是，认识到B细胞中和表位主要是构象性的，并且必须在设计那些B细胞表位相关的肽免疫原时进行考虑。相关的B抗原表位的鉴定和设计需要理解被靶向的分子的结构与其功能之间的关系。理解进行免疫原设计的靶分子的结构和功能的这样的学科被本发明人称为“功能抗原学(functional antigenics) ”。另外,免疫应答是复杂的且是多面性的。针对作为准种(quas1-species)群体存在的快速进化的RNA病毒的疫苗应该保持目的在于刺激尽可能多的不同的保护性免疫机制，从而使出现逃避宿主免疫系统的病毒变体的危险减至最少。[0041]成功的基于合成肽的疫苗将包含刺激免疫系统(包括适应性免疫性和先天性免疫性)的适当元素的成分。开发基于表位的肽疫苗的另一个主要的障碍部分是由于代表这些表位的长度较短的肽的非免疫原性性质。另外，需要引入B和T表位的大量组库(repertoire)，以允许疫苗针对由于病原体的遗传变异以及宿主的遗传可变性导致的宽泛的交叉保护的通用性。通过对针对多种疾病的基于合成的肽的疫苗和诊断测试的广泛尝试和实验验证，本发明人已经集中于模拟天然靶分子上的抗原位点的肽免疫原的合理设计，以诱导用于体外和体内血清学和功能研究的抗体，该肽免疫原补充有适当的T细胞表位，以增强所需要的免疫原性。这已经在每种靶标疾病中产生了用于临床和商业应用的优化的抗原、免疫原和疫苗制剂(11-20)。
[0042]本发明的各个实施方案所述的疫苗制剂包含来源于PRRSV GP2、GP3、GP4或GP5蛋白的肽的混合物；每种肽独立地包含B细胞PRRSV中和/受体结合表位，该表位独立地连接人工T辅助细胞表位以增强各个肽的免疫原性；并且其可以补充有代表来源于PRRSVGP4、GP5、M和核壳蛋白的T辅助细胞表位的肽的混合物，以提供细胞介导的免疫性。在可接受的递送系统中制备此类病毒肽组合物作为疫苗制剂，并且可以对不含PRRSV抗体的猪在PRRSV攻击时提供对感染的交叉保护。
[0043]本发明的各个实施方案所述的诊断系统包含一组诊断测试，其中一种测试以ELISA免疫测定形式针对两种重叠的PRRSV 0RF7-编码的抗原肽提供，以提供对PRRSV-感染的动物的优化的抗体识别，其余测试以ELISA免疫测定形式针对GP2、GP3、GP4和GP5来源的疫苗靶标肽提供，以提供对PRRSV肽疫苗免疫的动物的优化的抗体识别。组合来看，这些诊断测试组成用于区分感染的动物和接种的动物(Differentiation of Infected fromVaccinated Animals, DIVA)的诊断系统，因此有效地监测和控制所述疾病。
[0044]还涉及制备用于保护猪免于PRRSV感染的所述疫苗的方法，以及制备一组DIVA免疫诊断测试的方法，由此允许有效地控制所述疾病。
[0045]通过在靶标物种中的大量的血清学验证过程来设计并优化本发明的肽或肽组合物，以开发标记疫苗，所述标记疫苗与天然病毒交叉反应，对不含PRRSV抗体的小猪在PRRSV攻击时对感染交叉保护，并且开发一组基于肽的ELISAs，以区分感染的动物与接种的动物。
[0046]本公开内容涉及PRRSV疫苗，其具体包含来源于PRRSV GP2、GP3、GP4或GP5蛋白的B表位的肽和肽组合物，其中每种肽任选地连接T辅助细胞表位，以增强肽的免疫原性，从而在免疫的宿主中诱导体液免疫性，包括与PRRSV交叉反应的高滴度抗体。
[0047]在疫苗制剂中，所述肽或肽组合物进一步补充有代表PRRSV GP4、GP5、M和核壳蛋白的T细胞表位的另外的肽，以发起细胞介导的免疫应答。
[0048]提供本发明的多个实施方案。一组实施方案涉及有效作为抗原的一种或多种肽和一种或多种肽组合物，以检测来自感染的动物的针对核壳(NC)蛋白的抗体。第二组实施方案涉及有效用于检测针对来自接种的动物的标记疫苗靶向的GP2、GP3、GP4和GP5表位的抗体的肽和肽组合物。
[0049]还有另一组实施方案是涉及来源于PRRSV蛋白的B和T细胞表位二者的肽、其同源物和类似物。所述PRRSV优先、但是任选地连接人造组合的T辅助细胞表位，以增强其各自的免疫原性。
[0050]另外，另一组实施方案是涉及疫苗组合物，其包含来自PRRSV B和T细胞表位衍生的肽免疫原的肽和肽组合物，以诱导与天然PRRSV蛋白交叉反应的抗体应答和细胞介导的免疫应答二者，二者一起保护猪免受PRRSV感染。
[0051]每种这样设计的肽可以以毫克至千克规格化学合成用于工业应用，并且能够进行质量控制。 [0052]本发明的各个实施方案还提供递送载体(delivery vehicles)和常规与疫苗制剂结合的其他成分。
[0053]附图简沭
[0054]图1A.显示按照本发明的一个实施方案通过免疫荧光检测在共转染的HTK细胞系细胞的细胞质中的针对PRRSV GP5蛋白的抗体的机制的图示。
[0055]图1B.按照图1A所述的机制进行的免疫荧光测定(IFA)。检测具有与细胞质中的GP5结合的针对PRRSV GP5的抗体的共转染的HTK细胞系细胞。
[0056]图2A.在PRRSV MD001毒株(登记号AF121131)的核壳(NC)蛋白上的抗原位点的位置和鉴定抗原肽(SEQ ID NO:1)用于检测感染的动物中针对NC蛋白的抗体的UBI PRRSVNC ELISA。
[0057]图2B.在PRRSV MD001毒株(登记号AF121131)的核壳(NC)蛋白上的抗原位点的位置和鉴定抗原肽(SEQ ID NO:2)用于检测感染的动物中针对NC蛋白的抗体的UBI PRRSVNC ELISA。
[0058]图 3.来自 PRRSV 毒株 MD001 (SEQ ID No:3) ,JXAl (SEQ ID No:4)、NA (SEQ ID No:5) EU (SEQ ID N0.6)的同源核壳蛋白序列的比对。
[0059]图4.PRRSVJXAI毒株(登记号AY2G2352)的PRRSV ORF 2至ORF 7蛋白上适于标记疫苗设计的选择的B和T细胞表位的位置。
[0060]图5.用UBI PRRSV NC NA ELISA检测的来自不同来源的猪血清的血清反应性。
[0061]图6A.在通过UBI ’ s诊断系统(即，检测PRRSV感染的猪的测试和检测接受包含来源于GP2、3和4蛋白的设计的肽免疫原的疫苗制剂的动物的测试)检测和区分的PRRSV感染的猪中，UBI PRRSV标记疫苗制剂诱导针对目标肽免疫原的特异性的高滴度抗体。
[0062]图6B.在通过UBI ’ s诊断系统(即，检测PRRSV感染的猪的测试和检测接受包含来源于GP3、4和5蛋白的设计的肽免疫原的疫苗制剂的动物的测试)检测和区分的PRRSV感染的猪中，UBI PRRSV标记疫苗制剂诱导针对目标肽免疫原的特异性的高滴度抗体。
[0063]图7A.显示PRRS病毒攻击后的组织病理学损伤的照片。具有间质性肺炎(interstitial pneumonia)的对照组动物在肺中出现淋巴细胞对肺泡壁的增厚。
[0064]图7B.显示PRRS病毒攻击后的组织病理学损伤的照片。动物通过UBI PRRS GP5肽疫苗制剂免疫。肺保持正常的肺泡壁。
[0065]发明详沭
[0066]肽抗原可以检测免疫学反应，并且一些肽抗原还可以刺激免疫学反应。多种肽抗原可以用于免疫应答的灵敏性和特异性检测，但是最通常的是其本身不作用为免疫原。肽免疫原是一类特殊的肽抗原，其可以用于刺激免疫应答以及检测它们。按照本发明的一个实施方案，PRRSV疫苗中的肽抗原是具有B细胞(B)和T辅助细胞(Th)表位二者的肽免疫原，所述B细胞(B)和T辅助细胞(Th)表位一起作用刺激产生保护性免疫应答，并且还存在能够检测针对PRRSV感染的免疫应答的不同组的肽抗原。
[0067]一种鉴定B细胞表位的方法依赖于一组多种长度的嵌套的且重叠的肽，其长度典型地在20至60个残基或更长的范围。这些较长的肽通过一系列费力的独立的固相肽合成来合成。然后，所得到的多组嵌套的且重叠的肽可以用于抗体结合研究以鉴定最好呈递免疫显性决定簇(包括不连续的构象B细胞表位)的肽。本发明的一个实施方案提供两种重叠的PRRSV 0RF7-编码的核壳肽，其中，一种包含70个氨基酸的序列(SEQ ID No:l，也显示在图2A中)，另一种包含73个氨基酸的序列(SEQ ID No:2，也显示在图2B中)，每种本身具有B细胞表位簇，以进行优化的抗体识别。使用来自PRRSV-感染的小猪的血清样品和ELISA免疫测定形式，凭经验鉴定并优化这些抗原肽。可以适合包含肽抗原的抗体捕获相的任何免疫测定形式，例如，ELISA，都可以用来检测和量化与来自PRRSV-感染的猪的血液、血清或血浆样品中的PRRSV核壳蛋白的特定片段结合的抗体。
[0068]在一个具体的实施方案中，鉴定了约70个氨基酸的优化的PRRSV抗原肽(SEQ IDNo:1)(其对应于全长PRRSV核壳蛋白的氨基酸残基2-71)和约73个氨基酸的另一种优化的PRRSV抗原肽(SEQ ID No:2)(其对应于全长PRRSV核壳蛋白的氨基酸残基51-123)。这两种肽在混合物中等比例组合，以组成用于在感染的猪中通过ELISA检测针对PRRSV的抗体的最优化的抗体捕获相。这两种高度抗原性的肽均被发现具有免疫显性的B细胞表位簇，并且具有针对PR RSV阳性血清组的最显著和一致的抗原性。包含PRRSV核壳肽(例如，SEQ ID No:1与No:2)的诊断检测试剂盒的制备和应用在本发明的各个示例性的实施方案的范围内。
[0069]PRRSV抗原肽发明的具体实施方案进一步限定为SEQ ID Nos:1和2的免疫学功能同源物，其具有来自PRRSV的突变体和变异毒株的对应序列和构象元件。同源PRRSV抗原肽具有与起源变异PRRSV北美毒株的核壳蛋白位置2-71和51-123大致相关的氨基酸残基。此类同源物容易通过序列比对程序如ClustalW(由德国欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory,Germany)的Julie D.Thompson,Toby Gibson和英国剑桥的欧洲分子生物学研究所(European Bioinformatics Institute,Cambridge,UK.)的Desmond Higgins制作，算法)进行验证。图3显示通过ClustalW对取自不同PRRSV毒株的四种抗原序列的比对=MDOOl台湾/99Y/AF121131 (SEQ ID No:3)，JXAl北京/06Y/EF112445(SEQ ID No:4)， NA/NJ_a/04Y/AY37282， (SEQ ID No:5), EU/Lena/08Y/EU909691 (SEQ ID No:6)。图3中比对的核壳蛋白同源物的起源PRRSV毒株包括欧洲毒株的各种病毒。表 I 还示例了 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 (北美毒株/MD001/TW/AAC98536)的抗原肽的同源物(SEQ ID No:7和SEQ ID No:8)，其中EU是起源PRRSV毒株(欧洲毒株/08V204/比利时/EU/⑶737266)。在一个实施方案中，SEQ ID No:1的同源物(SEQ IDNo:7)具有EU毒株的PRRSV NC蛋白的大约氨基酸位置2至大约氨基酸位置72的氨基酸序列。在另一个实施方案中，同源物(SEQ ID No:8)具有EU毒株的PRRSV NC蛋白的大约氨基酸位置52至大约氨基酸位置128的氨基酸序列。这两种同源肽可以类似地以相等比例组合在混合物中，以组成最优化的抗体捕获相，从而用于在感染的猪中通过ELISA检测针对PRRSV (优选是欧洲毒株)的抗体。
[0070]本发明的同源物进一步定义为与SEQ ID No:1和SEQ ID No:2具有至少50%的同一性。在一个实施方案中，变异毒株同源物(SEQ ID NO:7)与SEQ ID No:1具有约50%的同一性。在另一个实施方案中，变异毒株同源物(SEQ ID NO:8)与SEQ ID No:2具有约64%的同一1f生。
[0071]除了从PRRSV NC蛋白鉴定的用于检测来自感染的动物的血清样品的抗体的抗原肽之外，在PRRSV GP2、GP3、GP4和GP5蛋白上存在于中和和/或受体结合功能位点相对应的抗原区。围绕这些表位区设计多种肽免疫原，用于通过基于目标肽的ELISAs来评估其各自的免疫原性，并且更重要的是，按照本发明的一个实施方案，用于通过免疫荧光测定(IFA)来评估诱导的抗体与天然PRRSV蛋白的交叉反应性。另外，在PRRSVGP4、GP5、M和NC蛋白上存在大量文献记录的免疫显性T细胞表位。来自这些T辅助位点的肽将在猪中引发淋巴细胞增生应答，这导致细胞因子(包括IFN-Y)产生，其在动物中的针对多种细胞病变病毒感染的细胞介导的免疫应答中起重要作用。
[0072]图4所示的实施方案示例基于PRRSVJXA1的序列(登记号AY2G2352)本发明在PRRSV ORF 2-0RF 7编码的(GP2，GP3，GP4，GP5，M和N)蛋白上选择的B和T细胞表位的分布和位置。
[0073]本发明的另一个实施方案提供四种优化的和选择的PRRSV B细胞表位簇肽的序列，即 GP5.3(V21-E65) (SEQ ID No:9)，GP2B (V111-L136) (SEQ ID No:10)，GP3B (C57-C75)(SEQ ID No:11)和GP4B (C52-C69) (SEQ ID No:12)。这些B细胞表位簇位于具有中和和受体结合特征的位点周围。
[0074]本发明的其他实施方案提供这四种PRRSV B细胞表位簇肽的免疫学功能类似物。表3显示具有MD001、JXA1、NA和EU的起源毒株的同源性GP5 (SEQ ID Nos: 13-15)，GP2 (SEQID Nos:17-19)、GP3 (SEQ ID Nos:21-23)和 GP4(SEQ ID Nos:25-27)来源的 B 表位簇肽序列的比对。还显示了每种B细胞表位簇肽(SEQ ID NOs =16,20,24,28)的共有序列，其中分
配给变异位置的氨基酸是最常用于这些位置的那些氨基酸。
[0075]B细胞表位簇肽的免疫学功能类似物包括SEQ ID Nos:9，10，11，12的变体以及基本保留与起源抗原肽相同的免疫学特性的同源物。例如，作为SEQ ID No:9的功能类似物或同源物的变体可以在氨基酸位置具有保守置换；整体电荷的变化；共价连接另一结构部分；或小的添加、插入、缺失或保守置换和/或它们的任意组合。因此，与PRRSV GP5.3B表位(V21-E65)抗原肽(例如SEQ ID No:9)结合的抗体也将以基本上相似的功效结合PRRSVGP5.3B表位抗原肽的免疫学功能类似物。在一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ IDNo:9或同源具有至少40%的同一性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID No:11或同源物具有至少56%的同一性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID No:12或同源物具有至少72%的同源性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID No:10或同源物具有至少80%的同源性。在另一个实施方案中，所述功能类似物与SEQ ID No:12或同源物具有至少94%的同源性。
[0076]在一个实施方案中，如表3中所示，PRRSV GP 5.3 B表位簇肽(V21-E65)的免疫学功能类似物包括已经通过保守置换和通过插入或缺失进行修饰的PRRSV GP5.3B表位簇肽的形式。在该实施方案中，免疫学功能类似物可以通过保守置换由SEQ ID No:9或由SEQID No:9的同源物进行修饰。
[0077]保守置换是这样的情形:一个氨基酸残基被另一个具有相似化学特性的氨基酸残基置换。例如，非极性(疏水的)氨基酸残基包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及带负电荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0078]在另一个实施方案中，如在表3和4中所示，免疫学功能类似物可以通过在N端、C端的氨基酸添加和/或通过对肽中间的插入而进行修饰。在本发明的各个实施方案中，添加是在肽的N端或C端。添加可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个氨基酸残基(SEQID Nos:9和30)。所述添加可以组成在PRRSV蛋白中不存在的且不改变PRRSV B表位簇肽的免疫原性的氨基酸序列。在PRRSV B表位簇肽中不存在的添加包括，但不限于，小的带电荷序列(例如，赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸)，能够形成分支结构的氨基酸(例如，ε N-赖氨酸)或能够形成环状结构的氨基酸(例如，半胱氨酸)。在本发明的一个实施方案中，添加在PRRSV中不存在的氨基酸序列是5个氨基酸或更少的氨基酸。氨基酸添加可以是经典的或非经典的氨基酸或其混合物。
[0079]在另一个具体的实施方案中，免疫学功能类似物可以通过对肽的N端、C端和/或中间的氨基酸缺失而进行修饰。在多个实施方案中，缺失是在肽的N端或C端。缺失可以是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11个氨基酸残基。在表4所示的一个具体的实施方案中，氨基酸序列的缺失是9个氨基酸或更少的氨基酸(SEQ ID Nos:33和34)。
[0080]在另一个实施方案中，如表7所示，PRRSV B表位簇肽的免疫学功能类似物包括已经通过改变电荷进行修饰的PRRSV B表位簇抗原肽。此类电荷改变可以是氨基酸置换、添加或缺失的结果，或是共价连接带电荷分子的结果。电荷改变可以具有这样的结果:与未修饰的肽相比较，使得肽碱性更高、酸性更高或更加中性。在一个具体的实施方案中，通过在N端或C端添加1-5个赖氨酸残基而使得肽碱性更高。在更具体的实施方案中，通过在N端添加3个赖氨酸残基而使得肽碱性更高。
[0081]通过非限制性实例举例，本发明的肽的免疫学功能类似物可以具有添加到末端氨基酸的I至约5个另外的氨基酸(经典的或非经典的)。例如，序列Lys-Lys-Lys可以添加到该PRRSV B细胞表位簇肽的氨基端以改变电荷。
[0082]肽可以使用标准技术，如Merrifield固相合成方法和对该程序的多种可用的改进而容易地合成。还可以使用重组DNA技术制备肽。因此，本发明的多个示例性的实施方案包括编码PRRSV B细胞表位簇抗原肽和PRRSV B细胞表位簇抗原肽的免疫学功能类似物的核酸分子及其互补物。本发明的多个示例性的实施方案也包括载体，特别是表达载体，所述载体包含编码PRRSV B细胞表位簇抗原肽和免疫学功能类似物的核酸分子。本发明的多个示例性的实施方案还 包括包含所述载体的宿主细胞。
[0083]本发明的多个示例性的实施方案还包括制备PRRSV抗原肽和PRRSV抗原肽的免疫学功能类似物的方法。例如，所述方法可以包括在使得PRRSV肽和/或PRRSV肽的免疫学功能类似物表达的条件下培育包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码PRRSV抗原肽和/或PRRSV抗原肽的免疫学功能类似物的核酸分子。[0084]本发明的一个实施方案提供通过固相合成制备的肽组合物。该实施方案可以使用来源于感染的细胞的裂解物或分泌物的受控目充分限定的免疫原。通过该实施方案的化学方法制备的抗原的质量得到控制和限定，并且结果可以确保抗原性、免疫原性和产率的再现性。此外，在制备肽抗原时不使用生物危险性物质，这降低了风险并消除了对昂贵的生物学防范的需求。由于位点特异性免疫原存在高摩尔浓度的所选表位，确保使用PRRSV抗原肽组合物的疫苗的安全性和致免疫力。
[0085]在一个实施方案中，本发明的肽是合成的。使用限定的PRRSV抗原合成肽使在小猪中用作抗原进行抗体检测和诊断时的假阳性结果最少。使用具有已知的B细胞和Th表位的限定的合成肽作为免疫原消除了在用作疫苗的免疫原成分时由于存在抗原物质引起的不需要的非-PRRSV-特异性的免疫应答，所述抗原物质来源于PRRSV-感染的宿主细胞或重组病毒感染的宿主细胞和来自可以与PRRS病毒共同纯化的重组蛋白表达系统和/或重组蛋白。例如，来自猪的血清具有针对宿主细胞的抗体，或针对重组大肠杆菌(Escherichiacoli)、酵母或杆状病毒(baculovirus)的抗体,然后其与基于生物来源的抗原的诊断测试中所用的抗原物质交叉反应，并且由具有这些外来免疫原作为成分的疫苗产生的这样的免疫应答是非保护性的。相比之下，接受本发明的PRRSV肽疫苗的猪将产生专一的免疫应答，避免针对来源于宿主细胞或表达载体的蛋白(例如，来自重组人肠杆菌、酵母或杆状病毒的已与生物来源的PRRSV抗原共同纯化的蛋白)的不需要的抗体和其他免疫应答。 [0086]该合成肽的实施方案还使在制备过程中产生的杂质的干扰减至最少。利用长的合成，尽管严格控制偶联效率，但是，由于延伸循环过程中的事件，包括氨基酸插入、缺失、置换和提前终止，也产生肽类似物，由此导致随着目标肽合成一起产生多种肽类似物。然而，当在免疫学应用中用作免疫诊断目的的固相抗原或用作接种目的的免疫原时，此类肽类似物在肽制剂中仍然适合作为抗原性和免疫原性的贡献剂。
[0087]在25年的合成肽免疫学应用的经验中，我们已经发现，与允许通过小分子药物保留特定药物活性或在与生物来源的药物共同制备的大分子中存在的需要的活性和不需要的毒性的结构可变性范围相比，允许保留目的免疫学活性的结构可变性的范围适应性(accommodating)大得多。这就是为什么肽类似物(有意设计的或由于合成过程中的误差不可避免产生的作为具有与目的肽相似的色谱和免疫学特性的缺失序列副产物的混合物)通常与所需要的肽的纯化制剂一样有效。设计的类似物和意图之外的类似物混合物是有效的，只要开发出有判断力的QC方法来监测制备过程和产物评估过程，从而保证利用这些肽的最终广品的再现性和功效。
[0088]在本发明的其他实施方案中，内源性PRRSV Th肽及其同源物(SEQ ID N0.47-79)可以包含在疫苗组合物中。Th肽的存在可以提高PRRSV肽疫苗的免疫原性。PRRSV B表位来源的免疫原性肽(包括上述同源物和类似物)可以与内源性PRRSV Th表位混合。
[0089]在本发明的其他实施方案中，内源性PRRSV Th肽可以作为组合序列存在，其中，基于针对所述PRRSV Th肽的同源物的序列，氨基酸残基的组合存在于构架内的特定位置上。组合肽的组装物可以通过一种合成方法合成，在所述合成方法中，通过在指定的位置添加指定的受保护的氨基酸的混合物而不是添加一种特定的氨基酸。所述组合PRRSV Th肽组装物可以允许对多样性遗传背景的动物的宽泛的T辅助细胞表位覆盖。代表性的PRRSV Th肽组合序列显示在表7的SEQ ID Nos80-90中，对于每种PRRSV Th表位，其来源于表6的SEQ ID Nos47-79。
[0090]在一个实施方案中，具有来自ORF 4、0RF5、0RF6和0RF7的免疫显性PRRSV Th表位簇的肽，其描述为基于JXAl序列的SEQ ID Nos:47，51，55，59，61，63，67，70，74，76 (也显示在表6中)并且不与PRRSV B肽免疫原连接，可以用来补充PRRSV B表位肽免疫原的免疫原性，从而增强基于肽的PRRSV疫苗制剂的免疫原性，如实施例5所示。包括SEQ ID Nos:47，51，55，59，61，63，67，70，74，76作为游离肽，而不与B表位肽免疫原共价连接，可以提高疫苗制剂的免疫原性。在如实施例10所述的另一个实施方案中，组2包括SEQ ID Nos:47，51，55，59，61，63，67，70，74，76 作为游离肽，组 1、3 和 4 包括 SEQ ID N0s80_90 作为游离肽，而不与B表位肽免疫原共价连接，可以提高疫苗制剂的免疫原性。
[0091]在另一个实施方案中，PRRSV肽(包括上述同源物和类似物)可以通过或不通过间隔区与包含已知含有Th表位的序列的肽共价连接。该实施方案可以提供比不具有共价连接的Th表位的等价免疫原提高的免疫原性。在一个特定实施方案中，包含Th表位的肽被共价连接到PRRSV肽的N端(SEQ ID No:38)和/或C端(SEQ ID No:39)。在另一个特定的实施方案中，间隔区具有序列Lys-Lys-Lys- ε NLys (SEQ ID No:36),或单一氨基酸eNLys，也显示在表5中(分别为SEQ ID Nos:43和42)。在一个实施方案中，包含Th表位的肽共价连接到PRRSV肽的氨基端。在一个特定实施方案中，表5所示的包含Th表位的肽(SEQ ID No:40)是通过Lys-Lys-Lys- ε NLys间隔区(SEQ ID No:36)连接到氨基端的人工组合的Th肽SEQ ID No:35 (如在表5中所示)，并且表示为SEQ ID No:40。
[0092]本发明的各个实施方案涉及用于保护猪抵抗PRRSV的疫苗组合物。在示例性的实施方案中，疫苗包含免疫原性肽抗原或肽免疫原组合物和可接受的递送载体或佐剂。在不同实施方案中，PRRSV疫苗组合物包含肽抗原或肽免疫原组合物和兽医学上可接受的递送载体或佐剂，其中所述肽抗 原包含选自由下列组成的组的氨基酸序列:
[0093]a) PRRSV B 细胞表位簇肽抗原 GP5.3 (V21-E65) (SEQ ID No:9)、GP2B (V111-L136)(SEQ ID No:10)、GP3B(C57-C75) (SEQ ID No:11)和 GP4B (C52-C69) (SEQ ID No:12)中的任一种；
[0094]b) (a)的同源物；
[0095]c) (a)或(b)的抗原性和免疫学功能类似物，
[0096]d)具有至少一个保守氨基酸置换、氨基酸添加和/或氨基酸缺失的(a)，(b)或(C);和
[0097]e) (a)-(d)的任意组合。
[0098]在PRRSV疫苗的实施方案中，通过添加或缺失I至5个氨基酸而改变肽抗原的电荷。在PRRSV疫苗的另一个实施方案中，抗原性和免疫学功能同源物或类似物与来自来源于 GP2、GP3、GP4 和 GP5 的 PRRSV B 细胞表位簇肽抗原 GP5.3 (V21-E65) (SEQ ID No:9)、GP2B(V111-L136)(SEQ ID No: 10)、GP3B(C57-C75)(SEQ ID No:11)和 GP4 B (C52-C69)(SEQID No:12)中的任一种的氨基酸序列的抗原具有至少50%的同一性。在一个特别的实施方案中，肽抗原具有选自由SEQ ID Nos:9，10，11，12组成的组的氨基酸序列。
[0099]在PRRSV疫苗的另一个实施方案中，所述肽抗原还包含共价连接到所述肽抗原的N端或C端的T辅助细胞表位。在一个特定的实施方案中，T辅助细胞表位共价连接到所述肽抗原的氨基端。在另一个特定的实施方案中，T辅助细胞表位通过具有至少一个氨基酸的间隔区共价连接到肽抗原上。在一个特别的实施方案中，所述T辅助细胞表位为SEQ IDNo:35o在另一个特别的实施方案中，间隔区为Lys-Lys-Lys-ε NLys (SEQ ID NO:36)。在另一个特别的实施方案中，间隔区为eNLys。在一个特定的实施方案中，肽抗原为SEQ IDNo =42,43,44,45 或 46。
[0100]在各个示例性实施方案中，可以使用任意量的免疫原性肽抗原来在动物中引发免疫应答。在一个特别的实施方案中，肽抗原的量为约0.1 Ug至约lOOmg。在另一个特别的实施方案中，肽抗原的量为约1μ g至约lOmg。在另一实施方案中，肽抗原的量为约10 μ g至约Img。
[0101]在PRRSV疫苗组合物的不同实施方案中，所述组合物还包含SEQ ID Nos =47,51,52，55，59，61，63，67，70，74和76的十一种PRRSV T辅助细胞表位肽的等摩尔混合物。在一个特定的实施方案中，SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74和76的等摩尔混合物的量为约0.1μ g至约lmg。在一个更具体的实施方案中，SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74和76的等摩尔混合物的量为约I μ g至约100 μ g。
[0102]在各个示例性的实施方案中，可以使用任意类型或任意量的递送载体或佐剂。在一个特定的实施方案中，递送载体和佐剂是Montanide? ISA50V(一种由植物油及二缩甘露醇油酸酯(mannide oleate)构成的油性疫苗佐剂,用于制备油包水形式的乳液)、Tween,?80 (亦被称为:聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、CpG寡核苷酸和/或它们的任意组合。
[0103]在一个特定的实施方案中，PRRSV疫苗组合物包含SEQ ID No:33的肽抗原和兽医学上可接受的递送载体或佐剂，其中肽抗原的量为约10 μ g至约lmg。
[0104]本发明的另一个实施方案涉及用于保护PRRSV母体来源的抗体(MDA)阳性或不是PRRSV母体来源的抗体(MDA)阳性的小猪抵抗PRRSV感染的方法，所述方法包括施用上述任意示例性实施方案所包括的疫苗。
[0105]按照本公开内容制备的两种具有SEQ ID Nos:1和2的PRRSV NC肽的混合物还可以用于通过在免疫测定的捕获相中(例如，在ELISA检测试剂盒的固相免疫吸附中)使用抗原有效量的肽来检测PRRSV抗体。按照本发明的实施方案，任何相容的免疫测定形式都可以与所述肽一起使用。所述形式是普通技术人员公知的，并且已经记述在许多标准的免疫学手册及文章中，例如，参见Harlow等，1988 (24)。这些公知的免疫测定形式特别包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫斑点分析、凝集测定、抗体-肽-抗体夹心测定、肽-抗体-肽夹心测定。在一个实施方案中，免疫测定是使用包被有包含两种PRRSV NC抗原肽(SEQ ID Nos:1和2)的肽组合物的固相的ELISA0
[0106]按照本发明的一个实施方案，所述肽能够通过筛查ELISA检测来自于母猪(sow)和小母猪(gilt)、公猪和阉公猪以及小猪的血清的PRRSV感染，用于评估来自于接种前的小猪的血清的母体来源的抗-PRRSV抗体的水平和用于确定接种的小猪中针对使用PRRSV抗原肽的疫苗的免疫应答水平。
[0107]在一个特定实施方案中，可以利用ELISA免疫测定来测试猪血液、血清或血浆样品中抗-PRRSV抗体的存在，包括以下步骤:
[0108]1.将两种PRRSV NC肽(SEQ ID Nos:1和2)的混合物连接到固体支持物上，
[0109]ii将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品；和
[0110]iii.检测与连接到所述固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
[0111]在另一个特定实施方案中，可以利用ELISA免疫测定来测试猪血液、血清或血浆样品中抗-PRRSV抗体的存在，包括以下步骤:
[0112]i.将作为起源于欧洲毒株序列的SEQ ID NOs:1和2的同源物的两种PRRSV NC肽(SEQ ID Nos:7和8)的混合物连接到固体支持物上，
[0113]ii将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品；和
[0114]iii.检测与连接到所述固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
[0115]在所述ELISA试剂盒的示例性的应用中，将待检测的猪血清样品稀释在样品稀释剂中，然后在任意抗体(如果存在的话)与肽-敏化的固相结合的条件下与上述一种或多种PRRSV NC肽接触一段时间。去除未结合的物质后(例如，通过用磷酸缓冲的盐水洗涤)，二级复合物与标记的针对猪特异性IgG的抗体或标记的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G接触。这些抗体或蛋白A、G或A/G与二级复合物结合形成三级复合物，并且由于第二抗体或蛋白A或G或A/G用报道分子标记，因此，当进行检测方式时，检测到所述三级复合物。报道分子可以是酶、放射性同位素、荧光团、生物发光分子、化学发光分子、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等。对于ELISA，报道分子优选是酶。
[0116]本发明的具体实施方案包括，但不限于下述:
[0117](I) 一种猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗组合物，所述组合物包含肽抗原和兽医学可接受的递送载体或佐剂，其中所述肽抗原包含选自由下列各项组成的组的氨基酸序列:a) SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11,SEQ ID NO: 12，及其任意组合；b) (a)的同源物；和c) (a)或(b)的任意组合。
[0118](2)根据(I)所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
[0119](3)根据⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
[0120](4)根据⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO=Il的氨基酸序列。
[0121](5)根据⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
[0122](6)根据(I)所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原通过添加或缺失1_5个氨基酸而改变。
[0123](7)根据(I)所述的PRRS疫苗，其还包含共价连接到所述肽抗原的氨基端或羧基端的T辅助细胞表位。
[0124](8)根据(7)所述的PRRS疫苗，其中所述T辅助细胞表位是SEQ IDNOs:35。
[0125](9)根据(7)所述的PRRS疫苗，其中所述T辅助细胞表位通过包含ε赖氨酸残基的间隔区共价连接到所述肽抗原上。
[0126](10)根据(9)所述的PRRS疫苗，其中所述间隔区是SEQ ID NO:36。
[0127](11)根据(I)所述的PRRS疫苗，其还包含不与抗原肽连接的T辅助细胞表位，其中所述T辅助细胞表位选自由SEQ ID NOs:47-90组成的组。[0128](12)根据⑴所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原的总量为约IOyg至约lmg。
[0129](13)根据(I)所述的PRRS疫苗，其中所述递送载体和佐剂选自由下列各项组成的组:Montanide ISA50V,聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯和CpG寡核苷酸。
[0130](14) 一种用于保护小猪抵抗PRRS感染的方法，所述方法包括施用⑴所述的疫苗。
[0131](15) 一种PRRS疫苗组合物，所述组合物包含:a)肽抗原和兽医学可接受的递送载体或佐剂，b)包含选自由SEQ ID Nos:10，11，12，31及其组合组成的组的氨基酸序列的肽抗原，和c)选自由SEQ ID NOs:80-90及其组合组成的组的PRRSV Th肽。
[0132](16) 一种PRRS疫苗组合物，所述组合物包含:a)肽抗原和兽医学可接受的递送载体或佐剂，b)包含选自由SEQ ID Nos:42，44，45，46及其组合组成的组的氨基酸序列的肽抗原，和c)选自由SEQ ID NOs:80-90及其组合组成的组的PRRSV Th肽。
[0133](17) 一种用于诊断PRRS感染的方法，所述方法包括下述步骤:a)将SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2的混合物连接到固体支持物上，b)将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品，和c)检测与连接到所述固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。[0134](18)用于测试抗-PRRSV抗体存在的ELISA免疫测定法，其包括下述步骤:a)将SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8的混合物连接到固体支持物上，b)将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品，和c)检测与连接到所述支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
[0135]下述实施例作用于举例说明本发明，并且不是用来限制本发明的范围。
[0136]实施例1
[0137]使用PRRSV共转染的HTK细胞通过免疫荧光测定(IFA)评估靶标PRRSV B细胞表位簇肽抗原与天然PRRSV蛋白抗原之间的交叉反应性的免疫血清滴度的血清学测定
[0138]可以使用共转染重组痘苗病毒rVVT7 (T7聚合酶重组痘苗病毒)与分别编码T7启动子下游的PRRSV orf3、orf4和orf5的质粒的HTK细胞通过免疫荧光检测针对PRRSV亚基蛋白GP3、GP4和GP5的抗体。这种方法提供这些PRRSV蛋白在哺乳动物细胞中的瞬时表达，具有使用其原始病毒复制的高保真度。由于PRRSV GP3、GP4和GP5由跨膜结构域和侧链修饰组成，所以，最好的PRRSV蛋白结构只可能从头制备。每种PRRSV亚基蛋白，即GP2、GP3、GP4或GP5，从头合成，并且使用共转染的HTK细胞作为通过免疫血清进行细胞内染色的靶细胞，以在免疫测定中评估针对PRRSV的特异性抗体的存在。这种免疫荧光测定系统允许以高特异性和灵敏性检测针对天然PRRSV抗原的抗体的最佳条件。
[0139]按照图1A所示的机制，将HTK细胞系细胞转染T7聚合酶重组痘苗病毒(rVVT7)(21),并且通过 lipofectamine?(Invitrogen) (22),共转染PRRSV_orf3、orf4和 orf5质粒。具体来说，构建通过T7聚合酶启动子调控表达天然PRRSV蛋白的pRRSV质粒按下述完成:通过聚合酶链式反应(PCR)扩增全长pRRSV基因(来自登记号为AF035409的台湾PRRSV
MDOOl毒株)并且克隆到pCR2.1 丫0丨)(/质粒载体(Invitrogen)中。通过测序验证pRRSV
质粒的表达能力，其显示来自PRRSV毒株MDOOl的orf3、orf4和orf5的全长核苷酸序列。
[0140]HTK细胞在96-孔平板中生长至80 %汇合，感染rVVT7 (22)，然后通过Iipofectamine?(Invitrogen)分别共转染 pRRSV orf3、orf4 和 orf5 质粒。共转染后 24小时，将细胞用80%丙酮固定，并且将平板保存在-80°C，以通过免疫荧光测定(IFA)检测针对PRRSV蛋白的抗体。
[0141]图1A的示例显示感染T7聚合酶重组痘苗病毒(T7/vac) (21)和通过
Iipofectamine? (Invitrogen)共转染pCR_orf5质粒的HTK细胞。重组GP5蛋白在其翻译后转运到细胞质中(22)。按照本发明的一个实施方案，抗-GP5抗体与转染的HTK宿主细胞的细胞质结合，由此它们能够通过标记的二级抗体的免疫荧光进行检测。这种方法通过在HTK细胞中由原核T7启动子调控瞬时真核表达全长PRRSV GP5蛋白提供以高特异性检测针对真正的PRRSV GP5蛋白的抗体。使用pCR-全长PRRSV基因组的类似的转染也可以用来通过在HTK细胞中由原核T7启动子调控瞬时真核表达全长PRRSV基因组而以高特异性检测 PRRSV GP2、GP3、GP4、M 和 N 蛋白。
[0142]通过免疫荧光测定(IFA)滴定PRRSV抗体
[0143]血清样品起始在PBS中稀释10倍，然后2倍连续稀释。对于每次检测运行，包括来自PRRSV-感染的SPF猪的阳性对照血清和来自未感染的SPF猪的阴性对照血清，以验证通过pRRSV orf-7质粒的PRRSV核壳蛋白的表达。在高于1: 10的稀释度给出定位在细胞质的荧光信号(如图1B所示)的血清样品评分为IFA滴度> 10 ;这些滴度指示动物感染了 PRRSV。对于来自由于接种而包含“目标肽”特异性抗体的动物疫苗的血清，其针对特定抗原蛋白或全长PRRSV基因组的交叉反应性可以使用相对应的目标天然PRRSV蛋白(例如GP2，3，4或5)通过免疫荧光测定(IFA)进行评估。由具有天然感染的猪或由给予基于PRRSV肽的疫苗的猪收集的血清样品的所有检测按照编号进行。
[0144]实施例2 [0145]基于PRRSV B细胞表位簇肽抗原的ELISAs用于代表PRRSV的中和/受体结合位点设计肽的免疫原性评估
[0146]96-孔平板的孔用IOOyL在IOmM NaHCO3缓冲液(pH9.5)(除非另外指明)中2ug/mL(除非具体提及)的单个目标肽在37°C分别包被I小时。
[0147]将肽包被的孔用250 μ L在PBS中的3重量％的明胶在37°C温育I小时，以封闭非特异性蛋白结合位点，然后用含有0.05体积％ TWEEN? 20的PBS洗涤三次并且干燥。将通过IFA检测对PRRSV抗体阳性的猪血清和阴性对照血清用含有20体积％正常山羊血清、I重量％明胶和0.05体积％ TWEEN ? 20的PBSl: 20稀释，除非另外指明。每孔添加一百微升的稀释样品，并且允许在37 V反应60分钟。
[0148]然后，将孔用含有0.05体积％ TWEEN ? 20的PBS洗涤六次，以去除未结合的抗体。使用辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗猪IgG作为标记的追踪剂来结合在阳性孔中形成的抗体/肽抗原复合物。每孔加入一百微升处于预先滴定的最佳稀释度且在含有I体积％正常山羊血清和0.05体积％ TWEEN ? 20的PBS中的过氧化物酶-标记的山羊抗-猪IgG并且在37°C再温育30分钟。将孔用含有0.05体积％ TffEI N ^ ?0的PBS洗涤六次，以去除未结合的抗体，并且与100 μ L在柠檬酸钠缓冲液中含有0.04重量％ 3’，3’，5’，5’ -四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积％过氧化氢的底物混合物再反应15分钟。该底物混合物用来通过形成有色产物来检测过氧化物酶标记。通过加入100 μ L 1.0M H2SO4终止反应，并且确定450nm处的吸光度(A450)。
[0149]血清稀释按照检测动物血清中的PRRSV抗体的目的进行:(a)为了鉴定潜在的天然感染，使用1: 20稀释，记录A45tl读数，并且利用内在的固有阴性对照进行截点计算；或(b)为了确定接受基于肽的PRRSV疫苗制剂的猪的抗体滴度，检测1: 10至1: 10，000的10倍连续血清稀释液，并且通过A45tl的线性回归分析计算检测的血清的滴度，表示为Log1Q。
[0150]实施例3
[0151]鉴定诊断应用中的最佳PRRSV抗原肽以区分感染的动物与接种的动物
[0152]先前公布的来自PRRSV分离株JXAl，LV, EU, NA和来自台湾毒株MD001的序列的PRRSV的基因组序列用来推断开放阅读框的蛋白序列，并且由ORF 2，3，4，5，6和7编码的蛋白序列获得的数据用来设计用于检测来自具有PRRSV感染的动物的血清中的抗体的B细胞表位簇抗原肽和用于在接受标记疫苗制剂的动物中检测诱导的特异性抗体的抗原肽，所述抗原肽代表用于标记疫苗制剂的功能性中和/受体结合位点。 [0153]我们利用这样的策略:利用生物信息学信息和典型的免疫试验来限制为鉴定用于诊断和疫苗应用的最佳B和T细胞表位簇肽而筛选的肽的数量。
[0154]开发区分感染的动物与接种的动物所急需的工具，其称为“DIVA”系统，与标记疫苗设计方法互相补充。
[0155]由于在猪PRRSV感染过程中产生的大部分抗体特异性针对PRRSV 0RF7编码的核壳蛋白(NC)蛋白，因此，针对其的主要抗原决定簇在来自同一大洲的毒株中相对充分保守的，因此，靶向NC蛋白作为检测病毒特异性抗体和诊断感染和疾病的适当的候选子。使用基于合成肽的抗原进行抗体捕获的优点是公知的，包括由于没有引起假阳性的与PRRSV不相关的细胞成分导致的提高的特异性，以及由于表位簇肽的固有性质导致的提高的灵敏性。
[0156]具有已知的PRRSV感染的动物的阳性血清用来针对强的和一致性的抗原性筛选可用于抗体检测的重叠的PRRSV 0RF7编码的NC肽。从已知不具有PRRSV感染的正常的和SPF猪收集阴性血清。关于北美MD001毒株的NC蛋白的表位绘图的数据总结在图2中。使用2ug/mL的设计肽以0.1mL/孔包被平板，进行间接ELISA。合成具有来源于MD001 NC蛋白的序列的长度增加两个系列(a至e)的肽。合成4171系列的肽(图2A所示)，C端从残基71开始，同时合成4172系列的肽(图2B所示)，C端从残基123开始。这些肽分别用于平板包被并且用三组汇集的PRRSV阳性血清以及一组12份验证的PRRSV阴性血清检测每种肽的灵敏性和特异性。
[0157]如图2A所示，发现肽4171e(SEQ ID NO:1)在用具有位于肽4171e的N端的序列“PNNNGKQQKKK” (SEQ ID No:91)的Ilmer抗原表位检测的该4171系列的肽中是抗原性最强的。
[0158]如图2B所示，发现钛4172e (SEQ ID NO:2)在用具有位于N端的序列“EKPHFPLATEDDVRHHFT”(SEQ ID No:92)的18mer抗原表位检测的该4172系列的肽中是抗原性最强的。
[0159]18mer 抗原表位 “EKPHFPLATEDDVRHHFT” (SEQ ID No:92)在存在于肽 4171a_d 中时没有抗原性。然而，该18mer肽表位本身存在于全长4171e分子(SEQ ID NO: I)中以与SEQ ID NO:1上的Ilmer抗原表位“PNNNGKQQKKK”组合形成大的构象表位。此外，两种70和73mer肽(分别为SEQ ID N0:1和2)的出乎意料的免疫显性抗原性与代表NC蛋白上的大暴露表面的长肽一致，呈现长的连续的和不连续的表位的队列。[0160]抗原肽4171e(SEQ ID No:1)和 4172e(SEQ ID No:2)以 2:1 比例的混合物用于以3ug/mL每孔0.1mL进行平板包被，其形成用于捕获/检测针对PRRSV北美毒株的抗体的UBI PRRSV NC ELISA 的一部分。
[0161]如图3所示，比对来自多个PRRSV毒株(MD001，JXAl，NA和EU)的同源性NC蛋白序列。尽管与亲本MD001序列比较时，对于起源EU序列存在显著的氨基残基的置换、插入和缺失，但是，表1所示的基于起源欧洲毒株的PRRSV核壳蛋白氨基酸序列的置换肽同源物(SEQ ID No:3和SEQ ID No:4)在UBI PRRSV NC EU ELISA中类似地用作抗原，用于捕获/检测针对PRRSV欧洲毒株的抗体。
[0162]一组之前通过IFA检测关于抗-PRRSV NC蛋白反应性表征的30份血清用作阳性血清组，以进一步验证UBI PRRSV NC ELISA的灵敏性和特异性。如表2所示，当IFA的检测界限为约1: 16稀释度时，UBI PRRSV NC ELISA具有与关于NC蛋白的IFA检测大致相同的灵敏性水平。UBI PRRSV NC ELISA检测用作补充的血清学工具来评估现场样品(fieldsample)并且鉴定感染的动物和接种的动物，以及评估其他实施例中所述的基于PRRSV标记肽的疫苗。
[0163]实施例4
[0164]设计并合成用于血.清学验证的肽，以鉴定用于PRRSV标记疫苗的抗原肽
[0165]设计大量PRRSV抗原肽全体成员，所述PRRSV抗原肽代表来自PRRSV GP2，GP3，GP4，GP5，M和NC蛋白的PRRSV B和T细胞表位簇位点，序列长度为约10至约70个氨基酸。对于一些肽，在适当位点进行氨基酸置换，以允许形成环形的肽，从而发挥对局部结构保持的限制，进而使与相对应的 天然蛋白的交叉反应性最大化。对于其他抗原肽，进行于人造组合Th肽(例如，UBITh3，SEQ ID No:15)的连接，以增强其各自的免疫原性。所有的肽进行劳动力集中型和时间灵敏性的“血清学验证”过程，包括肽合成的重复循环，疫苗制剂，动物免疫，和血清学检测，以产生候选肽，用于在目标动物中进一步检测已经通过我们的初步应用的各种诊断剂和疫苗。
[0166]用于免疫原性检测的所有肽使用430A、431和433型应用生物系统肽合成仪(Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models 430A,431 和 433)利用 Fmoc 化学合成。每种肽都是通过独立合成在固相支持物上产生，具有N端Fmoc保护和三功能氨基酸的侧链保护基团。将合成完毕的肽从固相支持物上切下，并且通过90%三氟乙酸去除侧链保护基团。合成的肽制剂通过Matrix辅助的激光解析飞行时间(Matrix-Assisted LaserDesorption Time-Of-Flight, MALDTOF)质谱法表征正确的组成，并且通过反相HPLC表征包括合成模式和浓度的内容。对于长的合成，尽管严格控制偶联效率，但是由于延伸循环过程中的事件还产生肽类似物，所述延伸循环过程中的事件包括氨基酸插入、缺失、置换和提前终止，由此导致与目标肽合成物一起产生多种肽类似物。但是，当作为免疫诊断目的的抗体捕获抗原或作为接种目的的免疫原用于免疫学应用中时，肽制剂中的此类肽类似物仍然适于作为抗原性和免疫原性的贡献剂。典型地，有意设计的或通过合成方法作为副产物混合物产生的此类肽类似物通常与需要的肽的纯化制剂同样有效，只要开发出有判断力的QC方法来监测制备过程和产物评估过程，从而保证利用这些肽的最终产品的再现性和功效。
[0167]图4显示已经通过我们初始的研究和用于后续疫苗制剂应用的验证的所选的在PRRSV 2至ORF 7编码的蛋白(GP2，GP3，GP4，GP5，M和NC蛋白)上的B和T细胞表位的分布/定位。B细胞表位簇肽免疫原的设计目标是产生模拟所选的功能位点的抗原肽，其能够诱导中和抗体或参与PRRSV受体与靶细胞的结合。基于单个PRRSV毒株序列或作为用于病毒覆盖宽度的组合序列，如来源于数种PRRSV毒株序列,在受体结合/中和位点周围的四个氨基酸构架GP5.1,5.2,5.3和5.4上设计特异性的GP5 B细胞表位簇肽，如表4所示(SEQID Nos:9-14)，以检测其与天然PRRSV GP5蛋白抗原的相对免疫原性和交叉反应性。
[0168]基于PRRSVJXA1序列，在来自结构蛋白GP2至GP4的中和位点周围设计的另外的B细胞簇抗原肽具有这样的设计:GP2B表位(V111-L136)，GP3B表位(C57-C75)和GP4B表位(C52-C69)，其显示在表3中。GP2 B(V111_L136)作为线性肽(SEQ ID NO:6)存在，而GP3B表位(C57-C75)和GP4 B表位(C52-C69)作为环形肽(SEQ ID NOs:7和8)存在，从而允许对构象保持的局部限制。这些抗原肽还分别在GP5.1和GP5.2构架的C端(SEQ IDNos:29 和 30)或在 N 端(SEQ ID Nos:39-46)与人造组合 Th 肽(SEQ ID No:15)连接，如表5所示，以由于其长度短的性质来增强这些肽抗原的免疫原性。这些B细胞表位簇肽免疫原结合在疫苗制剂中，按照充分设计的流程免疫到豚鼠中或猪中，按时收集免疫血清用于广泛的血清学评估。这些免疫血清基于用于免疫原性的ELISAs进行检测，以检测其针对各种目标肽抗原的抗体滴度。
[0169]通过免疫荧光测定(IFA)检测针对PRRSV天然蛋白抗原的交叉反应性如实施例1所述进行。这是评估设计的肽免疫原用于最终疫苗制剂的适用性。对于合格作为肽免疫原的那些肽抗原，进一步设计具有来源于表3所示的起源PRRSV毒株(例如，MD001，JXALNA和EU毒株)的序列或共有(cons)序列的肽同源物，或具有表4关于SEQ ID Nos32, 33和34、来源于其的组合序列的肽同源物作为肽免疫原来允许在免疫的宿主中诱导抗体，以具有与不同毒株的PRRSV的广泛的交叉反应性。
[0170]关于T细胞表位簇肽免疫原的设计是简单得多的。选择基于其在从PRRSV-免疫的并后期攻击的猪获得的外周血单核细胞(PBMCs)培养物中诱导IFN-Y反应的能力充分表征的免疫显性T细胞表位结合在疫苗制剂中，以拓宽免疫的宿主中的细胞介导的免疫应答。基于PRRSV JXAl毒株来自GP4，GP5，M和NC蛋白的T细胞表位簇肽的序列和在各种PRRSV毒株(MD001，NA和EU)中的同源PRRSV T辅助细胞表位序列的比对在表6中显示为SEQ ID Nos:47-790为了提高这些相当疏水性的肽抗原的可溶性，对于其向每个T辅助细胞肽的N端添加三个赖氨酸残基(KKK)，以作用为肽免疫原。通过等比例混合所有鉴定的Th肽免疫原(SEQ ID Nos:47-79)制备这些T细胞簇肽的汇集物，作为疫苗制剂中的补充剂(T细胞表位汇集物I)，以进一步增强PRRSV B细胞簇肽免疫原的免疫原性，并且其自身作为PRRSV T细胞肽免疫原用以细胞介导的免疫性。
[0171]为了进一步拓宽对动物多样性遗传背景的T细胞表位覆盖性，对于每种T细胞表位基于四种同源性T表位序列制备针对特定表位的组合肽。类似地,在各个组合T表位簇肽免疫原(SEQ ID.NOs:80-90)的N端添加三个赖氨酸残基(KKK)，如表7所示。这些T表位簇组合肽免疫原的汇集物(汇集物2)用作疫苗制剂中的补充剂，以进一步增强PRRSV B细胞簇肽免疫原的免疫原性，并且其自身作为PRRSV T细胞肽免疫原用以细胞介导的免疫性。
[0172]实施例5
[0173]用包含来自GP5，2，3和4蛋白的PRRSV B表位簇肽抗原的疫苗制剂免疫豚鼠和猪，用于评估与天然PRRSV蛋白的免疫原性和交叉反应性
[0174]胞外结构域是膜蛋白延伸到细胞外空间(在细胞外的空间)的结构域。胞外结构域通常是病毒蛋白起始与靶细胞表面接触并且在感染过程中负责附着并进入细胞内的部分。由于中和抗体阻断病毒与其细胞受体的相互作用，所以，与病毒进入相关的结构域对于中和抗体的诱导是重要的。当开发下一代有效的PRRSV疫苗时，因此，重要的是评估PRRSV与病毒进入相关的结构域的功能性。巨噬细胞-特异性的凝集素唾液酸黏附素(CD163)是巨噬细胞上关键的病毒受体。使用可溶形式的唾液酸黏附素，已经发现PRRSV GP5和M复合物的二硫键连接的异二聚体是唾液酸黏附素的配体。这种配体-受体相互作用依赖于唾液酸黏附素的凝集素活性和GP5糖蛋白上的唾液酸。因此，研究PRRSV GP5蛋白的胞外结构域以及M对GP5免疫原性的影响来鉴定用于PRRSV标记疫苗制剂的最佳GP5肽免疫原，目的在于诱导阻断病毒M/GP5与宿主细胞受体唾液酸黏附素之间的相互作用的免疫性。
[0175]在PRRSV GP5蛋白的胞外结构域中的受体结合/中和位点周围设计多于45种肽抗原，并且分组成四个氨基酸序列构架，用于免疫原性评估。[0176]基于PRRSV毒株MD 001的序列，第一构架从GP5胞外结构域的C端残基“E”(谷氨酸)开始并且一直延伸到胞外结构域的N端，包括GP5蛋白信号序列中的五个另外的氨基酸残基，从而组成40mer肽抗原，如表4的GP5.1MD001 (A26-E65)肽抗原(SEQ ID No:29)所示。这种设计允许在GP5肽抗原的中间部分存在Cys残基，以在需要时，用于与M肽的胞外结构域形成二硫键。
[0177]第二结构域是GP5.1MD001 (A26-E65)肽抗原在N端延伸到信号序列中的五个另外的氨基酸残基，形成 45mer 肽GP5.2 MD001 (V21-E65) (SEQ ID No:30)，其中在 C24 与 C48 之间的分子内二硫键能够允许保持GP5胞外结构域的局部构象(regional conformation)。这种设计将允许在不存在M蛋白的条件下诱导针对GP5大部分胞外结构域的特异性抗体。
[0178]第三构架依据第二构架肽抗原GP5.2MD001 (V21-E65)建模，不同在于略去胞外结构域的 llmer GP5HV2 区域，从而产生 34mer 肽抗原 GP5.3 (V21-D54) (SEQ ID No:9)。这种设计将允许B细胞识别GP5胞外结构域的高度保守的中央区域。
[0179]第四构架(GP5.4)针对位于GP5胞外结构域中央的环状结构，基于PRRSV毒株MDOOI序列产生25mer的环状肽GP5.4 (C24-C48)。为了调和毒株与毒株间的变异，依照根据北美类型JXA1/MD001和JXAl/NJ-a的PRRSV毒株序列的第三和第四氨基酸构架的肽抗原建模的组合肽设计为 GP5.3JXA1/MD001 (V21-D54) (SEQ ID No:32)，GP5.3JXAI/NJ-a(V21-D54)(SEQ ID NO:33)和GP5.4 NJ-a/JXAl/MD001(C24-C48)(SEQ ID NO:34)。为了评估M蛋白胞外结构域对GP5胞外结构域(ectocdomain)肽免疫原性的影响,基于MD001序列设计(M1-Y26)具有下述序列的26mer胞外结构域肽:“MGSSLDDRCHDSTAPQKVLLAFSITY” (SEQ ID No:93)用于评估。
[0180]PRRSV的结构由与病毒RNA缔合的核壳蛋白组成。核蛋白被脂质包膜围绕，其中包埋六种结构蛋白:GP2，GP3，GP4，GP5和非糖基化的蛋白M和E (0RF2b)。GP5和M是包膜中最丰富的蛋白，而其他包膜蛋白以较低的量存在。GP5已经成为PRRSV保护性免疫性的主要靶标，然而，依据PRRSV的可变性以及最近的发现，即，GP2和GP3也在某种程度上参与临床和病毒学保护，而记录的与来源于GP2，GP3和GP4的抗原肽结合的多克隆抗体也表现出针对PRRSV的中和活性，还设计了选自GP2，GP3和GP4的肽抗原，对其进行筛选和鉴定，以结合在PRRSV疫苗制剂中。具体地，基于PRRSVJXAl毒株序列，设计表3所示的抗原肽GP2B表位(V111-L136) (SEQ ID No:10)，GP3B 表位(C57-C75) (SEQ ID No:11)，GP4B 表位(C52-C69)(SEQ ID No:12)用于免疫原性和交叉反应性评估。表3中还列出了来自不同PRRSV毒株的同源GP5，GP2，GP4和GP4来源的B表位序列作为肽抗原设计参照的实例。
[0181]这些来自GP5，GP2，GP3和GP4的B表位簇肽抗原还分别在GP5.1和GP5.2构架的 C 端(SEQ ID Nos:37 和 38)或在 N 端(SEQ ID Nos:39-46)与人工组合 Th 肽(SEQ IDNo:35)连接，如表5所示，以克服其长度短的性质而增强这些肽抗原的免疫原性。
[0182]疫苗制剂 [0183]在本发明的基于肽的PRRSV疫苗的示例性的应用中，具有包含表3-7中SEQ IDNos:9-90列出的受体结合/中和或T辅助细胞表位簇位点的肽作为免疫原的疫苗制剂，其不与外源Th表位的连接或通过氨基端或所极端与Lys-Lys-Lys- ε NLys (SEQ ID No:36)或ε NLys间隔区与外源T辅助细胞表位(如人工组合的Th序列UBITh ? 3 (SEQ ID No:35))连接，使用商购的油性疫苗递送载体Montanide ISA 50V2按照供应商推荐的方法配制成油包水乳液。Montanide? ISA 50V2 (Seppic, Paris France),是一种二缩甘露醇油酸酷和矿物油的油性的佐剂组合物，通常用于猪疫苗，将其用等体积的在PBS中的水相肽溶液乳化。按照特定的流程(例如，肽比例和在乳液中的总肽浓度)，将肽免疫原分别配制成约25至75ug/mL的溶液。将基于乳液的疫苗制剂以每位点0.25mL至0.5mL肌内注射到豚鼠中或以每位点ImL注射到小猪中，除非另外具体指明。
[0184]用设计的肽疫苗制剂免疫豚鼠和小猪
[0185]对于在豚鼠中进行的免疫原性研究，使用成年成熟的且首次用于实验的雄性和雌性Duncan-Hartley豚鼠(300_350g/BW)每组3只。动物在O和3wpi用特定的疫苗制剂肌内(頂)免疫2个剂量。在免疫之前，疫苗制剂应该在室温放置约30分钟，并且涡旋约10至15秒。在初次免疫后0，3和5周(wpi)采集血液获得血清样品。这些样品通过基于目标肽的ELISAs进行检测，检测直接的结合滴度，以及通过基于PRRSV共转染的细胞的IFA进行检测，检测交叉反应性滴度，如实施例1和2所述，以进行所述肽免疫原和疫苗制剂的免疫原性评估。
[0186]将来自无特异性病原体(SPF)的农场的约4周龄的小猪在耳部标记进行免疫原性研究，并且按照研究流程分组(3-5头小猪/组)。在第O和4周，这些组通过肌内用疫苗组合物免疫。在一个研究中，利用来自具有先前的PRRSV感染的常规农场的小猪来评估在存在抗PRRSV抗体的条件下设计的PRRSV肽抗原的独立的免疫原性，评估通过使用诊断性ELISA检测的组合进行，以区分感染的猪和接种了本发明的标记疫苗制剂的猪，并且还检测猪对所述PRRSV标记疫苗制剂的反应。
[0187]在第一次免疫时，在3-4周第一次加强时，以及在加强后两周即在5-6周时采集血液样品，制备血清样品并且进行多重血清学测试，以评估免疫原性和交叉反应性，如实施例1和2详细所述。
[0188]由PRRSV GP5蛋白胞外结构域序列设计的肽免疫原的优化和排序
[0189]在所制备的多种GP5胞外结构域肽免疫原中，将它们中的九种配制成乳液制剂，以在致敏和加强免疫时间表后示例并排序其相对免疫原性。从表8可以看出，基于PRRSVMDOOl序列的肽免疫原4020Kc(SEQ ID No:38)的免疫原性比肽免疫原4020 Kb (SEQ IDNo:37)的强，二者均基于目标肽ELISA( > I 1glO)和IFA滴度。因此，氨基酸序列构架
2(GP5.2)设计优于构架I (GP5.1)。肽免疫原4020Kc用在大部分通过PRRSV MDOOl进行的PRRSV攻击研究中，如在实施例6中详细所述。如表8所示，发现按照构架3 (GP5.3)设计的具有来源于PRRSV MD001的序列的肽免疫原4048Kb (SEQ ID No:39)具有大致与肽4020Kc相同的免疫原性，然而，其IFA滴度高于肽免疫原4020Kc的滴度。当与肽免疫原4048Kb比较时，使用基于第三构架(GP5.3)设计的另一种肽免疫原4050Kb (SEQ ID No:40)发现如通过ELISA和IFA 二者证明的相似的免疫原性。因此，认为构架3是关于GP5B细胞表位簇抗原呈递的更有利的设计。
[0190]为了拓宽病毒毒株的覆盖性，我们因此基于氨基酸序列构架3，如肽免疫原4052Kb (SEQ ID No:41)和肽4124Kb (SEQ ID No:42)，继续设计一些相关的组合抗原，以检测与单一序列GP5肽4048a(SEQ ID No:9)和4050a(SEQ ID No:31)比较的抗体应答性的宽度。对于来源于用肽4052Kb免疫的免疫血清，发现与MD001和JXAl来源的GP5.3的构架序列的双重反应性，因此证实覆盖MD001与JXAl 二者的宽度。设计GP5.3肽抗原4124a(SEQID No:30)和4124Kb (SEQ ID No:42)来进一步扩展所述肽免疫原的组合性质，并且比较其各自的免疫原性。如表8所示，与肽抗原4124a相比，对肽4124Kb发现免疫原性的显著增强，如通过ELI SA和IFA 二者所示，这表明与肽抗原4124a连接时人工组合Th表位(SEQ IDNo:35)的免疫原性增强作用。减少在N端和C端两端的氨基酸以保持GP5的环化结构已经形成肽抗原4094a (SEQ ID No:35)的设计及其免疫原性更强的形式肽抗原4094Kb (SEQ IDNo:43)的设计。两种肽抗原在这样的序列调整后都表现出减少的免疫原性，因此人工构建的环结构(C24-C48)保留GP5胞外结构域的关键部分，并且通过从N端和C端两端延伸到肽抗原4124a和4124Kb结构，可以最理想地建立由此增强的免疫原性。
[0191]在所有的评估中，在C端连接人工组合Th肽(SEQ ID No:35)，如在肽抗原4020b和4020c的情形中所示，形成4020Kb和4020Kc，或在N端连接人工组合Th肽(SEQ ID No:35)，如4124a，形成4124Kb，均促使各种肽抗原变成更好的肽免疫原。将肽4094和4124系列的肽抗原制成乳液疫苗制剂，用于进行通过PRRSVJXA1毒株的基于PRRSV GP5的攻击研究，如实施例7中所述，使用肽免疫原4124Kb证明甚至使用该乳液的单次施用(组5)也能成功地完全保护(20/20 = 100%)首次用于实验的小猪免受高度致病性PRRSVJXAl毒株的感染，而肽免疫原4094系列在两次剂量的免疫后发挥亚最佳的保护作用(4/5 = 80% )0_2] PRRSV胞外结构域M肽对GP5B表位簇肽抗原免疫原性的影响
[0193]GP5和M是PRRSV包膜中最丰富的蛋白，并且这两种蛋白在其胞外结构域形成二硫键连接的异二聚体，以作用为在巨噬细胞的细胞表面上的唾液酸黏附素受体(⑶163)的配体。制备全长M胞外结构域肽抗原(长度为26mer)，并且以1:1和1: 10的比例与全长GP5胞外结构域肽免疫原4020Kb或4020Kc混合，以评估该胞外结构域M肽对两种GP5胞外结构域肽抗原4020Kb和4020Kc的免疫原性的影响。
[0194]如表9所示，发现当以等比例与GP5肽免疫原4020Kb和4020Kc混合时，该26mer胞外结构域M肽令人惊讶地是免疫原性的，其中M针对GP5肽免疫原4020Kb和4020Kc的相对免疫原性分别排序为约1000-和100-倍，如果通过基于肽的ELISA测量的(比较组I和2 ；比较组3、4和5)。关于GP5肽免疫原4020Kc的IFA滴度也以剂量依赖性方式被显著抑制(比较组3、4和5)。由于配体-受体相互作用依赖于巨噬细胞上唾液酸黏附素的凝集素活性和在GP5糖蛋白上的唾液酸，因此，重要的是保持GP5的免疫原性，以允许诱导与PRRSV包膜中的这种主要蛋白结合的抗体。因此，尽管提示M肽与包膜上的GP5共价连接因此形成作为配体的GP5/M复合物的一部分，在我们随后的PRRSV疫苗设计中在基于B细胞表位簇肽抗原的成分中被省略掉。
_5] PRRSV Th汇集物的不同剂暈对PRRSV GP5B细胞表位簇肽抗原的IFA滴度的影响
[0196]代表GP5胞外结构域的中央环化结构(C24-C48)的GP5肽抗原4094a具有亚最佳免疫原性，其被用于该小猪中的研究，以研究不同剂量的PRRSV Th肽对B细胞表位簇肽抗原免疫原性的影响。等比例的PRRSVTh表位簇肽的混合物进一步补充有5%，10%，20%至50%的4094a肽抗原(SEQ ID No:31)。将包含B细胞表位簇抗原肽和T细胞表位簇肽抗原二者的疫苗制剂通过具有致敏和加强方案的标准免疫流程以30ug/mL亚最佳剂量给予小猪，以监测所述PRRSV Th表位对肽抗原4094a免疫原性的影响(组I至组4)。尽管对于这些监测的组，通过ELISA测量的免疫原性没有显著变化，但是IFA滴度证实在这些小猪中诱导的针对天然PRRSV GP5蛋白的抗-肽抗体的交叉反应性以剂量依赖性方式提高。为进行比较，还表明具有共价连接到4094a (序列ID No31)上的组合Th表位的GP5B细胞表位簇肽免疫原4094Kb (SEQ ID No:43)(组5)相对于单独的肽抗原4094a具有提高的免疫原性。这些短的PRRSV Th肽(SEQ ID Nos:47-79)，已知在将免疫的宿主致敏后当暴露于PRRSV时其通过回忆应答建立针对PRRSV的细胞介导的免疫性，所述肽不与B细胞表位簇肽抗原共价连接。由提高的IFA滴度显示的抗体应答性质量改善指示所述T细胞介导的免疫应答的益处。为了建立宽泛基础的细胞介导的免疫性，包括在暴露于PRRSV时产生针对PRRSV的细胞因子，在所有后续的攻击研究中，这些仔细选择的PRRSV Th肽与PRRSV B细胞表位簇肽免疫原一起以20% (w/w)包含在所述疫苗制剂中。
[0197]在抗原位点周围鉴定和设计具有中和活性的高度免疫原性的GP2、GP3和GP4B细胞簇肽
[0198]根据最近的发现，即，与来源于GP2、GP3和GP4蛋白的抗原肽结合的多克隆抗体还表现出针对PRRSV的中和活性，并且这些PRRSV包膜的次要蛋白也在某种程度上参与抵抗PRRSV的临床和病毒学保护，基于PRRSVJXA1毒株序列设计特异性的抗原肽GP2 B表位(V111-L136) (SEQ ID No:6) ,GP3 B表位(C57-C75) (SEQ ID No:11) ,GP4 B表位(C52-C69)(SEQ ID No:12)，如表3所示，并且鉴定为候选肽抗原用于免疫原性和交叉反应性评估。这些B表位簇肽抗原分别在N端连接人工组合Th肽(SEQ ID No:35)，成为GP2、3和4B细胞表位簇抗原肽(SEQ ID Nos.44-46),用于在豚鼠中进行的免疫原性评估。
[0199]包含在抗原位点周围的单独、特异性设计的具有中和活性的GP2、GP3和GP4 B细胞簇肽的疫苗制剂，连接人工组合Th序列或不连接人工组合Th序列，在豚鼠中进行检测，以评估其各自的免疫原性。在多种设计的肽免疫原中，三种在N端连接人工组合Th肽的肽(SEQ ID Nos:44,45和46)甚至在以30ug的剂量单次施用时表现出令人惊讶地高免疫原性，如表11所示。因此，这些高度免疫原性的肽是结合在最终PRRSV疫苗制剂中的突出的候选物。
[0200]在豚鼠中关于组合的GP2、GP3、GP4和GP5表位簇肽免疫原的免疫原性评估
[0201]在精细化关于来源自PRRSV GP2，3，4和5蛋白的每种B细胞表位簇肽抗原的设计后，在基于标准乳液的疫苗制剂中以相等的比例混合的这些肽的组合，以30ug/mL的总肽浓度进行初次致敏，在3 wpi以15ug/mL进行随后的加强，检测当与其他肽抗原混合时每种肽抗原的免疫原性，并且还评估肽抗原混合物的整体免疫原性，从而评估和避免对所述混合物中一种或多种抗原的免疫原性的任何不需要的抑制作用。进行这样的评估以避免M肽对GP5/M肽抗原混合物的负影响。
[0202]如表12所示，当GP4 B表位簇肽抗原(SEQ ID No:46)与GP3 B表位簇肽抗原(SEQ ID No:45)混合成为 GP3/4 组合制剂(combo formulation)，与 GP3 (SEQ ID No:45)和 GP 5 (SEQ ID No:42)组成成为 GP3/4/5 组合制剂，或与 GP2 (SEQ ID No:44)和 GP3 (SEQID No:45)组合成为GP2/3/4组合制剂时，通过基于目标肽的ELISA判断的GP4肽抗原的免疫原性在与GP3靶标肽混合时保持为强的，但是当以三肽抗原混合物存在时，被显著减弱。当与GP4肽抗原比较时，GP2和GP3表位簇肽抗原的免疫原性保持与单肽抗原一样免疫原性。因此，GP2和GP3表位簇肽抗原可以更稳健地用在任何PRRSV肽抗原混合物中，以增强免疫应答覆盖的宽度。尽管事实上GP2、GP3和GP4是病毒包膜上的次要成分，但是，在不存在GP5抗原肽的条件下(例如，组1、2和4)，通过肽抗原混合物获得合理的IFA滴度，这表明与相对应的天然PRRSV蛋白抗原的交叉反应性。
[0203]实施例6
[0204]补充有PRRSV Th表位簇肽抗原的基于GP5来源的肽的PRRSV疫苗保护小猪免受PRRSV MD001毒株的攻击
[0205]为了证明PRRSV GP5 B细胞表位簇肽抗原保护猪免于PRRSV感染的功效，由台湾的动物技术研究所(Animal Technology Institute, Taiwan(ATIT))进行三次连续的免疫和攻击研究。为了客观地评价由PRRSV GP5B表位簇肽抗原制备的疫苗制剂，将所有的制剂编码。对SPF猪进行规律性检测，以确保没有病原体，包括猪瘟(ClassicalSwine Fever)、假性狂犬病 (Pseudorabies)、萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、口蹄疫(Foot and Mouth Disease)、猪痢疾(Swine Dysentery)、挤疮(Scabies)和胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。所有来自PRRS1001S、1002S和1003S研究的组使用GP5B表位簇肽免疫原4020Kc(SEQ ID No:38)和4052Kb (SEQ ID No:41)，并且在一些制剂参数中具有较少的变化。对于组I和2的来源于4020Kc抗原肽的疫苗制剂，以及组3和4的来源于4052Kb抗原肽的疫苗制剂，认为这些制剂是等价的。在各种疫苗制剂中以10重量％补充汇集的等比例的 PRRSV Th 表位肽混合物(SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，基于JXAl序列)，以进一步增强免疫原性，通过提供细胞介导的免疫性，增强PRRSV GP5肽抗原的免疫原性。
[0206]为了不污染转基因SPF农场，在两位位点进行研究，仅免疫部分在转基因SPF农场进行，该农场提供四周龄的SPF猪进入这些免疫/攻击研究。该农场由ATIT掌管，并且位于台湾北部新竹香山的隔离地区。在完成4周的致敏和加强免疫流程后，将SPF猪转移到台湾南部的另一个良好控制的农场，用于攻击研究。由于在台湾流行美洲PRRSV毒株，因此，在这些攻击研究中采用两株美洲毒株，即MD-001和AMERVAC-PRRS。病毒攻击后，采集血清样品进行IFA和病毒血症检测。最后，将动物麻醉并进行总体检查和病理学检查。基于研究设计将SPF小猪分组，每组5只动物。如表13所示采集血液样品。通过PRRSV-0RF5IFA检测(通过rVV-PRRS 0RF5表达方法)检测采集的所有血清样品。[0207]注射后的临床观察
[0208]在每次疫苗施用之前和之后，所有小猪进行临床观察以观察局部反应(包括部位反应发生和过敏反应)和系统反应(包括呼吸困难、食欲、腹泻、咳嗽、CNS/SS和过敏反应)。在研究过程中，发现与肿胀相关的偶然的局部部位反应发生，其持续不超过3-4天，并且恢复至正常情形，没有观察到进一步的不同。对由研究的所有动物没有观察到系统的不利反应。
[0209]病毒攻击后的临床观察
[0210]在接受病毒攻击后监测的期间过程中，所有免疫的猪没有表现出PRRS典型的临床迹象。
[0211]在免疫和攻击后的IFA检测和 肺损伤
[0212]在免疫后产生特异性针对PRRSV的抗体，并且通过IFA检测在4和6 wpi (免疫后的周数)达到高滴度，如表14所示。如表14所示，甚至在PRRSV攻击研究后，对照组中也没有一只动物诱导针对PRRSV GP5蛋白的抗体，主要是由于当存在于攻击病毒储液中时PRRSVGP5蛋白的弱免疫原性性质。在病毒攻击后在2 wpc (攻击后的周数)，接种的组保持高IFA滴度。在20头用PRRSV GP 5B表位簇肽抗原疫苗制剂(4020KC用于组I和2，4052Kb用于组3和4)免疫的小猪中，有18头被完全保护(保护率为90% )，没有检测到任何损伤。在组3和4中的小猪中有两头检测到轻微的损伤。相比之下，发现80% (4/5)的猪具有严重的间质性肺炎损伤，如图7A和7B所示。基于在ATIT的PRRSV实验室中进行的广泛的攻击检测，较高的关于PRRSV GP5蛋白的IFA滴度与抵抗PRRSV攻击的完全保护作用充分相关。
[0213]病毒血症检测
[0214]使用关于PRRSV病毒负荷检测的PR-PCR方法，在所有接种的猪中没有发现可检测到的病毒负荷。这表示于肺中的保护功效结果的一致性。尽管这两种病毒毒株在感染后不引起严重的症状，但是，在18/20的接种的猪中缺乏病毒血症和完全缺乏病理学结果证实了已证明的观点:通过基于PRRSV GP5肽的疫苗制剂提供阳性保护功效。
[0215]实施例7
[0216]补充有PRRSV Th表位簇肽抗原的基于GP5来源的肽的PRRSV疫苗在单次和致敏-与-加强免疫方案后保护小猪免受高致病性PRRSV (NVDC-JXAl毒株)的攻击
[0217]中国PRRSVTXAl攻击樽型的背景:
[0218]2006年，在中国爆发了空前大规模的初始未知的但是所谓的“高热”疾病，其具有PRRS的性质，其扩散到超过10个省(直辖市或自治区)并且感染了超过2，000，000头猪，致死病例大约有400，000例。与典型性PRRS不相似，很多成年母猪也感染了这种“高热”疾病。这种非典型的PRRS流行病最初鉴定为猪霍乱样疾病(hog cholera-like disease),表现为神经症状(例如，颤抖)，高热(40-42°C ),热烫皮疫红斑(erythematous blanching rash)等等。与免疫性分子组合的尸体解剖清楚地表明多个器官感染了高度致病性的PRRSVs，观察到严重的病理学变化。在 Kegong Tian 等(2007PLos0ne do1: 10.1371/journal,pone.0000526)关于致死性PRRSV变体的出现:非典型PRRS在中国的空前爆发以及特有的标志的分子剖析(Emergence of Fatal PRRSV Variants:Unparalleled Outbreaks ofAtypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark)的共同努力下，在中国建立了猪感染模型，用来用三株不同来源PRRSV的代表性PRRSV分离株攻击12头SPF-猪(4头小猪/组)再现分离的PRRSV的高致病性。
[0219]每组中，两头小猪静脉内注射，并且二者都在6-8周内死亡，暗示所检测的PRRSV毒株的毒力高。类似地，每组中另外两头小猪鼻内接种，并且它们在3-6天内发展了显著的“高热”疾病迹象(例如，高热、血斑、瘀点(petechiae)、颤抖和lamping等)，并且都在感染后第10天死亡。随后，从感染的猪成功回收病毒分离株并且通过PCR检测和EM验证。进行尸体解剖来评价免疫学作用和病理性损伤。观察到与在“高热”流行病期间致死的猪中几乎相同的病理学变化(在肺、心脏、脑、肾、肝中等等)，因此证实2006年中国“高热”疾病的爆发是由猪群体中的高度致病性的PRRSV感染引起的。一种PRRSV分离株，即JXA1，现在在标准化攻击研究中用作标准病毒，以按照PRC指南验证PRRSV疫苗在小猪中的保护功效。
[0220]按照PRC政府疫苗产品指南的有效的PRRSV攻击和疫苗功效的定义
[0221]四周龄的小猪用基于肽的PRSRV疫苗制剂接种一次或以2周的时间间隔接种两次，而一组保持为不接种的对照。所有的小猪在耳后用3mL PRRSVNVDC-JXA1高度致病性病毒(包含10E5 TCID50)肌内攻击。每日观察体温持续21天。当攻击后5/5动物发病发热并且至少2/5死亡时，认为攻击是有效的。对于认为有保护性的疫苗，需要免疫的猪至少有4/5保持健康。 [0222]UBI与中国南京动物保健疫苗公司2011年合作进行的攻击研究总结报告:
[0223]总共筛查35头猪为血清阴性的，选择其中的30头用于如上述按照由中国农业部颁发的指南进行本攻击研究。详细的动物选择、随机化、分组、免疫和攻击研究、温度观察和记录以及死亡率描述如下:
[0224]选择来自中国江苏省无锡农场的28日龄的健康小猪。在南京基础动物保健疫苗公司的疫苗功效/病毒攻击检测中心进行该试验。使用PRRS抗体检测试剂盒(LSI公司，法国)，lot#:2-VERPRA-001, Exp.2012-01 和 PRRS 抗原检测试剂盒:PRRS RT-PCR 体外诊断试剂盒(NSP21594-1680变异毒株)来检测不含PRRSV的动物。使用PRRS强毒毒株(NV⑶-JXA1)进行攻击检测，通过制备储液的10倍稀释液并且以每只动物3ml施用给动物而进行检测。
[0225]从该农场总共选择35头健康小猪用于筛选，并且30头纳入本研究。所有选择的小猪在血清中检测为PRRS抗原和抗体阴性。将所有纳入研究的小猪随机分成6组，即，组1-6;每组5只动物。在猪颈部肌肉上直接位于耳后的位点进行肌内注射。免疫剂量和分组列在表15中(按照编号进行，从而是客观的)。
[0226]组I用补充有20重量％的等比例PRRSV内源性T辅助细胞表位肽(SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，基于 JXAl 序列)汇集物的基于 PRRSV GP5 肽(GP5B表位簇肽抗原4094系列，SEQ ID No:43)的疫苗免疫。
[0227]对于组2-5，PRRSV GP5肽(GP5B表位簇肽抗原4124，SEQ ID No:42)用作免疫原。疫苗制剂中的最终肽浓度为30ug/mL。该制剂还包括等比例混合的PRRSV内源性T辅助细胞表位肽(SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，基于 JXAl 序列)的汇集物，并且对于组2、3和4，分别以10重量％ (即，27.5ug B:2.5ug T汇集物)，20重量％ (即，25ug B:5ug T汇集物)和50重量％ (即，20ug B:1Oug T汇集物)补充PRRSV B表位免疫原(SEQ ID No:42)。组5中的动物接受与组4相同的疫苗制剂，不同之处在于仅给予单次施用。[0228]组6是不用任何肽免疫的阴性对照组。
[0229]关于最初纳入研究的所有30头小猪的抗体筛查结果显示在表16中。在免疫之前通过RT-PCR检测所有来自猪的样品的PRRSV抗原的结果表明30头中有30头是阴性的，而检测试剂盒的阳性对照发现185碱基对的扩增条带，这验证了检测系统。随机化后的所有动物编号显示在表17中。在表18中显示初次免疫后第O天和第28天的PRRSV抗体OD值的结果。观察PRRSVJXA1攻击后的体温和死亡率，温度(单位为C)显示在表19中。
[0230]总之，在病毒攻击后的最初几天内，对照组(组6)中所有小猪发病，如表19所示，两头死亡(2/5 = 40%的死亡率)，如表20所示。在攻击研究中没有接受接种的对照组的结果满足中国农业部制定的攻击研究的有效性标准和指南。与对照组相比，组I的动物得到保护，存活率为80% (4/5动物)，死亡率仅为20%。此外，组2-5中所有的动物(20/20)得到保护，因此产生100%的保护作用。
[0231]当组合所有25只接受基于GP5B表位簇肽抗原的疫苗制剂的动物作为一个主要的研究时(即，组1-5)，25只动物中有24只在高度致病性PRRSV病毒毒株JXAl攻击后存活下来，死亡率仅为4%。与对照组相比，该结果是令人惊讶的，在对照组中，攻击后所有五头小猪发病，导致100 %的发病率，40 %的猪在早期时日死亡。
[0232]实施例8
[0233]多成分PRRSV肽疫苗诱导针对PRRSV的广泛保护性的抗体
[0234]PRRSV在病毒体包膜上包含主要糖蛋白GP5，以及其他次要的糖蛋白，即GP2a、GP3和GP4，所有这些是产生感染性病毒体所必需的。发现在GP4与GP5蛋白之间存在强相互作用，而在其他次要的包 膜糖蛋白(GP2和GP3)与GP5之间也已经检测到弱的相互作用，这导致行程多蛋白复合物。总体而言，推论GP4蛋白对于调控糖蛋白间相互作用是至关重要的，并且，除GP5之外，还与GP2a —起作为病毒粘附蛋白，其负责调控与⑶163的相互作用，用于病毒进入易受影响的宿主细胞中。
[0235]由于PRRSV的高度变异性，开发广泛有效的PRRSV疫苗需要保护多种病毒毒株。已经证实的四种补充有内源性PRRSV Th肽(对于汇集物I，为基于JXAl序列的SEQ ID Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74，76，对于汇集物 2，为 SEQ ID Nos:80-90)的基于 GP5的PRRSV疫苗制剂(SEQ ID No:38的GP5B表位肽抗原4020Kc，SEQ ID No:41的肽抗原4052Kb, SEQ ID No:43 的 4094Kb 和 SEQ ID No:42 的 4124Kb)的保护性功效作为 PRRSV 标记疫苗成分的基石，高度理想地在肽混合物中结合代表证实的功能性中和/受体结合位点的抗原肽，以在多蛋白受体复合物中诱导多克隆抗体，从而允许开发具有宽泛的病毒覆盖性的有力的多成分PRRSV疫苗。
[0236]使用表现出针对PRRSV的显著中和特性的GP2、GP3和GP4抗原肽结合抗体⑶，设计在这些选择区域周围的肽抗原，并且如实施例5所示，从每种蛋白中筛选最有力的肽免疫原。这些肽免疫原引入到多种制剂中作为多成分PRRSV肽疫苗，目的在于宽泛的病毒毒株覆盖性。利用精细的分析LC/MS/MS工具的可用性和充分控制的GMP肽制备方法，可以合理地开发定制为区域性应用的(例如，北美vs.欧洲)能繁殖的疫苗制剂。
[0237]实施例9
[0238]UBI DIVA系统和基于表位的标记疫苗用于鉴定感染PRRSV的动物、接种的但不含PRRSV的动物或接种的且感染PRRSV的动物的应用[0239]如实施例1中所示，通过组合两种来自PRRSV核壳蛋白的抗原肽(4171e，SEQ IDNo:1和4172e，SEQ ID No:2)作为用于平板包被的混合物，然后使用蛋白-HR缀合物作为追踪剂，建立UBI PRRSV NC ELISA检测试剂盒，用来检测感染PRRSV的动物。该测试可以与定制用于监测有效的PRRSV标记肽疫苗的免疫原性的基于目标肽的ELISAs联合使用，形成PRRSV DIVA系统，用来区分感染的和接种的动物。
[0240]如在图5中所示，使用UBI PRRSV NC ELISA监测，来自在进入PRRSV疫苗免疫原性研究之前通过之前的筛查已知是PRRSV阴性的正常的小猪(η = 109)的血清表现出高特异性(109-1/109 = 99% )0次于该组，来自已知具有针对GP5的高滴度抗体(如果通过基于目标肽的ELISA所显示(LoglO滴度> =3))与针对天然PRRSV GP5蛋白的交叉反应性的接受PRRSV GP5标记疫苗制剂的猪的血清(η = 45)通过PRRSV NC ELISA测试评分为阴性，更进一步证明了该检测的特异性。关于在中间显示的三个血清组的ELISA读数是来自获自感染的动物的血统IFA阳性血清。这些动物表现出与IFA滴度平行的增加的ELSIA0D450nm读数。来自远右侧的血清是从已知具有PRRSV感染的美国农场采集的样品(η =100)。使用UBI PRRSV NC ELISA发现血清阳性率> 56%，这指示在该农场中PRRSV是高度流行的。
[0241]当在已知具有PRRSV感染的台湾农场中，UBI PRRSV NC ELISA和UBI基于PRRSVB表位标记疫苗目标肽的ELISAs联合用于监测PRRSV标记疫苗制剂的免疫原性时，获得一些深刻的信息。
[0242]第一，如图6Α和6Β所示，使用PRRSV NS ELISA发现所有纳入PRRSV疫苗免疫原性研究的猪都是阳性的，s/c比率远远高于截点值。由于所有检测的动物都被感染了，所以，这样的感染在图中以灰色背 景突出显示。第二，尽管在这些小猪中存在高水平的PRRSV NC反应性抗体，主要是母体来源的(MDA)，但是，所有基于肽的PRRSV疫苗制剂表现出显著的免疫原性，如通过基于各种目标肽的ELISAs所检测的。如在图6A和6B中所示，其中监测每只动物针对包含在疫苗制剂中的成分肽抗原的肽特异性抗体滴度，所述疫苗制剂在初次免疫后的0、4和6周接受。在所述疫苗制剂(GP2+GP3，GP3，GP3+GP4, GP4或GP5肽抗原)中，每种每剂量总共包含30ug/mL，使用致敏和在O与4周的加强的方案，发现独立的且高的免疫原性与几乎所有来源于PRRSV GP2和GP3中和位点的肽疫苗制剂相关，其次是“仅有GP5肽”的疫苗制剂，GP4中和位点来源的肽抗原在与其他PRRSV (GP3)肽抗原组合时表现出略微削弱的免疫原性。
[0243]基于组合肽的PRRSV疫苗结合在来自GP2，GP3，GP4和GP5蛋白的中和与受体结合位点周围设计的PRRSV B表位簇肽免疫原(用于诱导中和抗体)，补充有内源性PRRSV T辅助细胞肽的混合物(用于促进细胞介导的免疫性)，该疫苗计划用于PRRSVMD001和JXAl毒株(二者均为北美类型)的攻击研究。
[0244]实施例10
[0245]采用UBI的基于PRRSV肽的标记疫苗及其诊断性DIVA系统来根除SPF农场中的PRRSV感染
[0246]由于用于标记疫苗制剂的PRRSV B表位簇肽抗原不包含来自PRRSV核壳蛋白的抗原肽，而感染的猪典型地在早期发展针对该主要结构蛋白的抗体，所以，在用于区分感染的动物与接种的动物的诊断系统中结合PRRSV NC ELISA和基于PRRSV B表位标记疫苗目标肽的ELISAs是合理的，由此形成诊断性DIVA系统。
[0247]UBI的基于PRRSV肽的标记疫苗能够诱导高滴度的IFA阳性针对PRRSV蛋白上的中和与受体结合位点的交叉反应性抗体。所述标记疫苗制剂能够比基于MLV或病毒裂解物的PRRSV疫苗更有效地预防PRRSV感染，原因在于这些蛋白当以其目前的生物学疫苗形式存在时的免疫原性性质非常弱。
[0248]UBI的诊断性DIVA系统与其PRRSV标记疫苗的组合应用将在台湾的SPF农场基于下述策略实施，以去除该农场长期的PRRSV感染问题。该SPF农场一直保持对所有病原体的严格的监测记录，并且其仅具有PRRSV感染。该农场不能在不招致显著的生物安全性风险的前提下通过常规的生物学疫苗根除其当前的PRRSV感染。使用UBI的基于PRRSV肽的标记疫苗由于该疫苗的化学性质将不存在任何此类生物安全性危险。
[0249]在感染PRRSV的SPF农场中根除PRRSV的策略
[0250]该农场保持使用UBI的基于PRRSV肽的标记疫苗的接种程序至少两年。使用0、4和8周的接种方案对该农场中所有的猪进行接种，并且监测至少六个月。通过包括PRRSV NCELISA、IFA和定量PCR(qPCR)的测定与PRRSV病毒血症水平一起监测针对NC和标记疫苗目标肽的血清抗体滴度。在进入接种程序六个月后，由接种的母亲生出的小猪将不接受接种，并且通过UBI PRRSV NC监测1-3个月，监测这些小猪中的感染率。当用UBI PRRSV NCELISA证明所有小猪是阴性反应性的时，可以认为该农场处于针对PRRSV感染的控制中。然后该农场将淘汰所有之前感染过PRRSV的猪。直到这样的淘汰之前，该农场中所有的猪将持续用基于PRRSV肽的标记疫苗进行接种。
[0251]该农场将持续用基于PRRSV肽的标记疫苗对所有的猪进行接种，以增强这些猪针对PRRSV的免疫原性。
[0252]当使用PRRSV NC ELISA，基于其血清阴性反应性发现新繁殖的小猪和大母猪是不含PRRSV的时，可以宣布该农场是不含PRRSV的，因此该PRRSV根除计划成功了。
[0253]用于监测的指示剂:
[0254]UBI的PRRSV NC ELISA和基于PRRSV标记疫苗目标肽的ELISAs，由此的DIVA可以用来监测农场中所有动物的血清的反应性一致性。在接种和监测过程中记录来自PRRSVNC ELISA的阳性率百分数和平均OD值。
[0255]少于一月龄的小猪可能具有针对PRRSV NC蛋白的母体抗体，因此对PRRSV NCELISA表现为阳性的，其将随着时间过去而减少。当在环境中没有PRRSV传播时，即，没有新的感染，这些小猪也将成为不含PRRSV的。该农场将加快淘汰感染PRRSV的大母猪。用PRRSV标记肽疫苗处理将进一步减少PRRSV由之前感染的大母猪释放到环境中的残余的危险，因此允许整个农场达到不含PRRSV的状态。表21设定了对于所述检测在95%的置信水平检测一头PRRSV阳性猪的可能性的样品大小要求。
[0256]使用DIVA和多成分基于PRRSV肽免疫原的疫苗制剂进行的试验性PRRSV清除研究
[0257]在常规感染PRRSV的农场中使用基于油包水(ISA50)乳液的包含多成分PRRSV肽免疫原的疫苗制剂进行试验性PRRSV清除研究，研究通过经由DIVA的血清学方式进行监测，以评估这些接受了所述多成分的基于PRRSV肽免疫原的疫苗制剂的动物针对PRRSV NC抗体血清转阴的潜力。[0258]更具体地，通过PRRSV NC ELISA检测为阳性的总共15头四周龄的小猪分成五个实验组进行研究。所述小猪基于0，4，8周免疫和采血时间计划进行免疫，并且从初次免疫那天其监测为期 13 周的时间。来自 GP5 (SEQ ID No:42)，GP2 (SEQ ID No:44)，GP3 (SEQID No:45)和GP4(SEQ ID No:46)的PRRSV B肽免疫原以各组组.合(例如，对于组I和2，GP5, GP2, GP3和GP4 ;对于组3，GP5, GP3和GP4 ;对于组4，GP3和GP4)等比例混合，对于PRRSV B肽免疫原每剂量共25ug/mL。该制剂进一步补充有20重量％ (即每剂量5ug/mL)的 PRRSV Th 肽(也是以等比例混合的 SEQ ID.Nos:47，51，52，55，59，61，63，67，70，74和76)(对于组2)，以及PRRSV Th组合肽(SEQ ID NOs:80-90)(对于组1、2和3)。通过PRRSV NC ELISA监测针对NC的血清抗体应答性，从而确定PRRSV感染，而通过相对应的基于PRRSV GP2，GP3，GP4和GP5肽的ELISAs监测针对PRRSV标记肽疫苗B表位成分的血清抗体滴度，以确定由各种疫苗制剂提供的免疫原性。组5中的动物不接受基于PRRSV肽的疫苗制剂，并且作为阴性对照组。
[0259]组1-4的所有猪产生了针对其各自的标记疫苗目标PRRSV B GP2，GP3，GP4和GP5肽的抗体，如通过基于各种PRRSV肽的ELISAs所检测到的，在初次免疫后4周的第二次免疫后，特异性抗体滴度高于3LoglO，并且在所监测的整个13周期间保持为高的。然而，针对PRRSV NC蛋白的抗体应答性在初次免疫后约6-8周增加至峰值反应性，然后到初次免疫后10周时下降至基线附近，并且在监测期间在初次免疫后13周保持在基线，如表22所示。
[0260]相比之下，来自没有接受包含基于PRRSV肽的免疫原的疫苗制剂的组5动物的血清均保持与PRRSV NC的高反应性。由于已知在感染的猪种存在针对PRRSV NC蛋白的抗体，在用多成分的基于PRRSV肽免疫原的疫苗制剂接种的猪中关于PRRSV NC的这样的血清转阴的令人惊讶的发现进一步验证了所述多成分的基于PRRSV肽的疫苗制剂的功效。因此，DIVA和多成分的基于PRRSV肽免疫原的疫苗制剂的应用具有宽泛的应用，并且满足监测、预防、清除和根除PRRSV感 染的紧急需求。
[0261]
【权利要求】
1.猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗组合物，其包含肽抗原和兽医学可接受的递送载体或佐剂，其中所述肽抗原包含选自由下列各项组成的组的氨基酸序列: a)SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO: 12，及其任意组合； b)(a)的同源物；和 c)(a)或(b)的任意组合。
2.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:9的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID N0:10的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:11的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所 述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原包含SEQID NO:12的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原通过添加或缺失1-5个氨基酸而改变。
7.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其还包含共价连接到所述肽抗原的氨基端或羧基端的T辅助细胞表位。
8.根据权利要求7所述的PRRS疫苗，其中所述T辅助细胞表位是SEQID NOs:35。
9.根据权利要求7所述的PRRS疫苗，其中所述T辅助细胞表位通过包含ε赖氨酸残基的间隔区共价连接到所述肽抗原。
10.根据权利要求9所述的PRRS疫苗，其中所述间隔区是SEQID NO:36。
11.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其还包含不与所述抗原肽连接的T辅助细胞表位，其中所述T辅助细胞表位选自由SEQ ID NOs:47-90组成的组。
12.根据权利要求1任一项所述的PRRS疫苗，其中所述肽抗原的总量为约10μ g至约Img0
13.根据权利要求1所述的PRRS疫苗，其中所述递送载体和佐剂选自由下列各项组成的组:Montanide ISA 50V,聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯和CpG寡核苷酸。
14.用于保护小猪抵抗PRRS感染的方法，所述方法包括施用权利要求1所述的疫苗。
15.PRRS疫苗组合物，其包含: a)肽抗原和兽医学可接受的递送载体或佐剂，b)包含选自由SEQID Nos:10，11，12，31及其组合组成的组的氨基酸序列的肽抗原，和 c)选自由SEQID NOs:80-90及其组合组成的组的PRRSV Th肽。
16.PRRS疫苗组合物，所述组合物包含: a)肽抗原和兽医学可接受的递送载体或佐剂，b)包含选自由SEQID Nos:42，44，45，46及其组合组成的组的氨基酸序列的肽抗原，和 c)选自由SEQID NOs:80-90及其组合组成的组的PRRSV Th肽。
17.用于诊断PRRS感染的方法，所述方法包括下述步骤:a)将SEQID NO:1与SEQ ID NO:2的混合物连接到固体支持物上， b)将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品，和 c)检测与连接到所述固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
18.用于测试抗-PRRSV抗体存在的ELISA免疫测定法，其包括下述步骤: a)将SEQID NO:7与SEQ ID NO:8的混合物连接到固体支持物上， b)将连接到所述固体支持物上的所述肽在有助于抗体与所述肽结合的条件下暴露于包含所述抗体的猪血液、血清或血浆样品，和 c)检测与连接到所述支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
【文档编号】A61K39/12GK103648527SQ201180071961
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年12月30日 优先权日:2011年12月30日
【发明者】王长怡 申请人:美国联合生物医学公司