检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及的是，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的，以母猪发热、厌食和流产、死产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道征状和高死亡率为特征。该病1987年首次爆发于美国后，迅速蔓延至全球所有养猪国家和地区，给养猪业造成了巨大的经济损失。因此，建立快速简便的方法来对病毒进行检测已成为该病检测的迫切需要。
[0003]现有的检测方法有病毒分离鉴定、免疫荧光试验、PCR等常规技术，但病毒分离及免疫荧光试验存在敏感性差、耗时长等不足；PCR诊断因其操作相对繁琐、对实验场地和实验人员要求较高，不适于基层单位开展工作。
[0004]因此，现有技术没有检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的有效工具。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒和检测方法，从而提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测工具和方法。
[0006]本发明的技术方案如下:
一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒，其盒体内设置酶联反应板、酶标结合物、浓缩洗涤液、底物液、显色液、浓缩样品稀释液、终止液；其中，所述酶联反应板包被了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体；所述酶标结合物为辣根过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的酶标结合物。
[0007]所述的ELISA试剂盒，其中，所述酶联反应板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体，然后在4°C静置12?24小时，冷冻真空干燥后装袋封口制成；其中，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体是用重组N蛋白免疫实验动物后，所得抗血清或腹水经蛋白A柱纯化后获得；包被液为10 μ g/ml抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的缓冲液，所述缓冲液是0.01mol/L?0.15 mo I/L的磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐缓冲液，PH7.5?pH9.5。
[0008]所述的ELISA试剂盒，其中，所述酶标结合物为用重组N蛋白免疫实验动物后，所制得的抗体采用辣根过氧化物酶进行免疫标记制成。
[0009]所述的ELISA试剂盒，其中，所述酶标结合物是含0.05%?1%的辣根过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的0.01mol/L?0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH6?8 ;并且添加含量足以抑制细菌生长的防腐剂。
[0010]所述的ELISA试剂盒，其中，其还至少包括阴性对照品、阳性对照品其中之一。[0011 ] 所述的ELISA试剂盒，其中，所述洗涤液为包含有0.1%?1%表面活性剂的
0.01mol/L?0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6?8 ;底物液为0.1%?0.5%过氧化氢溶液；显色剂为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺；样品稀释液为0.01mol/L?0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6?8 ;终止液为I mol/L?2 mol/L的硫酸或氢氧化钠。
[0012]一种用于所述的ELISA试剂盒的检测方法，其包括步骤:
Al、用重组N蛋白免疫实验动物后，所得抗血清或腹水经蛋白A柱纯化，获得抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体，在通用聚苯乙烯微孔板上包被所述抗体，然后在4°C静置12?24小时，冷冻真空干燥后制成酶联反应板，并装袋封口保存；其中，包被液是含有
0.01%~1%所述抗体的缓冲液，所述缓冲液是ρΗ7.5?ρΗ9.5的0.01 mol/L?0.15 mol/L的磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐缓冲液；
A2、用重组N蛋白免疫实验动物后，所制得的抗体采用辣根过氧化物酶进行免疫标记制成酶标结合物；
A3、所述酶联反应板每孔分别加工作浓度的样品稀释液50 μ 1，再加入待检的样本50ul，混匀；其中，所述样品稀释液为0.01mol/L?0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6?8 ;
A4、充分反应后甩去孔内液体，每孔注满(若用洗板机每孔加250 μ I)工作浓度洗涤液洗涤6次，每次均需停留I分钟；最后一次甩净，拍干；其中，所述洗涤液为包含有0.1%?1%表面活性剂的0.01mol/L?0.5mol/L磷酸盐缓冲液，pH6?8 ;
A5、每孔加酶标结合物100 μ 1，充分反应后甩去孔内液体，每孔注满(若用洗板机每孔加250 μ I)工作浓度洗涤液洗涤3次，每次均需停留I分钟；最后一次甩净，拍干；
Α6、按所需用量，临用前取等体积底物液和显色液充分混匀后每孔加100 μ 1，盖好封板膜，充分显色反应后加终止液50 μ 1，混匀，终止反应；其中，所述底物液为0.1%?0.5%过氧化氢溶液；所述显色剂为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺；所述终止液为I mol/L?2 mol/L的硫酸或氢氧化钠。
[0013]所述的检测方法，其中，步骤A3中，还包括步骤:设置阴性孔、阳性孔及空白对照孔，阴性孔、阳性孔分别加工作浓度的样品稀释液50 μ 1，然后分别加入阴性对照品、阳性对照品各50 μ 1，空白对照孔加入工作浓度的样品稀释液100 μ I。
[0014]所述的检测方法，其中，所述充分反应为37°C避光反应30-60分钟，所述充分显色反应为37 °C避光反应15分钟。
[0015]所述的检测方法，其中，步骤Al中，在4°C静置12?24小时之后，还包括步骤:采用0.1%?5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封闭2小时，经冷冻真空干燥后制成所述酶联反应板。
[0016]采用上述方案，采用本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测盒，开辟猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的新途径，利用快速免疫检测技术的敏感性、特异性以及实用性、经济性，建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒快速免疫检测方法；实现了猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术商品化，有力促进猪繁殖与呼吸综合征病毒监测水平的全面提高，推动了猪繁殖与呼吸综合征病毒防控工作。这不仅大大方便了用户操作，而且还提高了检测指标的一致性，实用性和可靠性均得到改善。
【附图说明】
[0017]图1是本发明产品的结构示意图；
图2是本发明方法的流程示意图。
【具体实施方式】
[0018]以下对本发明的较佳实施例加以详细说明。
[0019]如图1所示，本发明提供了一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒，其盒体内设置酶联反应板101和各种试剂102，各种试剂具体包括酶标结合物、浓缩洗涤液、底物液、显色液、浓缩样品稀释液、终止液等等；其中，所述酶联反应板为包被了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体所制得的酶联反应板；所述酶标结合物为辣根过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体的酶标结合物。
[0020]以下对本发明试剂盒的酶联反应板和各种试剂进行详细说明。
[0021]所述酶联反应板是在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的抗体，其中抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，下面以多克隆抗体为例进行说明，但显然对于单克隆抗体同样可实现本发明的目的，然后在4°C静置12?24小时，冷冻真空干燥后装袋封口制成。在4°C静置12?24小时之后，还可以采用0.1%?5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封闭2小时，然后再冷冻真空干燥后装袋封口制成所述酶联反应板。其中，通用聚苯乙烯微孔板，可以是48孔板或96孔板，或其他板；所