专利名称：一种重组sars病毒诊断试剂盒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SARS病毒诊断试剂盒及其制备方法与应用，尤其是一种检测SARS病毒抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术：
严重急性呼吸道综合症(SARS)病毒给人类健康带来巨大的威胁，对SARS患者进行准确及时的诊断是控制SARS流行的关键所在。当前实验室进行SARS病毒诊断时，所用的间接免疫荧光法，由于需用专用设备而难以普遍推广；而全病毒ELISA和间接ELISA的灵敏度较低，假阳性率达2-4％。
SARS病毒的M基因及N基因为病毒的核衣壳蛋白和膜蛋白，在病毒感染的早期，N蛋白抗体是最主要的抗体，适合作为检测抗原。(Ksiazek，T.Technologyin SARS discovery.SARS in the context of emerging infectious threats，A NewYork academy of sciences conference，may 17,2003.)发明创造内容本发明的目的是提供一种具有高灵敏度和特异性的SARS病毒诊断试剂盒，可以快速、准确地进行SARS病毒的诊断。
本发明提供的重组SARS病毒诊断试剂盒，包括包被在酶联板上的SARS病毒M抗原和N抗原，及酶标的SARS病毒M抗原和N抗原。
其中，SARS病毒M抗原和N抗原的浓度比为1∶1；酶标SARS病毒M抗原和N抗原的浓度比为1∶1。
所述酶联板为96孔酶联板。
所述试剂盒的酶标抗原为辣根过氧化物酶标抗原。
所述的诊断试剂盒还包括显色液、稀释液、洗涤液、终止液以及工作液。
其中，显色液为TMB，稀释液为含5％小牛血清的PBST溶液，洗涤液为PBST，终止液为2N硫酸，工作液为含10％胎牛血清的PBST。
本发明重组SARS病毒诊断试剂盒的制备方法如下所述1)获得可溶形式的SARS病毒M抗原和N抗原；2)将SARS病毒M抗原和N抗原包被到酶联板上，4℃包被过夜，然后用小牛血清封闭，洗涤封装后4℃保存备用；3)将M抗原和N抗原与辣根过氧化物酶偶联，标记抗原加10％胎牛血清、40％甘油后-70℃保存；4)将上述得到的酶联板及与辣根过氧化物酶偶联的M抗原和N抗原共同包装，得到试剂盒。
其中，所述可溶形式的SARS病毒M抗原和N抗原的制备方法为SARS病毒M基因、N基因进行PCR扩增，酶切后重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌，经纯化，获得可溶形式的M抗原和N抗原。
为了实际应用中更加方便操作，试剂盒中还包括显色液、稀释液、洗涤液、终止液以及工作液。
本发明重组SARS病毒诊断试剂盒的使用方法为M抗原和N抗原酶联板，加入稀释液后，分别加入待检样品，36℃-38℃孵育25-35分钟；洗涤后加入酶标抗原，36℃-38℃孵育25-35分钟；最后加入显色液，36℃-38℃孵育15-25分钟后终止反应，酶联仪测定各孔的OD值，即可进行判断。
本发明是用基因工程表达的SARS病毒的M抗原和N抗原，建立了基于双抗原夹心原理的酶联免疫诊断系统。由于血清不用稀释，因此灵敏度较于间接ELISA提高2-4倍；使用的抗原蛋白经过系列纯化，而且无须使用二抗，因此试剂的特异性也大大高于ELISA间接法，假阳性率＜0.2％，可以快速、准确地进行SARS病毒感染后的确诊，具有重要的临床应用价值。
图1为PCR产物琼脂糖电泳2为质粒pMG-N的构建示意3为M蛋白和N蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳4为纯化的N蛋白和M蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图具体实施方式
实施例1SARS病毒M基因和N基因的获得根据报道的SARS病毒(TOR株)M、N基因的序列，设计如下引物用于基因扩增PM1gaattccatatggcagacaacggtactatt；PM2cgggatccttactgtactagcaaagcaatat；PN1cggaattccatatgtctgataatggaccccaa；
PN2cgggatccttatgcctgagttgaatcagca。
PM1和PM2用于扩增M基因，PN1和PN2用于扩增N基因。为了方便基因克隆，在5’引物(PM1和PN1)的5’端含有EcoRI和NdeI酶切位点，而在3’引物(PM2和PN2)末端则含有BamHI位点。
用Invitrogen公司TRIzol试剂从SARS病人血液样品(由309医院提供)提取总RNA，用引物PM2和PN2进行反转录，然后进行PCR扩增，94℃30s，52℃30s，72℃90s，32循环，最后72℃7分钟。PCR片段用QIAgen的“Gel Extraction Kit”纯化后备用。PCR产物琼脂糖电泳图如图1所示，其中1为核酸分子量标准，2为扩增的N基因，3为扩增的M基因。
实施例2.M基因、N基因在大肠杆菌中的表达扩增片段经电泳纯化后用NdeI+BamHI酶切，回收的酶切片段克隆至pET22b(Novogen)的相应酶切位点。转化大肠杆菌DH5α(具体操作方法参见《分子克隆》第三版，科学出版社，1998年出版)，获得的转化子抽提质粒(使用QiagenQiaprep Spin Minipreparation质粒抽提试剂盒，按照说明书进行)进行酶切鉴定，获得重组质粒pMG-M和pMG-N。pMG-N质粒的构建过程如图2所示，pMG-M的构建过程与其完全相同。两质粒分别用载体的5’和3’引物进行DNA序列分析，结果表明其序列与SARS冠状病毒多伦多株(TOR)的M基因和N基因完全相同。
重组质粒转化大肠杆菌BL21a(DE3)，含重组质粒的大肠杆菌37℃培养4小时后用1mmol/L IPTG诱导4小时，离心(4000r/min)收集菌体，超声破碎后离心(14000r/min)，上清和重悬后的沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，分析表明M蛋白和N蛋白均以可溶性形式表达，结果如图3所示，其中泳道1为蛋白分子量标准；2为空质粒；3为pMG-M；4为pMG-N。
实施例3、重组蛋白的纯化菌体悬于合适体积的缓冲液A(25mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4pH8.0，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT)，在细菌超声破碎后14000g离心20分钟，上清液用于离子交换纯化。
SP-Sephrose Fast Flow离子交换介质装填于1.6×10cm层析柱，预处理后用3个柱体积的缓冲液A平衡，细菌裂解上清液以2mL/min流速上样，然后用缓冲液A洗涤至基线；用缓冲液A和缓冲液B(同缓冲液A，但含1mol/L NaCl)组成的线性梯度进行洗脱，收集蛋白洗脱峰通过SDS-PAGE进行鉴定，N蛋白在0.35-0.50mol/L浓度出现洗脱峰。M蛋白在0.2-0.3mol/L出现洗脱峰。
经纯化的M蛋白和N蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定为一条带，且分子量正确。结果如图4所示，其中1，3为N蛋白，2，4为M蛋白。
实施例4.重组SARS病毒诊断试剂盒的制备M抗原和N抗原分别用pH9.6的碳酸缓冲液稀释至1μg/ml，按每孔100μl包被96孔酶联板，4℃包被过夜。然后用5％小牛血清封闭4小时，用PBST(见《分子克隆》)洗涤三遍，封装后4℃保存备用。
调整M抗原和N抗原浓度至2mg/L，用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联(具体操作方法参见《当代免疫学技术及应用》第451页，巴德年主编，北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社，1998年)。标记抗原加10％胎牛血清、40％甘油后-70℃保存。适当稀释(使用含10％胎牛血清的PBST)的酶标M抗原和N抗原1∶1混合后作为酶标抗原工作液，4℃保存。
取上述酶联板，加入样品稀释液(含5％小牛血清的PBST，其中PBST的配方见分子克隆第三版附录，PBS加入0.05％的Tween20)50μl，分别加入阳性血清、阴性血清或待检临床样品各50μl，37℃孵育30分钟；用PBST洗板5次；加入酶标抗原100μl，37℃孵育30分钟，洗板同上。最后加入TMB显色液(参见《当代免疫学技术及应用》)，37℃孵育20分钟后用2N硫酸终止反应，使用BioRad 550酶联仪在450nm测定各孔的OD值。
结果表明，所使用的6份SARS病毒阳性的病人血清均呈阳性反应(OD值＞1.0)，所有20份正常人血清均呈阴性反应(OD＜0.1)，说明该试剂盒可以应用于临床检测。
将上述的96孔酶联板、样品稀释液(含5％小牛血清的PBST)10ml，酶标抗原工作液10ml，TMB显色液10ml，2N硫酸终止液10ml，10倍浓缩的PBST洗涤液(使用前用双蒸水稀释至1升)100ml，共同包装，得到重组SARS病毒诊断试剂盒。
实施例5.使用双抗原夹心ELISA检测SARS病毒抗体使用实施例4中制备的试剂盒，在广州军区总医院、309医院等医疗机构进行了临床验证，结果表明，在发病10天以上的临床确诊SARS病人中，90％左右可检出SARS抗体，在正常人、医务工作者、非SARS发热病人、非SARS呼吸道病人以及其他病人血清中，抗体检出率仅约0.1％，说明该试剂具有良好的灵敏度和特异性。检测临床样本的结果如表1所示。
表1 ELISA系统检测临床样本的结果病例数检测阳性数阳性率临床发病天数确诊0-5 274 14.8％SARS6-10382668.4％病人10-61 135 121 89.6％非SARS呼吸道病人240 0％非SARS发热病人 200 0％医务工作者 200 0％其他非SARS病人 940 1 0.106％
权利要求
1.一种重组SARS病毒诊断试剂盒，它包括包被在酶联板上的SARS病毒M抗原和N抗原，以及酶标的SARS病毒M抗原和N抗原。
2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述酶联板为96孔酶联板。
3.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒的酶标抗原为辣根过氧化物酶标抗原。
4.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于所述SARS病毒M抗原和N抗原的浓度比为1∶1；酶标SARS病毒M抗原和N抗原的浓度比为1∶1。
5.根据权利要求1，或2，或3，或4所述的诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括显色液、稀释液、洗涤液、终止液以及工作液。
6.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于所述显色液为TMB；稀释液为含5％小牛血清的PBST溶液；洗涤液为PBST；终止液为2N硫酸；工作液为含10％胎牛血清的PBST。
7.一种重组SARS病毒诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)获得可溶形式的SARS病毒M抗原和N抗原；2)将SARS病毒M抗原和N抗原包被到酶联板上，4℃包被过夜，然后用小牛血清封闭，洗涤封装后4℃保存备用；3)将M抗原和N抗原与辣根过氧化物酶偶联，标记抗原加10％胎牛血清、40％甘油后-70℃保存；4)将上述得到的酶联板及与辣根过氧化物酶偶联的M抗原和N抗原共同包装，得到试剂盒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述可溶形式的SARS病毒M抗原和N抗原的制备方法为SARS病毒M基因、N基因进行PCR扩增，酶切后重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌，经纯化，获得可溶形式的M抗原和N抗原。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于所述试剂盒中还包括显色液、稀释液、洗涤液、终止液以及工作液。
10.权利要求1-6所述的诊断试剂盒在SARS病毒诊断中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组SARS病毒诊断试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒可以快速、准确地进行SARS病毒的诊断。本发明重组SARS病毒诊断试剂盒，它包括包被在酶联板上的SARS病毒M抗原和N抗原和酶标的SARS病毒M抗原和N抗原，还包括显色液、稀释液、洗涤液、终止液以及工作液。本发明用基因工程表达的SARS病毒的M抗原和N抗原，建立了基于双抗原夹心原理的酶联免疫诊断系统。由于血清不用稀释，因此灵敏度较于间接ELISA提高2－4倍；使用的抗原蛋白经过系列纯化，而且无须使用二抗，因此试剂的特异性也大大高于ELISA间接法，假阳性率＜0.2％，可以快速、准确地进行SARS病毒感染后的确诊，具有重要的临床应用价值。
文档编号G01N33/569GK1570643SQ03146080
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月18日 优先权日2003年7月18日
发明者曹诚, 马清钧, 易艳平, 王云龙, 李平, 刘萱 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所