一种核酸提取方法及其专用试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种核酸提取方法及其专用试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 目前，在临床或科研领域中常规核酸提取方法包括物理法、化学法、酶法以及上述 方法的组合。物理法包括煮沸、冻融、微波、超声、颗粒破碎等。化学法为采用十二烷基硫酸 钠（SDS)、Trixon、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、螯合树脂、吐温20等裂解后进行提取。酶 法为采用蛋白酶K、溶菌酶、植物蛋白酶等裂解后进行提取。
[0003] 文献 1(CN101851617B)、文献 2(CN103820431A)和文献 3(CN104450684A)公开了用 磁珠法提取病毒或细菌中核酸的试剂盒及提取方法。该方法主要是通过裂解液将病毒或细 菌破碎，破碎后通过磁珠吸附游离的核酸形成磁珠-核酸复合物，并在配合磁场的作用下完 成核酸的纯化。该方法提取的核酸纯度高、完整、可直接用于后续检测，但是存在核酸提取 时间较长、操作步骤复杂、成本昂贵，并在利用磁场-磁珠反复纯化核酸的过程中造成核酸 流失等问题。
[0004] 文献4(CN104611324A)公开了一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法。该方 法用月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、PH7.4的TE，95 °C孵育2min，并将反应产物在12000rpm 离心3min，收集上清取得了全血样本的核酸提取物。其优点为提取的核酸可直接用于聚合 酶链式反应(PCR)检测。但是该方法存在整个裂解过程需要95°C高温加热，并且裂解产物需 要离心取上清的纯化步骤，其裂解条件苛刻、较为繁琐，不易被集成到微流控芯片中。
[0005] 文献5(Chelex_100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较)公开了用Chelex-100法 和碱性裂解法从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中提取核酸的一种方法。Chelex-100法用提取 液（5%Cheleχ-100，lmmol/LEDTA，l%TritonX-100)，56。C水浴30min，95。C加热10min ;4 °C、12000g离心3min，取上清即为DNA模板。碱裂解法用Imol/LNaOH 100μΙ 37°C孵育30min， 12000g离心2min，加入lmol/L HCL 100μ1，12000g离心3min，取上清即为DNA模板。两种方法 核酸提取步骤复杂，并且提取的核酸不能直接用于后续扩增，需要离心等步骤，才可以进行 后续扩增反应。
[0006] 不论是上述文献中提到的磁珠法、热裂解、碱裂解的核酸提取方法，还是其他常规 核酸提取方法均普遍存在步骤繁琐、耗时长，价格昂贵、试剂保存条件苛刻，以及核酸提取 物不能直接用于后续核酸扩增，并且难以集成到微流控芯片上等问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种核酸提取方法及其专用试剂盒。
[0008] 本发明提供了一种核酸提取方法，包括如下步骤：
[0009] (1)取样本液，与A组分混合并反应，形成反应体系；所述A组分包括氢氧化钠和二 硫苏糖醇；
[0010] (2)完成步骤(1)后，取反应体系，与B组分混合，得到核酸提取物;所述B组分为B-l 组分或B-2组分;所述B-1组分包括硫酸氢钠;所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。
[0011]所述步骤（1)的所述反应中，氢氧化钠的浓度为〇. Olmol/L-0.05mol/L，二硫苏糖 醇的浓度为 0. 〇〇lmol/L-〇. 01mol/L。
[0012] 所述步骤（1)的所述反应中，氢氧化钠的浓度可为0.01m〇l/L-0.02m 〇l/L、 0·02mol/L_0·025mol/L、0·025mol/L_0·05mol/L、0·01mol/L、0·02mol/L、0·025mol/L或 0 · 05mol/L，二硫苏糖醇的浓度可为0 · 001mol/L-0 · 003mol/L、0 · 003mol/L-0 · 005mol/L、 0·005mol/L_0·01mol/L、0·001mol/L、0·003mol/L、0·005mol/L或0·01mol/L。
[0013] 所述A组分由氢氧化钠和二硫苏糖醇组成。所述B-l组分为硫酸氢钠。所述B-2组分 由海藻糖和甘露醇组成。所述步骤（1)中，具体将80微升样本液与A组分混合。所述步骤(2) 中，将步骤(1)得到的所有反应体系与B组分混合。
[0014] 所述A组分为含有氢氧化钠和二硫苏糖醇的水溶液。所述B-1组分为硫酸氢钠水溶 液。所述B-2组分为含有海藻糖和甘露醇的水溶液。所述步骤（1)中，1体积份A组分与9体积 份样本液混合。所述步骤(1)中，具体将10微升A组分与90微升样本液混合。所述步骤(2)中， 3体积份反应体系与2体积份B组分混合。
[0015] 所述步骤(2)的所述混合后，硫酸氢钠的浓度为0.0044m〇l/L-0.32m 〇l/L。
[0016] 所述步骤（2)的所述混合后，硫酸氢钠的浓度可为0.0044m〇l/L-0.032m 〇l/L、 0·032mol/L-0·176mol/L、0·176mol/L-0·32mol/L、0·0044mol/L、0·032mol/L、0·176mol/L 或0.32mol/L。
[0017] 所述步骤（2)的所述混合后，海藻糖的浓度为13.5g/L-80g/L，甘露醇的浓度为 10.5g/L-80g/L〇
[0018] 所述步骤（2)的所述混合后，海藻糖的浓度可为13.5g/L-20g/L、20g/L-36g/L、 36g/L-80g/L、13.5g/L、20g/L、36g/L 或 80g/L，甘露醇的浓度可为 10.5g/L-20g/L、20g/L-28g/L、28g/L-80g/L、10.5g/L、20g/L、28g/LS80g/L。
[0019] 所述步骤(1)中，所述反应的条件为(bl)或(b2):
[0020] (bl)温度为 20。0105。(：；
[0021] (b2)温度为 50。〇75。(：。
[0022] 所述步骤（1)中，所述反应的条件为：温度为65°C、时间为5-30min(例如5!^11-15min、15min_30min、5min、15min或30min)〇
[0023] 所述样本液为动物体液和/或微生物培养物。
[0024] 所述核酸提取方法为提取微生物和/或动物核酸的方法。
[0025] 所述微生物具体可为鸭瘟病毒或人类疱疹病毒。所述动物体液具体可为离体的动 物体液，更具体可为人类唾液。
[0026] 本发明还提供了一种用于生物核酸提取的试剂盒，包括A组分和B组分;所述A组分 包括氢氧化钠和二硫苏糖醇;所述B组分为B-1组分或B-2组分;所述B-1组分包括硫酸氢钠； 所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。
[0027] 所述A组分由氢氧化钠和二硫苏糖醇组成。所述B-1组分为硫酸氢钠。所述B-2组分 由海藻糖和甘露醇组成。
[0028] 所述A组分为含有氢氧化钠和二硫苏糖醇的水溶液。所述B-1组分为硫酸氢钠水溶 液。所述B-2组分为含有海藻糖和甘露醇的水溶液。
[0029] 所述A组分可为A液。所述A液为含有0.1mol/L-0.5m〇VL氢氧化钠和0.01mol/L-0. lmol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液中，所述氢氧化钠的浓度可为0. lmol/L-0.2mol/L、 0·2mol/L_0·25mol/L、0·25mol/L_0·5mol/L、0·lmol/L、0·25mol/L、0·2mol/L或0·5mol/L〇 所述A液中，所述二硫苏糖醇的浓度可为0 · Olmol/L-O · 03mol/L、0 · 03mol/L-0 · 05mol/L、 0 · 05mol/L_0 · lmol/L、0 · 01mol/L、0 · 03mol/L、0 · 05mol/L或0 · lmol/L。所述A液具体可为含 有0. lmol/L氢氧化钠和0.0 lmol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液具体可为含有0.2mol/L氢 氧化钠和0.05mol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液具体可为含有0.5mol/L氢氧化钠和 0. lmol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液具体可为含有0.25mol/L氢氧化钠和0.03mol/L二 硫苏糖醇的水溶液。
[0030] 所述B-1组分可为B-1液。所述B-1液为0.08mol/L-0.8m〇VL硫酸氢钠水溶液。所述 B-1液中，所述硫酸氢钠的浓度为0.08mol/L_0.44mol/L、0.44mol/L_0.8mol/L、0.08mol/L、 0.44mol/L或0.8mol/L。所述B-1液具体可为0.08mol/L硫酸氢钠水溶液。所述B-1液具体可 为0.44mol/L硫酸氢钠水溶液。所述B-1液具体可为0.8mol/L硫酸氢钠水溶液。
[0031] 所述B-2组分可为B-2液。所述B-2液为含有50g/L-200g/L海藻糖和50g/L-200g/L 甘露醇的水溶液。所述B-2液中，海藻糖的浓度可为50g/L-90g/L、90g/L-200g/L、50g/L、 90g/L或200g/L。所述B-2液中，甘露醇的浓度可为50g/L-70g/L、70g/L-200g/L、50g/L、70g/ L或200g/L。所述B-2液具体可为含有50g/L海藻糖和50g/L甘露醇的水溶液。所述B-2液具体 可为含有90gAJ|藻糖和70 g//L甘露醇的水溶液。所述B-2液具体可为含有200g/L海藻糖和 200g/L甘露醇的水溶液。
[0032] 所述A组分可为A组件。所述A组件为装有氢氧化钠和二硫苏糖醇的反应容器。