基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于新型核酸提取技术领域，特别涉及一种基于磁性石墨稀纳米复合物的核酸提取方法。
【背景技术】
[0002]核酸作为遗传信息的载体，是生物体内重要的生物信息分子，也是分子生物学研究的主要对象。为了实现核酸功能探索及生理意义相关研究，通常需要对核酸进行分离纯化。因此，核酸提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作之一，广泛应用于。目前，提取DNA基因组主要采用“磁珠法”、“吸附柱法”、“CTAB法”、“SDS法”等去实现生物样品中DNA的提取，这些方法存在操作过程复杂、提取周期长等缺点。而RNA的提取则常采用经典的TRIzoI试剂盒提取法，TRIzoI试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。然而，该方法存在处理样品量有限、易污染RNA酶、易降解等缺点。值得注意的是异硫氰酸胍是一种有毒、可致癌的化学试剂，在提取过程中给实验者带来巨大的伤害。因此，开发新型、快速、高保真、生物兼容性的核酸提取方法对于分子生物学及相关学科的发展具有重要意义。
[0003]近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料已广泛的运用于生命科学领域。其中，氧化石墨烯更是成为了“明星”纳米材料，并广泛运用于电子学、材料学、诊断学等学科。众所周知，氧化石墨烯能够通过堆叠”效应实现吸附核酸的目的，该效应启发笔者利用氧化氧化石墨烯特异性的捕捉核酸，从而实现核酸提取的目的。加之，我课题组前期专利(中国专利:201310178816.9)公开了一种基于氧化石墨烯材料的RNA保护方法，该方法揭示了氧化石墨烯具有优异的RNA保护能力，且具有保护效率高、保护时效长的特点。因此，整合氧化石墨烯的RNA保护天赋、石墨烯的网格状结构及吸附核酸的性能，我们开发了一种基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法，该方法操作简单、耗时短、且能为RNA提供有效的保护。
【发明内容】
[0004]为了现有核酸提取技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法。本发明采用磁性石墨烯做为纳米载体，利用石墨烯刚性表面的吸附核酸能力，为核酸提供广阔的吸附截面，由此达到捕捉核酸的目的。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0006]基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法，包括如下步骤:
[0007]首先，利用氧化石墨烯表面羧基基团做为连接位点，使其和氨基磁珠连接，从而实现磁性石墨烯纳米复合物的合成;随后，采用裂解液配合蛋白酶K的方法，实现细胞的裂解，释放核酸;通过离心去除细胞碎片后，在上清液中加入磁性石墨烯纳米复合物捕捉核酸;最后，经过磁分离清洗提纯后即得到核酸样品。
[0008]所述的细胞可来源于动物细胞、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、动物组织、动物血液或植物组织；
[0009]所述的细胞在裂解前需要进行前处理；
[0010]所述的核酸样品包括DNA和RNA;
[0011 ]所述的核酸样品中加入DNA酶，得到RNA样品；
[0012]所述的核酸样品中加入RNA酶，得至IjDNA样品；
[0013]所述的基于磁性石墨烯纳米复合物的核酸提取方法，包括以下具体步骤:
[0014]I)样品前处理
[0015]①动物细胞样品处理
[0016]动物细胞细胞膜较薄、刚性弱、容易裂解，样品前处理包含以下步骤:
[0017]a.对于游离培养的细胞采用离心收集的方式，使细胞聚集于离心管底部，再用PBS缓冲液清洗两次去除残留的细胞培养液即可得到细胞沉淀。
[0018]b.对于贴壁培养的细胞采用消化液消化或细胞刮刀使细胞脱壁、并游离至培养液中，通过离心收集的方式，使细胞聚集于离心管底部，再用PBS缓冲液清洗两次去除残留的细胞培养液即可得到细胞沉淀。
[0019]c.向步骤a或b中收集的细胞沉淀中加入Sample protector，并浸泡30min，变性细胞中的RNA酶，从而避免细胞在前处理过程中出现降解。
[°02°] d.去除Sample protector，离心收集细胞沉淀，冷冻于_80°C冰箱备用。
[0021]②革兰氏阳性菌样品前处理
[0022]革兰氏阳性菌细胞壁较厚、刚性强、较难裂解，样品前处理可通过两种方法实现:
[0023]a.溶菌酶溶解细胞壁
[0024]a)离心收集过液培养的革兰氏阳性菌，去除培养液后，用PBS缓冲液清洗3次。得到菌体沉淀。
[°°25] b)向步骤a)中收集的细胞沉淀中加入Sample protector，并浸泡30min，变性菌体中的RNA酶，从而避免菌体在前处理过程中出现降解。
[0026]c)离心收集菌体沉淀，去除Sample protector，将所得菌体冷冻于-80冰箱备用。
[0027]d)加入20mg/mL的溶菌酶200yL，37°C孵育半小时。
[0028]b.液氮研磨去除细胞壁
[0029]a)离心收集过液培养的革兰氏阳性菌，去除培养液后，用PBS缓冲液清洗3次。得到菌体沉淀。
[°03°] b)向步骤a)中收集的细胞沉淀中加入Sample protector，并浸泡30min，变性菌体中的RNA酶，从而避免菌体在前处理过程中出现降解。
[0031 ] c)将步骤b)中所得的菌体移至研钵当中，倾倒液氮，并剧烈研磨成粉后，收集粉末并冷藏于-80°C冰箱备用。
[0032]③革兰氏阴性菌样品前处理
[0033]革兰氏阴性菌细胞壁较薄，易于破碎，只需参照步骤②a;
[0034]④动物组织样品前处理
[0035]动物组织样品最好“现切现用”，以防止核酸降解，特别是容易降解的RNA，动物组织样品的前处理过程主要包括以下步骤:
[0036]a.取新鲜的动物组织，用手术剪剪切成小块(约3毫米)加入Sample protector，并浸泡I小时，变性组织中的RNA酶。
[0037]b.离心去除Sample protector，所得组织块儿可现用，或冷藏于-80°C冰箱备用。
[0038]c.将步骤b中所得的组织块儿移至研钵当中，倾倒液氮，并剧烈研磨成粉后，收集粉末并冷藏于-80°C冰箱备用。
[0039]⑤动物血液样品前处理
[0040]动物血液样品需要做到“现取现用”血液中含有丰富的酶类，对于核酸的提取存在巨大的隐患。因此，血液中核酸的提取始终是巨大难题，相应的样品前处理就需要因实际需求而异:
[0041]a.目标提取核酸在血细胞中
[0042]a)如目标核酸存在于血细胞中，则需要先收集血细胞，通过高速离心使血细胞沉降，去上清，收集细胞。
[0043]b)向步骤a)中收集的细胞沉淀中加入Sample protector，并浸泡30min，变性血细胞中的RNA酶。
[0044]c)离心收集菌体沉淀，去除Sample protector，将所得血细胞冷冻于-80冰箱备用。
[0045]b.目标提取核酸在血清中
[0046]分离血细胞后得到的血清，可直接冻纯(_80°C)，再经历细胞裂解过程出去蛋白即可。
[0047]⑥植物组织样品前处理
[0048]a.取新鲜的植物组织，用手术剪剪切成小块(约2毫米)加入Sample protector，并浸泡I小时，变性组织中的RNA酶。
[0049]b.离心去除Sample protector，所得组织块儿可现用，或冷藏于-80°C冰箱备用。
[0050]c.将步骤b中所得的组织块儿移至研钵当中，倾倒液氮，并剧烈研磨成粉后，收集粉末并冷藏于-80°C冰箱备用。
[0051 ] 2)细胞裂解、核酸捕捉及清洗
[0052]①细胞裂解
[0053]本发明以单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)为例，具体讲述了在经历过样品前处理后的细胞裂解过程:
[0054]a.配置细胞裂解液
[0055]配置SDS裂解缓冲液，各成分间浓度如下:Tris-HCl(pH值8.0，终浓度50mM) ；EDTA(pH值8.0，终浓度20mM) ；NaCl(0.4M) ； SDS(2% ) 0充分混匀后灭菌备用。
[0056]b.细胞裂解
[0057]加入步骤a中所得的SDS细胞裂解液。通常情况下，17个细胞加入1.5mL即可，充分震荡混匀后，并加入蛋白酶K水浴加热至