扩增核酸的方法
【专利说明】扩増核酸的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及扩增核酸的方法。 【【背景技术】】
[0002] PCR(聚合酶链式反应）法是在研究或医疗等的各种各样的领域中最广泛普及、利 用的核酸扩增方法。在PCR法中，由重复反应液的加温和冷却的温度循环而重复双链核酸 的变性、从引物的延伸链合成等，由此扩增核酸。另外，近年开发了不经温度循环，用一定 的温度（大致60~70°C左右）进行的核酸扩增方法。作为那样的方法的代表例，可举出 LAMP (环介导的恒温扩增）法（参照US6, 410, 278)。在LAMP法中，通过在一定的温度条件 下引物与模板核酸结合而开始反应，一旦反应开始，则连续地进行反应，从而核酸被有效扩 增。但是，由于是等温扩增，一旦反应开始，则连续地进行链取代反应，无法控制。所以，对 应扩增反应中发生污染之时有困难。 【
【发明内容】
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[0003] 【发明要解决的技术课题】
[0004] 本发明人以提供可在基本上等温的条件下扩增核酸，并且，可控制扩增反应的进 行的新颖的核酸扩增方法作为课题。
[0005] 【解决课题的技术方案】
[0006] 本发明人为了解决上述的课题而锐意进行探讨的结果，令人惊讶地发现，光应答 性核酸在一定的温度条件下与双链核酸之一方的链会合，使该双链核酸的另一链解离。于 是，本发明人得到，通过使用此光应答性核酸，可光照射依赖性地控制双链核酸和引物的链 交换反应及随后的核酸的扩增反应的见解，从而完成本发明。
[0007] 本发明提供扩增核酸的方法。此方法包括，由第1波长的光的照射而使光应答性 核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序（其中，双链核酸含第1核酸及第2 核酸，第1核酸是单链，第2核酸是单链、并且有与第1核酸互补的核苷酸序列）、通过使光 应答性核酸与第1核酸互补性地会合，从此第1核酸使第2核酸解离的工序、使第1引物互 补性地会合于解离的第2核酸的工序、及由DNA合成酶，以第1引物作为起点而使互补链延 伸的工序。此方法在基本上等温的条件下进行。
[0008] 再者，本发明提供扩增核酸的方法。此方法包括，由第1波长的光的照射而使光应 答性核酸成为可会合于双链核酸的第1核酸的形态的工序（其中，双链核酸含第1核酸及 第2核酸，第1核酸是单链，第2核酸是单链、并且有与第1核酸互补的核苷酸序列）、通过 使光应答性核酸与第1核酸互补性地会合，从此第1核酸使第2核酸解离的工序、由作为与 第1波长不同的波长的第2波长的光的照射而使光应答性核酸成为无法会合于第1核酸的 形态的工序、使此光应答性核酸和第1核酸的会合解离的工序、使第2引物互补性地会合于 解离的第1核酸的工序、及由DNA合成酶，以第2引物作为起点而使互补链延伸的工序。此 方法在基本上等温的条件下进行。
[0009] 【发明效果】
[0010] 由本发明可实现可在基本上等温的条件下扩增核酸，并且，可由光照射控制扩增 反应的进行的核酸扩增反应。 【【附图说明】】
[0011]【图1】是例示实施方式1的优选的反应原理的模式图。
[0012]【图2】是例示使偶氮苯结合的光应答性核酸的光应答的模式图。
[0013] 【图3】是例示实施方式2的优选的反应原理的模式图。
[0014] 【图4】是例示实施方式3的优选的反应原理的模式图。
[0015] 【图5】是例示实施方式3的别的优选的反应原理的模式图。
[0016] 【图6】是例示实施方式4的优选的反应原理的模式图。
[0017] 【图7】是例示实施方式5的优选的反应原理的模式图。
[0018] 【图8】是显示依赖于光照射而双链核酸被扩增的荧光图像。
[0019] 【图9】是显示依赖于光照射的次数而双链核酸被扩增的荧光图像。
[0020] 【图10】是显示依赖于光照射的次数而双链核酸被扩增的坐标图。
[0021] 【实施方式】
[0022] 在本实施方式的核酸扩增方法（以下也简称为"方法"）中，通过使用光应答性核 酸，不经如用PCR法进行的温度循环，可由光照射控制双链核酸的扩增反应的进行。即，在 本实施方式的方法中，不以用于使由模板核酸和互补链构成的双链核酸变性而解离的加热 工序和用于使引物与模板核酸互补性地会合的冷却工序作为必要。从而，在基本上一定的 温度温育反应系统即可。即，本实施方式的方法可在基本上等温的条件下进行。
[0023] 反应系统是指，存在对于核酸扩增反应必要的因子，发生该核酸扩增反应的限定 的场所或空间。在本实施方式中，作为反应系统，例如，可举出含双链核酸、光应答性核酸、 引物、DNA合成酶及作为DNA合成酶的底物的dNTP混合物（dATP、dCTP、dGTP及dTTP的4种 混合物）的、收容于可透过光的容器中的如反应液或乳液一样的微小液滴，但不限于这些。
[0024] 在本说明书中，"双链核酸"是指，作为单链核酸的第1核酸和作为与该第1核酸以 可会合的程度互补的单链核酸的第2核酸由氢键会合的状态的核酸。另外，形成茎一环结 构的核酸也包括在"双链核酸"内。此时，以成为双链状态的"茎"部分中的一方的链作为 第1核酸，另一链作为第2核酸。
[0025] 在本说明书中，"互补性地会合的"的表述是指某多核苷酸的全部或一部分的区域 在严格的条件下，与别的多核苷酸的全部或一部分的区域经氢键结合。在本说明书中，"互 补性会合"和"杂交"在2个多核苷酸经氢键形成双链的点同义。再有，"严格的条件"只 要是在进行多核苷酸的杂交时本领域技术人员一般使用的条件即可，例如，2个多核苷酸之 间有至少90%、优选为至少95%的序列相同性时，可举出一个多核苷酸与另一个多核苷酸 可特异性地杂交的条件。在杂交中的严格度被知是温度、盐浓度、多核苷酸的链长及GC含 量、以及杂交缓冲液中含的离液剂的浓度的函数。作为严格的条件，例如，可使用Sambrook， J.等，1998，Molecular Cloning :A Laboratory Manual(第 2编），Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York 中记载的条件等。
[0026] 在本说明书中，"完全地互补的碱基序列"是指对于某多核苷酸含的全部的碱基形 成沃森-克里克模型的互补的碱基对的多核苷酸的碱基序列。
[0027] 关于本实施方式的方法，接下来说明将由光应答性核酸解离的第2核酸作为模 板，扩增核酸的实施方式（实施方式1)。再有，对于实施方式1，可参照在图1例示的优选 的反应原理。在图1显示使用使偶氮苯结合的光应答性核酸时的反应原理。再有，在图1 中，用有箭头的直线表示核酸链，在所述直线中有箭头的侧是核酸链的3'侧，其相反侧是 5'侦彳。另外，在图1中，将双链核酸中的第1核酸以虚线表示，将第2核酸以实线表示。
[0028] 在本实施方式中，首先进行，由第1波长的光的照射而使光应答性核酸成为可会 合于双链核酸的第1核酸的形态的工序。参照图1，则在此工序中，无法会合于第1核酸的 形态的光应答性核酸（参照图1的（A))由可见光照射而成为可会合于第1核酸的形态（参 照图1的（B))。
[0029] 作为扩增对象的双链核酸也可为双链DNA、双链RNA、及单链RNA和单链DNA的杂 交体之任何。另外，双链核酸的形状不特别限定，可为如质粒DNA-样的环状的双链核酸， 也可为单链核酸在分子内互补性地自身会合的发夹状的双链核酸。双链核酸的来源不特别 限定，可为基因组DNA等的天然来源的双链核酸，也可为自天然来源的核酸合成或扩增的 双链核酸（例如mRNA-cDNA杂交体、双链cDNA等）。只要是可成为用于互补链合成的模板， 双链核酸可用公知的标记物质等修饰，构成核酸的核苷酸也可被人工的衍生物取代。
[0030] 在本说明书中，"光应答性核酸"是指使由指定的波长的光的照射异构化而立体 结构变化的有机基结合1个以上的单链核酸。再有，使那样的有机基结合的核酸自体是 在现有技术中公知的，例如，可举出W0 01/21637中记载的光应答性寡核苷酸（参照TO 01/21637,通过引用并入本说明书）。在本实施方式中，可利用由光照射的光应答性核酸中 的有机基的立体结构的变化，可逆地进行与双链核酸的第1核酸的互补性会合及从会合状 态的解离。作为用于光应答性核酸的核酸，可使用DNA或RNA。另外，也可为PS-寡核苷酸、 PNA (肽核酸）、吗啉代寡核苷酸、2' 0-取代RNA、BNA (桥核酸）等以往