一种采用重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用重组酶介导等温扩增技术检 测疟原虫的通用方法。
【背景技术】
[0002] 疟疾是严重危害人类健康的全球性虫媒传染病之一，威胁着全球近十几亿、100多 个国家和地区人民的健康。据统计，疟疾每年感染3000至5000万人，并且导致每年1百万 到3百万人的死亡，绝大部分集中在热带和亚热带地区，近年来，随着国际交往的日益频 繁，我国云贵、海南和两广等地区也存在着疟疾的流行，每年均有死亡病例报告。因此，准 确、及时诊断是当前亟待解决的问题，也是安全有效地治疗疟疾的基础。
[0003] 疟疾是由疟原虫属的原生动物寄生虫引发的，寄生于人体的疟原虫有4种，由4种 不同的疟原虫引起，即：间日疟，病原为间日疟原虫；三日疟，病原为三日疟原虫；卵形疟， 病原为卵型疟原虫；恶性疟，病原为恶性疟原虫。
[0004] 目前，诊断疟疾的优选并且最可靠的方法是厚、薄血膜镜检法，具有操作简单、敏 感、价廉和可鉴别虫种等优点而被广泛应用于疟疾的病原学诊断，且作为疟疾确认的金标 准。但该法对镜检者技术要求较高，镜检阳性率非常主观化，原虫的抗药性和原虫密度较 低都易引起假阴性的出现。为提高原虫的检出率，在普通镜检的基础上发展出荧光镜检及 暗视野镜检等手段，一般用于临床辅助诊断。针对疟疾流行区偏僻落后的特点，利用免疫 色谱技术开发了多种试剂盒产品，从取血、反应至结果判断，只需5-10分钟，而且可以供大 批量样品同时检测，不需要特殊仪器，非常适用于基层医院及条件较差的诊所。但人工合 成抗原或抗体的成本较高，一直限制着试剂盒的应用。近年来，随着分子生物学的发展， PCR(polymerasechainreaction)技术以其高度的特异性及敏感性在痕原虫检测方面取 得了重大的突破，特别是实时定量PCR和巢式PCR。但这两种方法必须在实验室内完成，对 仪器的要求较高并需要专业的技术人员才能操作完成，而且耗时较长。
[0005] 由于现存疟原虫检测方法的不足以及疟疾快速实地检测的需求，因此研究一种能 在基层应用，可简单快速检测疟原虫的扩增方法非常有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种采用重组酶介导等温核酸扩增技术进行疟疾检测的通 用方法，该检测方法的主要步骤是先进行疟原虫DNA提取，将疟原虫DNA加入到含有特异引 物的重组酶介导等温核酸扩增体系中进行扩增，在等温条件（35-42°C)下，5-60分钟即可 检测扩增产物。
[0007] 本发明的具体技术方案如下：
[0008] 1、获取疟原虫基因组DNA，设计疟原虫通用引物，建立含有疟原虫属通用引物的重 组酶介导等温核酸扩增体系，将疟原虫DNA加入到扩增体系中，再加入浓度为6 % (w/v)的， 分子量为20000的聚乙二醇反应缓冲液，在等温条件（35-42°C)下，5-60分钟即可检测到 扩增产物。
[0009] 2、根据上述1所述的方法，建立含有疟原虫属通用引物的重组酶介导的等温核酸 扩增体系如下：
[0011] 3、将上述2所述的含有疟原虫属通用引物的重组酶介导等温核酸扩增体系快速 冷冻至-20°C，在此温度条件下，在冷冻干燥机中负压冷冻干燥20小时成为粉未状扩增体 系。
[0012] 4、根据上述2所述的含有疟原虫属通用引物的重组酶介导的等温核酸扩增体系， 正向引物和反向引物为疟原虫属通用引物。
[0013] 5、根据上述4所述的疟原虫属通用引物，其引物序列为：
[0014]正向引物序列：5 ' -CCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTG-3 '，
[0015]反向引物序列：5 ' -CTCGCCCCAGAACCCAAAGACTITGAITTCTC-3 '。
[0016] 6、根据上述2所述的含有疟原虫属通用引物重组酶介导的等温核酸扩增体系，扩 增时用浓度为6% (w/v)的，分子量为20000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成 为25iil、50iil、100ia中的任一个体积进行扩增，其最佳扩增体积为50iU。
[0017] 7、根据上述1所述的方法，反应的温度为35_42°C，最佳反应温度为37°C。
[0018] 8、根据上述1所述的方法，扩增产物检测的时间为5-60分钟，最佳反应时间为30 分钟。
[0019] 本发明所提供的方法，更适合应用于有大量样品的检测，几乎不需要专业仪器，操 作更为简单，对操作人员的技术要求更低。检测时间短，并且可同时检测大批量的样本，具 有良好的特异性、敏感性和稳定性。并且本方法无需PCR仪等仪器，适用于非实验室的检测 场所，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【附图说明】
[0020] 图1为使用本发明的重组酶介导等温核酸扩增方法进行疟原虫DNA扩增后的产物 凝胶电泳图，图中为同时进行三个阳性对照的电泳图，目的片段大小为186bp，
[0021] 其中，M为marker，1-3为阳性反应，4为不加模板的阴性对照。
【具体实施方式】
[0022] 下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
[0023] 实施例一：
[0024] 1、样品来源及疟原虫DNA提取
[0025] 样品由浙江国际旅行卫生保健中心提供，是被确诊为疟疾的归国非洲劳务人员的 标本。
[0026]取IOOiU样品置于I. 5ml离心管中，加入300ul裂解液（Trizol)，再加入IOOul 氯仿，混匀器上振荡混匀5s或颠倒混匀15次；将离心管放入离心机，在13000rpm条件下， 离心15min，吸取上层液体，加入干净的I. 5ml离心管中，再加入等体积异丙醇，颠倒混匀 室温静置lOmin，13000rpm离心lOmin，轻轻倒去上清液；加入700ul75 %乙醇，颠倒洗涤， 13000rpm离心5min，轻轻倒去上清液，再倒置于吸水纸上，弃尽液体或4000rpm离心5s，将 管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器吸干液体，加入2