直用型高gc含量核酸pcr扩增混合试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种适用于高GC含量核酸扩增的直用型PCR扩增混合试剂。该混合试剂包括：DNA聚合酶、KCl、Tris?HCl、MgCl2、dNTPs和甘油，溶剂为ddH2O。在某些优选的实施方案中，该混合试剂中还包括增强剂，可对只含2个拷贝的模板进行有效扩增，所述的增强剂为DMSO、NH4Cl、7H2O·MgSO4、甜菜碱、昆布氨酸、龙虾肌碱、乙二醇和山梨醇中的一种或多种。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染；同时，由于体系内含有增强剂，能够显著增强PCR扩增的灵敏度。该混合试剂能够实现对GC含量超过85％的核酸模板的PCR扩增。
【专利说明】
直用型高GC含量核酸PCR扩増混合试剂
技术领域
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种直用型高GC含量核酸模板的PCR扩 增混合试剂。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术，在某种程度上是一种生物体外的特殊DNA复制过程。PCR技术的最 大特点是利用微量的DNA模板实现其大量富集。该技术于1983年，由美国Mullis首先提出设 想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。至今 为止，PCR已发展到第四代技术。
[0003] PCR是利用DNA分子在95 °C左右高温时变性会变成单链，在60 °C左右低温时引物与 单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右），DNA聚合 酶沿着磷酸到五碳糖(5'_3'）的方向合成互补链，来实现DNA分子的体外扩增。根据以上原 理，常规PCR过程一般分为变性、退火、延伸3个阶段。
[0004] PCR技术发展至今已有30年左右的时间，随着分子生物学技术的不断进步，PCR技 术也不断趋于完善，被利用到生物学、食品科学以及医学等各个领域，并且随之发展出各种 具有针对性功能的PCR扩增试剂。
[0005] 随着实际应用的不断发展，对PCR扩增试剂的稳定性、便捷性以及功能性的要求不 断提尚。
[0006] 由于DNA分子中，碱基A和T之间形成2对氢键，而碱基G和C之间形成3对氢键，因此 打开碱基G和C之间的链接需要的能量相对较高，也就导致高GC含量的模板在进行变性时所 需的能量更高，变性困难;并且并且模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板 上进行DNA合成而导致扩增失败。研究人员也尝试了许多方法提高高GC含量核酸的特异性 扩增效率，如热启动和两步PCR等，然而这些方法只针对某些特性靶基因扩增有一定的效 果，并不具有普适性。
[0007] 除此之外，也有人开始对PCR反应的添加剂进行研究，获得了一批PCR试剂，能够提 高高GC含量核酸的特异性扩增效率。
[0008] 中国专利申请CN200810167573公开了一种扩增高GC含量片段的PCR专用混合液及 其应用，所述混合液为2XGC-RICH master mix，其特征在于:该混合液含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl，3mM MgC12，l-20%甘油，1-2%Tween-20，lmM dNTP，0.1U Taq DNA聚 合酶，0.02U pfu DNA聚合酶，0.1-IM甜菜碱和0.1-IM脯氨酸。该混合液能获得保真度较高 的DNA并能对一些有特殊结构如GC含量高(60 %〈GC%〈74.8 % )，有二级结构模板等进行很 好地扩增。
[0009] 中国专利申请CN201410120471公开了一种用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂组 合物及高GC含量基因的PCR扩增方法。其中，扩增添加剂选自7-deaza-dGTP、甜菜碱或甜菜 碱类似物、DMS0、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2种或2种以上的组合。应用此PCR添加剂及扩 增方法，可以扩增模板GC含量大于80%的目的基因，可以成功扩增复杂基因用于临床检测。
[0010] 虽然目前已经发展出多种适用于高GC含量的核酸分子的PCR扩增试剂，然而这些 扩增试剂多为分步加样试剂，即除了模板和引物之外的PCR反应组分，如DNA聚合酶、扩增缓 冲液以及dNTP等试剂为分开独立包装，在使用时需要将上述组分分别加入PCR扩增体系中。
[0011] 这种分步加样型PCR扩增试剂，在使用时增加了加样次数，同时也提高了交叉污染 的出现概率。通常使用的PCR扩增体系为I OyL、25yL或50yL等微量体系，DNA聚合酶等试剂的 加入量也通常只有几微升，在这种微量体系中，上述分步加样型的PCR试剂在使用时也就容 易出现因取样不准而导致的重复性差甚至是PCR扩增失败等问题。也有一些实验人员为了 减少加样次数或提高扩增反应的重复性，将DNA聚合酶、扩增缓冲液和dNTP简单混合在一起 作为母液，然而这种简单的混合物不稳定、不耐冻融、不利于保存，也会导致扩增实验结果 不准确甚至实验失败。
[0012] 综上所述，开发出一种适用于高GC含量核酸模板的直用型PCR扩增混合试剂，将除 了特异性模板和引物之外的其余PCR组分混合其中，并保持DNA聚合酶的稳定性，有效地减 少加样次数，简化试验流程，节约实验时间；并且降低交叉污染和加样错误的风险，提高实 验成功率和重复性，是PCR扩增试剂的科学研发与实际应用中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0013] 术语：
[0014] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。
[0015]本发明中的术语"dNTPs"指dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种单脱氧核糖核苷酸的混合 物；术语"ddH20"指双蒸水;术语"Tr i s-HCl"指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐;本发明中的术语 "2 X"指该溶液中各组分的浓度为其工作浓度的2倍;术语"1 X"指该溶液中各组分的浓度 为其工作浓度。
[0016] 本发明要解决的一个问题是提供一种相对更为高效、灵敏、稳定和灵活的适用于 高GC含量核酸的直用型PCR扩增混合试剂。
[0017] 为解决上述问题，本发明具体技术方案是，一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合 试剂:2 X PCR Taq Mix，所述直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂包括:DNA聚合酶、KCl、 Tris-HCl、MgCl2、dNTPs 和甘油，溶剂为 ddH20。
[0018] 上述PCR扩增混合试剂中，DNA聚合酶为嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热 稳定重组型Taq DNA聚合酶，分子量为94KDJaq DNA聚合酶的浓度为0.1~0.4U/yL，优选为 0 · 15~0 · 3U/yL;进一步优选为0 · 18~0 · 24U/yL;更进一步优选为0 · 2U/yL。
[0019] 上述PCR扩增混合试剂中，KCl的浓度为50~150mM;优选为70~120mM;进一步优选 为80~IlOmM;更进一步优选为100mM。
[0020] 上述PCR扩增混合试剂中，Tris-HCl的浓度为10~30mM;优选为15~25mM;进一步 优选为18~22mM;更进一步优选为20mM。
[0021] 上述PCR扩增混合试剂中，MgCl2的浓度为1~5mM;优选为2~4.5mM;进一步优选为 2.5~3.5mM;更进一步优选为3mM。
[0022] 上述PCR扩增混合试剂中，dNTPs的浓度为200~600μΜ;优选为300~500μΜ;进一步 优选为350~450μΜ;更进一步优选为400μΜ。
[0023] 上述PCR扩增混合试剂中，甘油的体积浓度为5~20% ;优选为6~16% ;进一步优 选为8~14%;更进一步优选为10%。如未另行指出，本文中涉及的甘油浓度均为体积浓度。
[0024] 在某些优选的实施方案中，所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂中还包 括增强剂，所述的增强剂为DMS0、NH4C1、7Η 20 · MgS〇4、甜菜碱、昆布氨酸、龙虾肌碱、乙二醇 和山梨醇中的一种或多种。
[0025] 所述的DMSO的体积浓度为0.5~4% ;优选为1~3% ;进一步优选为1.5~2.5% ;更 进一步优选为2%。如未另行指出，本文中涉及的甘油浓度均为体积浓度。
[0026] 所述的NH4Cl的浓度为5~18mM;优选为6~14mM;进一步优选为8~12mM;更进一步 优选为IOmM。
[0027] 所述的7H20 · MgS〇4的浓度为1~5mM;优选为2~4mM;进一步优选为2.5~3.5mM;更 进一步优选为3mM。
[0028] 所述的甜菜碱的浓度为0 · 05~0 · 4mM;优选为0 · 1~0 · 3mM;进一步优选为0 · 15~ 0.25mM;更进一步优选为0.2mM。
[0029] 所述的昆布氨酸的浓度为10~100μΜ;优选为20~80μΜ;进一步优选为30~70μΜ; 更进一步优选为40μΜ。
[0030] 所述的龙虾肌碱的浓度为50~150μΜ;优选为60~120μΜ;进一步优选为70~100μ Μ;更进一步优选为75μΜ。
[0031] 所述的乙二醇的体积浓度为1~10% ;优选为2~8% ;进一步优选为3~6% ;更进 一步优选为4%。如未另行指出，本文中涉及的甘油浓度均为体积浓度。
[0032] 所述的山梨醇的浓度为5~12mM;优选为6~IOmM;进一步优选为7~9mM;更进一步 优选为8mM。
[0033] 本发明要解决的另一个问题是提供上述直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂的 使用方法:使用时，按照所需扩增体积的50%量取本发明所述的直用型高GC含量核酸PCR扩 增混合试剂，加入扩增模板和引物后，使用CldH 2O补足至所需扩增体积。
[0034] 所述的高GC含量核酸可以为来源于植物、动物或微生物中的基因。
[0035]所述的高GC含量核酸的长度上限为5Kb。
[0036] 所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂在用于PCR扩增时，模板种类可以为 基因组DNA、质粒或噬菌体DNA，但并不局限于上述种类的模板。当以基因组DNA作为模板时， 扩增反应体系中比较适宜的模板浓度为1~lOyg/mL;当以质粒或噬菌体DNA作为模板时，扩 增反应体系中比较适宜的模板浓度为0.1~lyg/mL。
[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0038] 1.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂为2X的浓缩试剂，其中含 有Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等除模板和引物以外的扩增必需组分。使用时，仅需在扩 增体系中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化了操作流程，缩短了操作时间，降低了交 叉污染的风险。可于Imin内建立反应体系，能够快速完成大批样品PCR反应体系的建立。
[0039] 2.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂不仅能够实现对中等GC含 量(约45%左右)核酸模板的PCR扩增，也能够实现对GC含量高达68.5~77.6%的核酸模板 的PCR扩增;尤其只用于GC含量为75%左右的核酸模板。此外，在某些反应体系中，甚至能够 实现对GC含量高达85 %的核酸模板进行PCR扩增。适用于动物、植物以及微生物来源的高GC 含量基因的PCR扩增。
[0040] 3.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂选择的聚合酶为嗜热性细 菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶，分子量为94KD。扩增片段的长 度可达5kb，延伸速度达到0.9~1.2kb/min，扩增效率高。
[0041] 4.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂中含有增强剂，能够显著 增强PCR扩增的灵敏度，可对只含2个拷贝的模板进行有效扩增。
[0042] 5.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂具有灵活性，不仅能够完 成常规50yL体系的扩增反应，在低至25yL或IOyL的反应体系中，也能顺利完成扩增反应。 [0043] 6.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂中除Taq DNA聚合酶以外， 其它组分的组成和含量更为合理与平衡，使得聚合酶活性状态和保真度更为稳定。具有高 稳定性，-20°C保存两年，聚合酶活力与保真度无变化;4°C保存六个月，聚合酶活力与保真 度无变化;室温下放置一个月，聚合酶活力与保真度无变化;反复冻融十次以上，无明显活 性丧失。
[0044] 7.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂不仅可以使用常规扩增引 物，还可以使用较为复杂、解链温度较高的简并引物。
[0045] 8.本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂应用范围大，适用于：（1) 常规PCR扩增；（2)高GC含量模板的PCR扩增；（3)DNA的各种标记，如同位素和biotin标记等； (4)DNA测序；（5)基于PCR技术的基因扫描；（5)平末端PCR产物的加 A等。
【附图说明】
[0046] 图1为实验例1中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0047]以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施 例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改 对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本 发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示 的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范 围。
[0048]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 (例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或 者按照产品说明书进行。
[0049] 离心机购自德国Eppendorf公司，型号为54iro;PCR仪购自美国BIO-RAD公司，型号 为MJ-mini ;核酸电泳仪购自美国BAYGene公司，型号为BG-Power600i。
[0050]若无另行说明，本发明所用试剂均购自美国Sigma公司和NEB公司。
[0051 ]实施例1 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0052] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.1U/yL、KCl 50mM、Tris-HCl 10mM、MgCl2 ImM、 dNTPs 200μΜ和甘油 16%，溶剂为ddH20。
[0053] 实施例2-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0054] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.15U/yL、KCl 80mM、Tris-HCl 22mM、MgCl2 2mM、 dNTPs 350μΜ和甘油 14%，溶剂为ddH20。
[0055] 实施例3-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0056] 包括以下组分：Taq DNA 聚合酶 0.24U/yL、KCl 70mM、Tris-HCl 18mM、MgCl2 3.5mM、dNTPs 450μΜ和甘油20%，溶剂为ddH20。
[0057] 实施例4 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0058] 包括以下组分：Taq DNA 聚合酶 0.18U/yL、KCl 110mM、Tris-HCl 25mM、MgCl2 4.5mM、dNTPs 300μΜ和甘油8%，溶剂为ddH20。
[0059] 实施例5-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0060] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.4U/yL、KCl 150mM、Tris-HCl 15mM、MgCl2 5mM、 dNTPs 600μΜ和甘油5%，溶剂为ddH20。
[0061 ]实施例6-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0062] 包括以下组分：Taq DNA 聚合酶 0.3U/yL、KCl 120mM、Tris-HCl 30mM、MgCl2 2.5mM、dNTPs 500μΜ和甘油6%，溶剂为ddH20。
[0063] 实施例7-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0064] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 dNTPs 400μΜ和甘油 10%，溶剂为ddH20。
[0065] 实施例8-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂(材料中的配比）
[0066] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 dNTPs 400μΜ、甘油 10%和DMSO 2%，溶剂为ddH20。
[0067] 实施例9 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0068] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.1U/yL、KCl 50mM、NH4Cl 8mM、Tris-HCl 10mM、 MgCl2 lmM、dNTPs 200μΜ和甘油 16%，溶剂为ddH20。
[0069] 实施例10-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0070] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.15U/yL、KCl 80mM、Tris-HCl 22mM、MgCl2 2mM、 7H20*MgS〇4 2mM、dNTPs 350μΜ和甘油 14%，溶剂为ddH20。
[0071 ]实施例11 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0072] 包括以下组分：Taq DNA 聚合酶 0.24U/yL、KCl 70mM、Tris-HCl 18mM、MgCl2 3.5mM、dNTPs 450μΜ、甜菜碱0.15mM和甘油20%，溶剂为ddH20。
[0073] 实施例12-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0074] 包括以下组分：Taq DNA 聚合酶 0.18U/yL、KCl 110mM、Tris-HCl 25mM、MgCl2 4.5mM、dNTPs 300μΜ、昆布氨酸ΙΟμΜ和甘油8%，溶剂为ddH20。
[0075] 实施例13-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0076] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.4U/yL、KCl 150mM、Tris-HCl 15mM、MgCl2 5mM、 dNTPs 600μΜ、龙虾肌碱70μΜ和甘油5%，溶剂为ddH20。
[0077] 实施例14 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0078] 包括以下组分：Taq DNA 聚合酶 0.3U/yL、KCl 120mM、Tris-HCl 30mM、MgCl2 2.5mM、dNTPs 500μΜ、乙二醇6%和甘油6%，溶剂为ddH20。
[0079] 实施例15-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0080] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 dNTPs 400μΜ、山梨醇IOmM和甘油10%，溶剂为ddH20。
[0081 ]实施例16-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0082] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 NH4CI 10mM、dNTPs 400μΜ、甘油 10%和DMSO 2%，溶剂为ddH20。
[0083] 实施例17-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0084] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 甜菜碱0.2mM、dNTPs 400μΜ、甘油 10%和DMSO 2%，溶剂为ddH20。
[0085] 实施例18-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0086] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 昆布氨酸40yM、dNTPs 400μΜ、甘油 10%和DMSO 2%，溶剂为ddH20。
[0087] 实施例19 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0088] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 龙虾肌碱75yM、dNTPs 400μΜ、甘油 10%和DMSO 2%，溶剂为ddH20。
[0089] 实施例20-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0090] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 乙二醇1%、山梨醇12111]\1、(1犯1^40(^]\1、甘油10%和0150 2%，溶剂为(1(1!12〇。
[0091 ]实施例21-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0092] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (1犯1^40(^]\1、甘油10%、0150 2%、順4(：1141111和昆布氨酸3(^]\1，溶剂为(1(1!12〇。
[0093] 实施例22-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0094] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (1町？8 40(^]\1、甘油10%、0150 2%、冊4(：112111]\1、龙虾肌碱15(^]\1和昆布氨酸7(^]\1，溶剂为 CldH2O。
[0095] 实施例23-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0096] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 dNTPs 400μΜ、甘油 10%、DMS0 l%、7H2O.MgS〇4 4mM、甜菜碱O.lmM和昆布氨酸70μΜ，溶剂为 CldH2O。
[0097] 实施例24-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0098] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 dNTPs 400μΜ、甘油 10%、DMS0 2.5%、7H2O.MgS〇4 2.5mM、龙虾肌碱 120μΜ、山梨醇5mM和乙 二醇10%，溶剂为ddH20。
[0099] 实施例25-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0100] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (1町？8 40(^]\1、甘油10%、0150 2%、乙二醇2%、順4(：15111]\1、甜菜碱0.051111和昆布氨酸2(^]\1， 溶剂为ddH20。
[0101 ]实施例26-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0102] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (11?1^40(^]\1、甘油10%、0150 0.5%、7!120.]\%504 3.51111、甜菜碱0.3111]\1、龙虾肌碱6(^]\1、山 梨醇7mM和乙二醇8%，溶剂为ddH20。
[0103] 实施例27-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0104] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (1町?8 40(^]\1、甘油10%、0150 3%、顺4(：16111]\1、甜菜碱0.25111]\1、龙虾肌碱5(^]\1、山梨醇91111和 乙二醇3%，溶剂为ddH 20。
[0105] 实施例28-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0106] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (11?1^40(^]\1、甘油10%、0150 1.5%、7!120.]\%504 5111]\1、昆布氨酸10(^]\1、龙虾肌碱10(^]\1、 NH4Cl 18mM、甜菜碱0.4mM、山梨醇7Mm、和乙二醇6%，溶剂为ddH20。
[0107] 实施例29-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0108] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 (1犯1^40(^]\1、甘油10%、0150 4%、顺4(：118111]\1、7!120.]\%5041111]\1、甜菜碱0.41111、龙虾肌碱60 μΜ、山梨醇7Mm、昆布氨酸80μΜ和乙二醇6%，溶剂为ddH20。
[0109] 实施例30-种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂
[0110] 包括以下组分：Taq DNA聚合酶0.2U/yL、KCl 100mM、Tris-HCl 20mM、MgCl2 3mM、 dNTPs 400μΜ、甘油 10%、DMS0 2%、NH4C1 1〇1^、7!12〇.]\%5〇43111]\1、甜菜碱0.21111、昆布氨酸40 μΜ、龙虾肌碱75μΜ、乙二醇4 %和山梨醇8mM，溶剂为ddH20。
[0111] 实验例1
[0112] 分别使用本发明实施例1-30所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，以λ DNA为模板，扩增I kb片段。
[0113] 按下表体系配制50yL扩增体系，剩余体积以CldH2O补齐：
[0118] 扩增结果:取扩增产物2yL，进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，其中泳道1-30 分别为本发明实施例1-30所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂的扩增结果。实施 例1-30所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂均能扩增出目的条带;且扩增产物纯 度高，没有非特异性扩增产物;扩增产物经测序验证，无突变碱基。
[0119] 将上述扩增反应的体系按比例缩小至25yL和IOyL时，仍能扩增出目的条带，且扩 增产物中无突变碱基。
[0120] 实验例2高GC含量基因的扩增
[0121]目的基因：来源于Amycolatopsis fastidiosa的环化脱水酶基因，长度为973bp， GC含量70 %以上，解链温度98 °C。
[0122] 利用本发明实施例1-30所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂以及四种市 售PCR预混试剂扩增上述环化脱水酶基因。
[0123] 实验过程：
[0124] 按下表体系配制50yL扩增体系，剩余体积以CldH2O补齐：
[0126] 其中扩增模板和上游引物及下游引物由中国海洋大学提供。经计算，上游引物Tm 值为79.7°C，GC含量为72% ;下游引物Tm值为84.5°C，GC含量为70%。
[0127] 按如下程序进行PCR反应：
[0129]扩增结果:取扩增产物2yL，进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示实施例1-30所述 的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂均能够成功扩增出来源于Amy co latops is fastidiosa的环化脱水酶基因；且扩增产物纯度高，没有非特异性扩增产物;扩增产物经测 序验证，无突变碱基。而四种市售PCR预混试剂无法扩增出目的基因。
[0130] 实验例3本发明和市售PCR预混液的稳定性对比
[0131] 将本发明实施例1-30所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂和四种市售 PCR预混试剂分别于-20°C、4°C以及室温(20°C)下保存一定时间后，测定其DNA聚合酶的剩 余活力;并用其扩增长度为2Kb的基因片段，测序检测扩增产物中突变碱基的个数。
[0132] DNA聚合酶的剩余活力（％ )=在某一温度下保存0时间的活力/保存t时间的活力* 100%
[0133]实验结果见下表：
[0134] -、在-20°C保存一年后的结果
[0137]二、在-20°C保存两年后的结果
[0144]将本发明实施例1-30所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂和四种市售 PCR预混试剂反复冻融15次后，测定DNA聚合酶的剩余活力，测定结果见下表：
[0146] 根据实验结果可以看出，本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂-20 °C保存两年、4°C保存六个月或室温下保存一个月，聚合酶活性无明显变化，且扩增产物中 没有出现突变碱基;而四种市售PCR预混试剂在相同的保存温度和时间下，活力降低到原来 的90%以下，并且其扩增产物出现1-2个突变碱基。本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR 扩增混合试剂在反复冻融15次以后，聚合酶活性无明显变化;而四种市售PCR预混试剂反复 冻融15次后活性降低到原来了 80%左右。
[0147] 因此，本发明提供的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂具有相对较高的稳定 性。
【主权项】
1. 一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂2 X PCR Taq Mix，其特征在于:所述的混 合试剂包括:DNA聚合酶、此1、1^8-!1(：1、1%(：12、(^1^和甘油，溶剂为(1(1!1 20。2. 如权利要求1所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于:所述的DNA 聚合酶为嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶，分子量为 94KD〇3. 如权利要求2所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于:所述的混 合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.1 ~0.4UAiL、KCl 50~150mM、Tris-HCl 10~30mM、MgCl2 1 ~5mM、dNTPs 200~600μΜ和甘油5~20%，溶剂为ddH20。4. 如权利要求3所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于:所述的混 合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.15~0.3U/yL、KCl 70~120mM、Tris-HCl 15~25mM、MgCl2 2 ~4.5mM、dNTPs 300~500μΜ和甘油6~16%，溶剂为ddH20。5. 如权利要求4所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于:所述的混 合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.18~0.24U/yL、KCl 80~110mM、Tris-HCl 18~22mM、MgCl2 2.5~3.5111]\1、(1犯1^ 350~45(^]\1和甘油8~14%，溶剂为(1(1!12〇。6. 如权利要求5所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于:所述的混 合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.2UAiL、KCl 100mM、Tris-HC120mM、MgCl23mM、dNTPs400y]\^P 甘油10%，溶剂为ddH20。7. 如权利要求1-6任意一项所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在 于:所述的混合试剂还包括增强剂，增强剂为DMS0、NH4C1、7H 20 · MgS〇4、甜菜碱、昆布氨酸、 龙虾肌碱、乙二醇和山梨醇中的一种或多种。8. 如权利要求要求7所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于:所述 的增强剂为DMSO、甜菜碱、昆布氨酸和龙虾肌碱中的任意一种;优选为DMSO。9. 如权利要求1-8任意一项所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在 于:所述的混合试剂的使用方法为:使用时，按照所需扩增体积的50%量取直用型高GC含量 核酸PCR扩增混合试剂，加入扩增模板和引物后，使用ddH 20补足至所需扩增体积。10. 权利要求1-9中任意一项所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂在扩增高GC 含量核酸中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK105861489SQ201610237453
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】刘翠, 刘涛
【申请人】青岛海大蓝科生物科技有限公司