一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，包括以下步骤：S1，细菌培养：将甘油管中菌种划线接种到MRS固体培养基上，在36?38℃培养47?49h后，将菌种转接于MRS液体培养基，在36?38℃下180r/min震荡需氧培养23?25h，在对数末期获得菌体；S2，诱变：在无菌条件下分别取培养后的菌液1.5mL于18个一次性小平板中，分别作标签1min，3min，5min，7min，9min，每个时间做3个平行，同时做3个空白对照，无菌条件下，置于等离子体发生室诱变，诱变完成后，将相同时间的3个平行混合，每个时间取100μL用于菌落计数，0.5mL用于菌种保存，取剩余1ml菌液进行铅吸附试验。本发明步骤清晰，操作简单，可以准确实现等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析，适合推广。CGMCC No.1194420151228
【专利说明】
一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法技术领域，尤其涉 及一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法。
【背景技术】
[0002] 由于人为因素尤其是工业的发展及地球表面活动，重金属对环境的污染越来越严 重，其对各类生物和地球生命的危害影响已经逐步成为全球关心的问题。食品中铅污染已 经成为普遍的公共卫生问题，慢性铅中毒在世界各国仍是一个亟需解决的问题。为了减轻 或清除铅富集对机体的危害，我们除了预防铅富集在机体内，还必须采取有效的措施来清 除已富集在机体内的重金属铅。目前，利用自然界筛选获得天然耐铅微生物作为一种重金 属清除试剂成为研究人员关注的新领域。其中，益生菌是一类能够保持宿主肠内微生物菌 群的生态平衡的细菌，被人类称为微生态调制剂。它对宿主的生理健康可以产生有益作用， 又被称为活性微生物。因此，利用对动物机体有益的耐铅益生菌作为清除剂，既对机体有益 生作用，又可以在消化道内清除机体摄入的铅离子，并将铅排出体外，从而防止铅在机体内 富集中毒，具有很高的研究价值。
[0003] -般来说，从自然界分离筛选得到的菌株，不宜直接投入到工业生产中。常压室温 离子体作为一种新型诱变手段，具有操作简单、费用低廉、无毒性、正突变率高等优点，日益 受到国内外学者的青睐。国内外一些研究结果表明，ARTP技术可以快速有效地突变细菌、 微藻、真菌、酵母等微生物。
【发明内容】
[0004] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明提出了一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌 的筛选及其分析方法。
[0005] 本发明提出的一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，包括以下 步骤：
[0006] Sl，细菌培养:将甘油管中菌种划线接种到MRS固体培养基上，在36-38°C培养47-49h后，将菌种转接于MRS液体培养基，在36-38 °C下180r/min震荡需氧培养23-25h，在对数 末期获得菌体；
[0007] S2,诱变:在无菌条件下分别取培养后的菌液1.5mL于18个一次性小平板中，分别 作标签Imin，3min，5min，7min，9min，每个时间做3个平行，同时做3个空白对照，无菌条件 下，置于等离子体发生室诱变，诱变完成后，将相同时间的3个平行混合，每个时间取IOOyL 用于菌落计数，0.5mL用于菌种保存，取剩余Iml菌液进行铅吸附试验；
[0008] S3，一次筛选：采用48孔板高通量筛选方法，用牙签挑取诱变的单菌落于装有 1.0 mL培养液的48孔深孔板中，并接种出发菌株JTl-YB作为对照，并置于36-38°C的摇床培 养23-25h，待培养完成后，通过与JTl-YB比较48孔深孔板中变浑浊的初步判断为疑似突变 体菌株；
[0009] S4,二次筛选：将疑似突变体菌株分别均匀涂布于含有600mg/mL、800mg/mL、 1000mg/mL乙酸铅的MRS琼脂平板，同时接种出发菌株JTl-YB，培养23-25h后，挑去生长菌落 做铅吸附试验并保存菌种；
[0010] 35，生长状况分析:把菌株按1%接种量接种于?田直2.5、3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、 8.8的液体培养基中，37°C培养24h测定0D600nm，以pH为横坐标，OD值为纵坐标，绘制曲线图 进行分析；
[0011] S6，耐受胆盐分析:取0.1 ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%胆盐的液 体培养基中，36-38 °C培养23-25h，稀释后，对适当浓度进行涂布，记录生长情况；
[0012] S7，耐受消化酶分析:取菌液接种于含1 %胃蛋白酶的液体培养基中，以不添加蛋 白酶的液体培养基作对照，在36-38 °C条件下培养Oh、8h并且取样一次，对适当倍数的进行 平板计数，计算存活率。
[0013]优选地，所述Sl中，将甘油管中菌种划线接种至固体培养基上，在37°C培养48h 后，将菌种转接于MRS液体培养基，在37 °C下180r/min震荡需氧培养24h，在对数末期获得菌 体。
[0014] 优选地，所述S3中，I .OmL培养液内含400mg/mL乙酸铅。
[0015] 优选地，所述S6中，取0.1 ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%胆盐的液 体培养基中，37 °C培养24h，稀释后，对适当浓度进行涂布，记录生长情况。
[0016] 本发明中，将JTl-YB培养后用等离子设备进行诱变处理，控制变量以氩气为载气， 保持电压不变。由于它的工作气流量，电源功率，等离子体发射源与样品之间的距离等参数 是一定的，所以主要通过改变时间参数来进行诱变操作。把诱变后的菌液用铅溶液吸附后 用原子吸收分光光度计处理，通过与诱变前菌液的铅吸附能力对比可以直截了当的看出 最佳诱变时间。由于原子吸收分光光度计测得的是菌液吸附铅之后铅离子的浓度，所以铅 浓度越低表示铅吸附性越好，吸附能力越高。
[0017] 高通量筛选是获得目标突变株的主要步骤，它大大加快了筛选的进程。使用高通 量筛选方法可以简便、快速地进行几百个诱变株的筛选，增大了获得目标菌株的几率，并且 筛选结果的重复性高。根据出发菌株JTl-YB能在含有400g/mL的醋酸铅的MRS上生长，将诱 变菌落分别接种至含有400mg/mL醋酸铅的MRS肉汤中进行培养，根据测定结果，在诱变菌株 中，有168株诱变菌株均能生长。然后将生长的菌株在分别接种到含有600mg/mL、800mg/mL、 1000mg/mL乙酸铅平板，最后有30株突变体菌株能够耐受在含有1000mg/mL醋酸铅的MRS琼 脂平板上生长，比出发菌株JTl-YB(能在800mg/mL醋酸铅的MRS琼脂上生长)对铅的耐受力 提高了 1.25倍。
[0018] 本发明步骤清晰，操作简单，可以准确实现等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选 及其分析，适合推广。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明提出的一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法的菌 株生长状况曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
[0021] 本发明提出的一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，包括以 下步骤：
[0022] Sl，细菌培养:将甘油管中菌种划线接种到MRS固体培养基上，在36°C培养47h后， 将菌种转接于MRS液体培养基，在36 °C下180r/min震荡需氧培养23h，在对数末期获得菌体； [0023] S2,诱变:在无菌条件下分别取培养后的菌液1.5mL于18个一次性小平板中，分别 作标签Imin，3min，5min，7min，9min，每个时间做3个平行，同时做3个空白对照，无菌条件 下，置于等离子体发生室诱变，诱变完成后，将相同时间的3个平行混合，每个时间取IOOyL 用于菌落计数，0.5mL用于菌种保存，取剩余Iml菌液进行铅吸附试验；
[0024] S3，一次筛选：采用48孔板高通量筛选方法，用牙签挑取诱变的单菌落于装有 1.0 mL培养液的48孔深孔板中，并接种出发菌株JTl-YB作为对照，并置于36°C的摇床培养 23h，待培养完成后，通过与JTl-YB比较48孔深孔板中变浑浊的初步判断为疑似突变体菌 株；
[0025] S4,二次筛选：将疑似突变体菌株分别均匀涂布于含有600mg/mL、800mg/mL、 lOOOmg/mL乙酸铅的MRS琼脂平板，同时接种出发菌株JTl-YB，培养23h后，挑去生长菌落做 铅吸附试验并保存菌种；
[0026] S5，生长状况分析:把菌株按1 %接种量接种于pH值2.5、3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、 8.8的液体培养基中，37°C培养24h测定0D600nm，以pH为横坐标，OD值为纵坐标，绘制曲线图 进行分析；
[0027] S6，耐受胆盐分析:取0.1 ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%胆盐的液 体培养基中，36 °C培养23h，稀释后，对适当浓度进行涂布，记录生长情况；
[0028] S7，耐受消化酶分析:取菌液接种于含1 %胃蛋白酶的液体培养基中，以不添加蛋 白酶的液体培养基作对照，在36°C条件下培养0h、8h并且取样一次，对适当倍数的进行平板 计数，计算存活率。
[0029]本发明中，菌株和试剂包括:耐铅乳酸菌JT1-YB，由青岛农业大学食品风险分析与 防控实验室提供。MRS液体培养基;MRS固体培养基;LB肉汤;营养琼脂，购自北京陆桥技术有 限责任公司。乙酸铅，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
[0030] 主要试验设备与仪器包括：等离子发生器购自美国Dressier公司；Optima 8x00电 感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES)，美国PE公司；精密pH计，德国赛多利斯股份公司； PNP-9082电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；TGL-20bR型高速冷冻离心机，上海 安亭科学仪器厂;摩尔超纯水机，重庆摩尔水处理设备有限公司。
[0031] 研究具体方法包括：
[0032] (1)细菌的培养:将甘油管中菌种划线接种到MRS固体培养基上，37°C培养48h后， 将菌种转接于MRS液体培养基，37 °C下180r/min震荡需氧培养24h，在对数末期获得菌体(相 应的细胞计数为6.0 X IO8CFlVmL);
[0033] (2)最佳诱变时间的确定:在无菌条件下分别取培养后的菌液1.5mL于18个一次性 小平板中，分别作标签Imin，3min，5min，7min，9min，每个时间做3个平行，同时做3个空白对 照。无菌条件下，置于等离子体发生室诱变。诱变完成后，将相同时间的3个平行混合，每个 时间取IOOyL用于菌落计数，0.5mL用于菌种保存，取剩余Iml菌液进行铅吸附试验；
[0034] (3)高通量筛选突变体菌株:为了实现快速筛选出吸附能力高的突变菌体，利用48 孔板高通量筛选方法。用牙签挑取诱变的单菌落于装有I.OmL培养液(含400mg/mL乙酸铅） 的48孔深孔板中，并接种出发菌株JTl-YB作为对照，并置于37°C的摇床培养24h。待培养完 成后，通过与JTl-YB比较48孔深孔板中变浑浊的初步判断为疑似突变体菌株；
[0035] (4)突变体菌株的复选:利用高通量筛选方法可以初步筛选出铅吸附能力提高的 突变体。要获得吸附性提高的菌株，要进行重发筛选。将上述生长的细菌分别均匀涂布于含 有600mg/mL、800mg/mL、lOOOmg/mL乙酸铅的MRS琼脂平板，同时接种出发菌株JTl-YB，培养 24h后，挑去生长菌落做铅吸附试验并保存菌种；
[0036] (5)突变体菌株不同pH条件下的生长状况：把菌株按1 %接种量接种于pH值2.5、 3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、8.8的液体培养基中，37°C培养24h测定0D600nm，以pH为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制曲线并分析；
[0037] (6)突变体菌株耐受胆盐实验：取0.1ml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%， 0.8 %胆盐的液体培养基中，37 °C培养24h，稀释后，对适当浓度进行涂布，记录生长情况。
[0038] (7)突变体菌株耐受消化酶实验:取菌液接种于含1%胃蛋白酶的液体培养基中， 以不添加蛋白酶的液体培养基作对照，在37 °C条件下培养Oh、8h并且取样一次，对适当倍数 的进行平板计数，计算存活率。
[0039]将JTl-YB培养后用等离子设备进行诱变处理，控制变量以氩气为载气，保持电压 不变。由于它的工作气流量，电源功率，等离子体发射源与样品之间的距离等参数是一定 的，所以主要通过改变时间参数来进行诱变操作。把诱变后的菌液用铅溶液吸附后用原子 吸收分光光度计处理，通过与诱变前菌液的铅吸附能力对比可以直截了当的看出最佳诱变 时间。由于原子吸收分光光度计测得的是菌液吸附铅之后铅离子的浓度，所以铅浓度越低 表示铅吸附性越好，吸附能力越高，吸附铅后铅离子的浓度结果见下表： LUU41 j 上表中，Pbl为测得酷酸钳浴淞浓度，
的钳吸附浓度，Pb3和Pb473处埋时丨日J Imin的菌液，Pb5和Pb6为处理时间3min的菌液，Pb7和Pb8为处理时间5min的菌液，Pb9和 PblO为处理时间7min的菌液，Pbll和Pbl2为处理时间9min的菌液。由于醋酸铅为弱电解 质，所以测得醋酸铅溶液Pbl仅为68.12mg/ml，上述实验证明，诱变时间为7min时，铅吸附能 力最强，为最佳诱变时间。
[0042]高通量筛选是获得目标突变株的主要步骤，它大大加快了筛选的进程。使用高通 量筛选方法可以简便、快速地进行几百个诱变株的筛选，增大了获得目标菌株的几率，并且 筛选结果的重复性高。根据出发菌株JTl-YB能在含有400g/mL的醋酸铅的MRS上生长，将诱 变菌落分别接种至含有400mg/mL醋酸铅的MRS肉汤中进行培养，根据测定结果，在诱变菌株 中，有168株诱变菌株均能生长。然后将生长的菌株在分别接种到含有600mg/mL、800mg/mL、 1000mg/mL乙酸铅平板，最后有30株突变体菌株能够耐受在含有1000mg/mL醋酸铅的MRS琼 脂平板上生长，比出发菌株JTl-YB(能在800mg/mL醋酸铅的MRS琼脂上生长)对铅的耐受力 提高了 1.25倍。进一步做铅吸附试验发现，30株突变体菌株有一株的铅吸附能力提高明显， 命名为Rl，30个单菌落吸附铅离子后铅的浓度结果见下表：
[0045] 其中PbO为醋酸铅溶液，Pbl为JTl-YB吸附铅的浓度，Pb2-Pb32为30个单菌落经培 养后吸附铅的浓度。
[0046]菌株的耐酸特性:pH不同条件下，随着pH增大，细菌生长变快，当pH> 6.5时，速度 减缓，逐渐下降，其耐酸性数据如图1，据此判定菌株的最适PH为6.5。
[0047] 胆盐耐受实验：菌株在0.3%、0.5%、0.7%、0.9%胆盐的液体培养基中24h，经过 适当倍数记录细菌生长状况，结果表明该菌株可以耐受0.8%胆盐，能够顺利到达肠道发挥 作用。
[0048] 消化酶耐受实验:与不含胰蛋白酶的对照组相比，突变体Rl菌株在含0.1 %胰蛋白 酶的液体培养基中生长良好，说明菌株可以在一定浓度的胰蛋白酶环境下正常生长。
[0049] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0050] 生物样品保藏信息：
[0051 ]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0052]保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 [0053] 保藏日期：2015年12月28日
[0054] 保藏编号：CGMCC NO.11944
[0055] 分类命名：屎肠球菌Enterococcus faecium。
【主权项】
1. 一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，其特征在于，包括以下步 骤： S1，细菌培养:将甘油管中菌种划线接种到MRS固体培养基上，在36-38°C培养47-49h 后，将菌种转接于MRS液体培养基，在36-38 °C下180r/min震荡需氧培养23-25h，在对数末期 获得菌体； S2,诱变:在无菌条件下分别取培养后的菌液1.5mL于18个一次性小平板中，分别作标 签lmin，3min，5min，7min，9min，每个时间做3个平行，同时做3个空白对照，无菌条件下，置 于等离子体发生室诱变，诱变完成后，将相同时间的3个平行混合，每个时间取lOOyL用于菌 落计数，0.5mL用于菌种保存，取剩余lml菌液进行铅吸附试验； S3，一次筛选:采用48孔板高通量筛选方法，用牙签挑取诱变的单菌落于装有1. OmL培 养液的48孔深孔板中，并接种出发菌株JT1-YB作为对照，并置于36-38°C的摇床培养23-25h，待培养完成后，通过与JT1-YB比较48孔深孔板中变浑浊的初步判断为疑似突变体菌 株； 34，二次筛选:将疑似突变体菌株分别均勾涂布于含有60〇11^/1111^、80〇11^/111]^、100〇11^/1111^ 乙酸铅的MRS琼脂平板，同时接种出发菌株JT1-YB，培养23-25h后，挑去生长菌落做铅吸附 试验并保存菌种； S5，生长状况分析:把菌株按1 %接种量接种于pH值2.5、3.6、4.2、5.8、6.6、7.2、8.8的 液体培养基中，37°C培养24h测定0D600nm，以pH为横坐标，0D值为纵坐标，绘制曲线图进行 分析图进行分析； S6，耐受胆盐分析:取0. lml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%胆盐的液体培 养基中，36-38 °C培养23-25h，稀释后，对适当浓度进行涂布，记录生长情况； S7,耐受消化酶分析:取菌液接种于含1%胃蛋白酶的液体培养基中，以不添加蛋白酶 的液体培养基作对照，在36-38°C条件下培养0h、8h并且取样一次，对适当倍数的进行平板 计数，计算存活率。2. 根据权利要求1所述的一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，其 特征在于，所述S1中，将甘油管中菌种划线接种到MRS固体培养基上，在37 °C培养48h后，将 菌种转接于MRS液体培养基，在37 °C下180r/min震荡需氧培养24h，在对数末期获得菌体。3. 根据权利要求1所述的一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，其 特征在于，所述S3中，1 .OmL培养液内含400mg/mL乙酸铅。4. 根据权利要求1所述的一种等离子体正向诱变耐铅乳酸菌的筛选及其分析方法，其 特征在于，所述S6中，取0. lml菌液接在含0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%胆盐的液体培养 基中，37°C培养24h，稀释后，对适当浓度进行涂布，记录生长情况。
【文档编号】C12N13/00GK105861481SQ201610051673
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年1月26日
【发明人】都启晶
【申请人】青岛农业大学