基于眼镜蛇毒piii型金属蛋白酶的溶栓药及其应用
【专利摘要】基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟山种眼镜蛇，分类名：Naja atra的蛇毒中分离纯化获得；所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解析表明具有3个结构域：金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇毒金属蛋白酶。其名称分别为Atrase A和Atrase B，其序列为：AtraseA：SEQ ID No.1；AtraseB：SEQ ID No.2。目标蛋白和其溶栓药能诱导内源性纤溶酶原激活剂tPA释放从而具有溶栓作用，可用于血栓性疾病的溶栓治疗。
【专利说明】
基于眼镜蛇毒PM I型金属蛋白酶的溶栓药及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的应用领域，特别涉及一种基于眼镜蛇毒 PIII型金属蛋白酶的溶栓药及其应用。
【背景技术】
[0002] 心脑血管疾病是现代社会中的高发危重病，死亡率居高不下，严重威胁人类生命 健康。其中，血栓性疾病的危害最为严重，临床上以急性心肌梗死、缺血性脑卒中、急性肺栓 塞为主要表现，其发病率、致残率、致死率较高。近30年来，溶栓疗法已广泛用于各种血管栓 塞性疾病的治疗，取得了显著的效果，已成为治疗血栓性疾病的有效手段。我国是人口大 国，随着社会经济发展，心脑血管疾病发病率日趋增高，已成为威胁人民生命健康的主要疾 病。目前国内临床使用的溶栓药物尤其是高端药物均为国外研究开发，国内多以跟踪研究 和仿制为主。在欧美等西方发达国家，目前临床使用的溶栓药以第二代药物重组组织性纤 溶酶原激活剂rt_PA(recombinant tissue type plasminogen activator,rt_PA)为主，其 价格昂贵，国内难以普及，导致目前国内临床上使用的主力溶栓药物仍以第一代溶栓药尿 激酶(urokinase，UK)为主。国内迫切需要研发自主创新的新型溶栓药以打破国外垄断。基 于溶栓药物有较大的社会现实需求和广阔的市场前景，以及目前已有的溶栓药物总体上仍 存在特异性不高、半衰期短、出血危险等缺点，寻找、发现和研发具有自主知识产权的溶栓 效果好、副作用小的新型溶栓药物符合国家在健康领域内的战略需求，具有重要的社会经 济意义和价值。
[0003] 溶栓药物的研究开发一直是国际上药物研究的热点。目前一般将溶栓药物分为三 代。第一代以链激酶(streptokinase, SK)和UK为代表。这一类药的主要缺点在于对纤维蛋 白没有选择性或选择性较低，可引起全身性纤溶激活和出血危险。UK目前仍是国内的主力 溶栓药。第二代以组织性纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,t-ΡΑ)为 代表。采用基因工程技术可获得重组的rt-PA。该药对纤维蛋白的选择性较好，但临床上为 获得较好的溶栓效果而大剂量使用时，会失去对纤维蛋白的选择性，导致纤溶过强，引发出 血。该药半衰期短，只有3-4分钟。在欧美等发达国家，rt-PA已成为主流溶栓药。其价格昂 贵，国内目前尚无法普及。目前，国内外均在发展第三代溶栓药，包括酰基化纤溶酶原-链激 酶活化复合物(APSAC)、重组单链尿激酶(rscu-PA)、葡萄球菌激酶(Sak)以及从南美吸血蝙 蝠中提取得到的纤溶酶原激活剂(Bat)，其中部分已进入临床试验。
[0004] 目前临床上常用的溶栓药均为纤溶酶原激活剂，且已上市和在研的溶栓药物全部 为属于丝氨酸蛋白酶的蛋白质药物。
[0005] 蛇毒是天然的最复杂的毒蛋白混合物。蛇毒中含有结构功能多样的以心血管系统 为靶标的活性蛋白，已成为现代新药及临床诊断试剂研究开发的重要资源库。国外于20世 纪60年代以来陆续研究开发了作用于血液系统的蛋白酶制剂，如从马来西亚红口蝮蛇毒分 离的蛋白酶安克洛酶(Ancrod)、从巴西矛头複蛇毒中分离制备的巴曲酶(batroxobin)以及 日本东菱克栓酶(batroxobin)。国内从上世纪70年代末开始，积极开展了这方面的研究工 作。先后从蝮蛇毒和尖吻蝮蛇毒中分离纯化出相关的纤溶酶。目前，国内批准了2种蛇毒制 剂进入临床使用：一是降纤酶，是从我国东北长白山产白眉蝮蛇蛇毒和江浙产蝮蛇毒中分 离纯化获得的凝血酶样酶；另一种是蕲蛇酶，是从尖吻蝮蛇毒(五步蛇）中分离纯化获得的 凝血酶样酶。这类酶制剂用于血栓性疾病防治的机制在于它们可以降解纤维蛋白原、改善 血液流变学的作用以及纤溶作用。另外，这类降纤酶在体内降解纤维蛋白原的产物能激发 血管内皮细胞释放t-PA，将纤溶酶原转变为纤溶酶，从而促进纤溶作用。上述国内外开发的 蛇毒降纤酶均属于蛇毒丝氨酸蛋白酶。
[0006] 本发明涉及基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药及其应用。蛇毒金属蛋白酶 (snake venom metalloproteinase，SVMP)属于金属蛋白酶M12家族Reprolysin成员，主要 存在于蝰科和响尾蛇科蛇毒中，其结构中共有的显著特点是在酶的活性中心含有一段 "HEXGHXXGXXHD"的保守序列，锌离子与该保守区结合。SVMP的显著毒性特征是具有出血毒 性，多具有水解细胞基底膜和细胞外基质、抗凝、促凝、抗血小板聚集等活性，在血循毒类蛇 毒的毒性作用中扮演了重要角色。根据分子量大小和所含结构域数目可以将蛇毒金属蛋白 酶分为4类:PI型蛇毒金属蛋白酶仅含有一个金属蛋白酶结构域;PII型含有一个金属蛋白 酶结构域和一个去整合素或类去整合素结构域;ΡΠΙ型比PII型多一个富含半胱氨酸结构 域，而PIV型在C端还存在第四个结构域-C型凝集素样结构域。
[0007] 迄今为止，从不同种的眼镜蛇毒中分离纯化出不多的SVMP，如atrahagin、 mocarhagin、kaouthiagin、NN_PF3等。总体上，由于眼镜蛇毒没有表现出明显的蛋白水解酶 的活性，因此，针对眼镜蛇毒中的SVMP开展的研究不多。这些从眼镜蛇毒中获得的纤溶酶或 SVMP多数都能水解纤维蛋白原的α链，并都表现出抗血小板聚集的活性研究，其抗血小板聚 集的主要机制为酶切血小板膜糖蛋白GPIb或vWF，这些蛋白质分子有可能成为抗血小板聚 集或降纤维蛋白原的潜在药物分子，而在针对溶栓方面都没有进行研究和报道。从蝰科和 响尾蛇科蛇毒中分离制备获得的SVMP由于其固有的出血毒性，使其无法用于相关药物的制 备。
[0008] 本案中的眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶Atrase A和Atrase B是目前从舟山种眼镜 蛇(Naja atra，中华眼镜蛇)蛇毒中经分离纯化获得的仅有的2个经过结构解析鉴定的PIII 型金属蛋白酶，对其序列结构的测定和分析表明，A t r a s e A和A t r a s e B由 metalloproteinase domain、Disintegrin_like domain和Cysteine-rich domain三个结 构域组成。Atrase A和Atrase B除具有显著的抗血小板聚集和抗凝活性外，具有显著的溶 栓特性是其它眼镜蛇毒金属蛋白酶或蛇毒纤溶酶所不具备的。其在低剂量时即能有效溶 栓，效果优于阳性对照药UK和rt-PA。其机制在于通过作用补体而诱导了内源性t-PA的释 放，从而激活纤溶酶原，高效溶栓。并且在其Cysteine-rich domain和Disintegrin_like domain中分别含有能与血栓部位活化血小板GPIIb/IIIa受体特异识别的R⑶和类R⑶序列， 具有靶向溶栓的结构基础。目标蛋白具有机制新颖的溶栓活性和有效抑制血小板聚集和显 著抗凝的多重功效以及靶向溶栓的结构，这些特点与新一代溶栓药物研发的方向与趋势相 吻合，使其作为溶栓药物具备了独特的结构与功效优势，以目标蛋白制备溶栓药，具有其它 蛇毒金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶所不具备的独特优点。
【发明内容】
[0009] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供基于眼镜蛇毒PIII型金 属蛋白酶的溶栓药及其应用。
[0010] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0011] 基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟山种眼镜 蛇，分类名:Naja atra的蛇毒中分离纯化获得;所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解析表明具 有3个结构域:金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇 毒金属蛋白酶。
[0012] 进一步的，所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，其名称分别为Atrase A和 Atrase B，其中Atrase A推导分子量为46717.14,等电点为7.281;Atrase B推导分子量为 44749.39，等电点为7.238;两序列的核苷酸相似度为85.9 %，氨基酸相似度为65.4 %，其序 列为：AtraseA:SEQIDNo. I ;AtraseB:SEQIDNo.2;
[0013] 进一步的，所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶具有水解纤维蛋白原α链的活性， 该活性能被金属螯合剂EDTA、EGTA、1，ΙΟ-phenanthroline和还原剂DTT完全抑制；目标蛋白 Atrase A和Atrase B的精确分子质量分别为49.3kDa和49.4kDa，但其表观分子量依据不同 的测定方法有所不同，范围在45kDa_65kDa之间:Atrase A在还原性和非还原性SDS-PAGE中 分别为64.6和57. IkDa，凝胶过滤方法测定为56.5kDa; Atrase B在还原性和非还原性SDS-PAGE中分别为62.2和55.8kDa，凝胶过滤方法测定为54.3kDa。等点聚焦的测定结果表明，变 性条件下目标蛋白Atrase A和Atrase B的等电点分别为9.6和9.7,目标蛋白没有水解酪蛋 白活性，也没有精氨酸酯酶活性和纤维蛋白水解活性；目标蛋白含有糖基，其中性糖含量为 5%〇
[0014] 基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药，其由上述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋 白酶添加其他助剂制成的冻干粉针剂。
[0015] 进一步的，所述溶栓药由下述组分组成：眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶、磷酸钠、精 氨酸、吐温80。
[0016] 进一步的，所述溶栓药冻干粉针剂复溶后由下述组分组成:pH为7.4的0.0 lM磷酸 钠缓冲液〇.5ml中含有基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶纯化样品0.5mg、质量分数为0.15% 的精氨酸、质量分数为〇. 01 %的吐温80。
[0017] 进一步的，所述眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶在制备溶栓药中的应用。
[0018] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0019] 本发明目标蛋白和其溶栓药具有明显的溶栓作用:通过诱导内源性纤溶酶原激活 剂tPA释放从而产生明显的溶栓作用。目标蛋白通过诱导内源性纤溶酶原激活剂tPA释放从 而产生溶栓作用的机制，并且基于其结构特征具有血栓靶向性。可用于血栓栓塞性疾病或 相关病理情况下血栓生成的治疗，没有出血风险，溶栓作用显著。
【附图说明】
[0020] 图1目标蛋白（AtraseA与AtraseB)的一级结构；
[0021] 图2目标蛋白的SDS-PAGE电泳；
[0022] 其中：泳道1和4分别为非还原和还原条件下的Atrase B，泳道2和5分别为非还原 和还原条件下的Atrase A，泳道3为标准分子量蛋白；
[0023] 图3变性条件下的目标蛋白等电聚焦;其中：泳道1为Atrase A，泳道2为Atrase B;
[0024] 图4目标蛋白Atrase A的纯化制备；其中：A.SP Sephadex C-25层析;B·Sephacryl S-200层析；C.HiTrap Heparin HP层析；
[0025] 图5目标蛋白Atrase B的纯化制备；其中，A· SP Sephadex C-25层析；B ·HiTrap !feparin HP层析；C.HiTrap Q HP层析;D.HiTrap SP HP层析；
[0026] 图6溶栓药对内皮细胞纤溶功能分子释放的影响图；其中，A: V〇.〇5，、〈〇.01，与 Blank相比；#p〈0 · 05，##p〈0 · 01，与Ih组相比；B:*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，与Blank相比；#p〈0 · 05，##p 〈0.01，与Ih组相比；*p〈0.05 广p〈0.01，与Blank相比；#p〈0.05，##p〈0.01，与Ih组相比；
[0027]图7溶栓药对内皮细胞纤溶活性的影响；其中:A:*p〈〇.〇5广p〈〇.〇1，与(Atrase A+ INHS)组相比；#p〈0 · 05，##p〈0 · 01，与Blank相比；B:*p〈0 · 05，**p〈0 · 01，与（Atrase A+INHS)组 相比；(：:*?〈0.05，、〈0.01，与81&吐相比；
[0028] 图8低剂量溶栓药对大鼠体内纤溶活性的影响图，其中乍〈0.05，#P〈0.01，与 control 相比；
[0029] 图9高剂量溶栓药对大鼠体内纤溶活性的影响图，其中乍〈0.05，#P〈0.01，与 control 相比；
[0030] 图10溶栓药对大鼠颈总动脉血栓的溶栓作用图，其中，P〈0.001，模型组与假手术 组相比;P〈〇. 001，低剂量组与模型组相比；P〈〇. 05,高剂量组与低剂量组相比;P〈0.01，低剂 量组与阿替普酶组相比；P〈〇. 001，高剂量组与阿替普酶组相比；P〈〇. 001，阿替普酶组与尿 激酶组相比。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0032] 实施例1:
[0033] 目标蛋白是从中华眼镜蛇(舟山种眼镜蛇）（分类名：Naja atra)蛇毒中分离纯化 获得。目标蛋白是单链糖蛋白，结构解析表明具有3个结构域:金属蛋白酶结构域、去整合素 样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇毒金属蛋白酶(图1)。
[0034] 表1根据一级结构推导的目标蛋白相关理化指标
[0036]如表1所示：目标蛋白具有水解纤维蛋白原α链的活性，该活性能被金属螯合剂 EDTA、EGTA、l，l〇-phenanthroline和还原剂DTT完全抑制。目标蛋白Atrase A和Atrase B的 实际分子量分别约为49.3kDa和49.4kDa，其序列为：AtraseA : SEQIDNo . I; AtraseB : SEQIDNo. 2;但依据不同的测定方法其表观分子量有所不同，范围在45kDa-65kDa之间 (Atrase A在还原性和非还原性SDS-PAGE中分别为64.6和57. IkDa(图2)，凝胶过滤方法测 定为56.5kDa;Atrase B在还原性和非还原性SDS-PAGE中分别为62.2和55.8kDa(图2)，凝胶 过滤方法测定为54.3kDa)。等点聚焦的测定结果表明，变性条件下目标蛋白Atrase A和 Atrase B的等电点分别为9.6和9.7(图3)。目标蛋白没有水解酪蛋白活性，也没有精氨酸酯 酶活性和纤维蛋白水解活性。目标蛋白含有糖基，其中性糖含量约为5 %。
[0037]目标蛋白Atrase A的分离纯化
[0038]眼镜蛇(Naja atra)粗毒溶解于pH 5.8、20mmol/L的乙酸钠缓冲液，将此溶液上样 于已用同样缓冲液平衡好的SP Sephadex C-25coIumn(2.6 X 40cm)层析柱，用同样的缓冲 液以30ml/h的流速进行洗脱，将未吸附在柱上的蛋白完全洗脱后，进行同样缓冲液的NaCl 线性梯度洗脱(Ο-lmol/L)(图4A)。
[0039]收集上述穿过峰中具有纤维蛋白原水解活性的部分 200column(2 ·6 X IlOcm)进行分子筛凝胶层析，以pH 7 · 4、含0 · lmol/L NaCl的 10mmol/L磷 酸盐缓冲液在20ml/h的流速下进行层析柱的平衡和洗脱（图4B)。
[0040] 收集分子筛层析中具有纤维蛋白原水解活性的部分，合并，超滤，将缓冲液更换为 pH 7.0、lOmmol/L的磷酸盐缓冲液，然后上样到已用同样缓冲液平衡好的HiTrap Heparin HP C〇lumn(5ml)肝素亲和层析柱，将未吸附在柱上的蛋白完全洗脱后，进行同样缓冲液的 NaCl线性梯度洗脱(0-0.5mol/L)，收集最后一个洗脱峰，即为目标蛋白Atrase A(图4C)。制 备的目标蛋白在还原和非还原SDS-PAGE以及等电聚焦中均为一条带。
[0041] 收集上述肝素亲和层析中具有纤维蛋白原水解活性的部分，合并，超滤，将缓冲液 更换为pH 7.4、10mmol/L的磷酸盐缓冲生理盐水，测定蛋白含量，低温冻存备用。
[0042] 目标蛋白Atrase B的分离纯化
[0043]眼镜蛇(Naja atra)粗毒溶解于pH 5.8、20mmol/L的乙酸钠缓冲液，将此溶液上样 于已用同样缓冲液平衡好的SP Sephadex C-25coIumn(2.6 X 40cm)层析柱，用同样的缓冲 液以30ml/h的流速进行洗脱，将未吸附在柱上的蛋白完全洗脱后，进行同样缓冲液的NaCl 线性梯度洗脱(Ο-lmol/L)(图5A)。
[0044]收集SP Sephadex C-25层析梯度洗脱部分中具有纤维蛋白原水解活性的组分，合 并，超滤，将缓冲液更换为pH 7.0、10mmol/L的磷酸盐缓冲液，然后上样到已用同样缓冲液 平衡好的HiTrap Heparin HP column(5ml)肝素亲和层析柱，将未吸附在柱上的蛋白完全 洗脱后，进行同样缓冲液的NaCl线性梯度洗脱(0-0.6mol/L)，收集最后一个洗脱峰（图5B)。 [0045]将上述肝素亲和层析中收集的的洗脱峰合并液的缓冲液更换为pH8.9的25mM Tris-HCl缓冲液，然后上样到已用同样缓冲液平衡好的HiTrap Q HP层析柱（Iml)，将未吸 附在柱上的蛋白完全洗脱后，进行同样缓冲液的NaCl线性梯度洗脱(0-0.5mol/L)，收集梯 度洗脱的第一个大峰(图5C)。
[0046]将上述HiTrap Q HP层析中收集的洗脱峰合并液的缓冲液更换为pH 7.0的IOmM磷 酸盐缓冲液，然后上样到已用同样缓冲液平衡好的HiTrap SP HP层析柱（lml)，将未吸附在 柱上的蛋白完全洗脱后，进行同样缓冲液的NaCl梯度洗脱（0-0.5mol/L):依次进行0-0.2mol/L的梯度洗脱、0.2mol/L的水平洗脱和0.3mol/L的水平洗脱，收集最后一个洗脱峰， 即为目标蛋白Atrase B(图f5D)。制备的目标蛋白在还原和非还原SDS-PAGE以及等电聚焦中 均为一条带。
[0047]将目标蛋白合并液进行超滤浓缩，并将缓冲液更换为pH 7.4的PBS后，测定蛋白含 量，低温冻存备用。
[0048] 制剂
[0049] 将纯化的样品按注射用粉针剂的生产技术要求制备成溶栓药冻干粉针剂。所述溶 栓药规格为〇. 5mg/支，由下述组分组成:所述溶栓药冻干粉针剂复溶后由下述组分组成:pH 为7.4的0.0謂磷酸钠缓冲液0.51111中含有基于眼镜蛇毒？111型金属蛋白酶纯化样品0.511^、 质量分数为〇. 15 %的精氨酸、质量分数为0.01 %的吐温80。
[0050] 本发明目标蛋白和其溶栓药具有明显的溶栓作用:通过诱导内源性纤溶酶原激活 剂tPA释放从而产生明显的溶栓作用。目标蛋白通过诱导内源性纤溶酶原激活剂tPA释放从 而产生溶栓作用的机制，并且基于其结构特征具有血栓靶向性。可用于血栓栓塞性疾病或 相关病理情况下血栓生成的治疗，没有出血风险，溶栓作用显著。
[0051 ] 实施例2:
[0052] 1.眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶诱导内皮细胞纤溶功能上调的作用（以Atrase A为 例）
[0053] 1.1材料与试剂
[0054] 人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMEC);RPMI-1640培养基购自Gibco;胎牛血清（fetal bovine serum，FBS)为天津灏洋生物制品科技有 限公司产品；t-PA(tissue plasminogen activator)、PAI-1 (plasminogen activator inhibitor)含量检测ELISA试剂盒和活性测定试剂盒购自美国Assaypro公司；正常人血清 (normal human serum，NHS)由多名健康志愿者献血制备而成，分装后冻存于_80°C，经补体 活性检测正常，备用；灭活人血清（inactivated normal human serum，INHS)由NHS于56°C 孵育30min而得;Atrase A的分离纯化制备同前;其余试剂均为符合实验要求的分析纯。
[0055] 1.2方法
[0056] 将NHS、Atrase A和无血清1640以3: 2:10的比例混合，37°C孵育1.5h，制备孵育混 合物，备用。将HMEC以I X IO4个/孔接种于96孔细胞培养板，24h后弃上清，用无 FBS的1640洗 一遍，加入150ul孵育混合物，再加入50ul含血清1640培养液。实验同时设置有INHS+Atrase A孵育对照组、NHS对照组、INHS对照组、Atrase A对照组以及空白对照组。各组于加样后Ih、 6h、12h取细胞上清，3000r/min离心10min，取上清，-80 °C冻存。细胞培养上清中t-PA、PAI-l 的含量和活性按试剂盒说明书操作。
[0057] 1.3统计学分析
[0058] 实验数据以^土丨表示。采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，组间多重比较采 用LSD法。
[0059] 1.4结果
[0060] Atrase A与NHS的孵育物能明显上调HMEC释放t-PA和PAI-I，衡量纤溶活性的t-PA/PAI-1明显上调（图6)。发色底物法测定的结果也表明Atrase A与NHS的孵育物能使纤溶 活性明显上调（图7)。实验结果表明，HMEC纤溶功能的上调与目标蛋白对补体的作用有关。 [0061 ] 实施例2:
[0062] 1.眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶对大鼠体内纤溶功能的影响（以Atrase A为例）
[0063] 1.1实验材料
[0064]溶栓药Atrase A的制备同前；t-PA、PAI-I、PAP检测试剂盒；其它试剂均为符合实 验要求的试剂或药品。
[0065] SPF级雄性SD大鼠购自重庆腾鑫实验动物有限公司，体重250-280g，合格证号 SCXK(渝)2007-0005。动物实验和动物福利符合相关动物实验管理条例。实验动物饲养于清 洁、恒温、恒湿的环境中，实验前均自由进食和进水。
[0066] 1.2实验分组
[0067] 动物随机分组。低剂量组分为对照组、2h、6h、12h和24h组，中剂量组分为对照组、 2h、6h、12h、24h、48h、72h、96h组，高剂量组分为对照组、2h、6h、12h、24h、48h、120h、196h组。 低剂量组和中剂量组中的每组均为10只大鼠，高剂量组中每组为6只大鼠。
[0068] 1.3血样采集
[0069] 按照设计的剂量将样品通过尾部静脉注射给大鼠。根据不同组别的采集标本时间 要求，提前20min用1 %戊巴比妥钠麻醉大鼠后，打开腹腔，通过腹主动脉采集血样，用 0.109mol/L枸橡酸钠按1:9比例进行抗凝。
[0070] 1.4纤溶功能的测定
[0071 ] 将取得的抗凝血以3000r/min离心15min，取上清，得到血衆，分装冻存于-80°C，备 用。按照t-PA、PAI-l、PAP检测试剂盒说明书测定各血浆标本的t-PA、PAI-l、PAP。
[0072] 1.5统计学分析
[0073] 实验数据以^±1表示。采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，组间多重比较采 用LSD法。
[0074] 1.6结果
[0075] 低剂量溶栓药(0.3mg/kg)能明显上调大鼠体内t-PA的释放，对PAI-I没有影响（图 8);高剂量溶栓药(3. Omg/kg)能明显上调大鼠体内t-PA和PAI-1 (图9)。PAP的上调表明了大 鼠体内纤溶活性的激活和上调。
[0076] 实施例3:
[0077] 1.眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶体内溶栓的药效作用（以Atrase A为例）
[0078] 1.1实验材料
[0079]溶栓药Atrase A的制备同前，SDS-PAGE检测纯度为电泳单一条带，纯化的样品分 装冻存于-80°C ;阿司匹林购自美国Sigma公司；尿激酶(urokinase，UK)为丽珠集团丽珠制 药厂产品；重组人组织型纤溶酶原激活剂阿替普酶(rt-PA)为德国Boehringer Ingelheim 公司产品；其它试剂均为符合实验要求的试剂或药品。
[0080] SPF级雄性SD大鼠购自重庆腾鑫实验动物有限公司，重量210-240g，合格证号SCXK (渝)2007-0005。动物实验和动物福利符合相关动物实验管理条例。实验动物饲养于清洁、 恒温、恒湿的环境中，实验前均自由进食和进水。
[0081 ] 1.2实验分组和方法
[0082] 大鼠随机分为假手术组（sham)、模型组(model)、尿激酶组和rt-PA组以及Atrase A高、低剂量组，各组8只。采用大鼠颈总动脉血栓模型，以尿激酶和rt-PA为阳性对照药，评 价目标蛋白的溶栓作用。尿激酶组（10万U/kg)和rt-PA组（10mg/kg)以及Atrase A高低剂量 组(3.0mg/kg、0.3mg/kg)在造模后30min，通过尾静脉一次性注射给药。给药后1.5h，通过右 侧颈总动脉采血，枸橡酸钠抗凝，抗凝血以3 000r/min离心15min，制备抗凝血衆，用于测定 t-PA、PAP等指标。取血完毕，迅速剪下左侧颈总动脉血栓部位血管，放于滤纸上吸干残血， 以电子分析天平测定其重量。
[0083] 1.3统计学分析
[0084] 实验数据以表示。采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，组间多重比较采 用LSD法。
[0085] 1.4结果
[0086] 低剂量溶栓药即能有效溶栓，高剂量能进一步增强溶栓的效果，效果均优于阳性 对照药UK和rt-PA(图10)。
[0087] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1. 基于眼镜蛇毒Pin型金属蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟 山种眼镜蛇，分类名:Naja atra的蛇毒中分离纯化获得;所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解 析表明具有3个结构域:金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于 PIII型蛇毒金属蛋白酶。2. 根据权利要求1所述的基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，其特征在于，所述基于眼镜 蛇毒PIII型金属蛋白酶，其名称分别为Atrase A和Atrase B，其中Atrase A推导分子量为 46717.14,等电点为7.281 ;Atrase B推导分子量为44749.39,等电点为7.238;两序列的核 苷酸相似度为85 · 9 %，氨基酸相似度为65 · 4 %，其序列为:AtraseA: SEQ ID No · 1; AtraseB: SEQ ID Νο·2〇3. 根据权利要求2所述的基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，其特征在于，基于眼镜蛇毒 PIII型金属蛋白酶，其特征在于，所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶具有水解纤维蛋白 原α链的活性，该活性能被金属螯合剂EDTA、EGTA、1，ΙΟ-phenanthroline和还原剂DTT完全 抑制；目标蛋白Atrase A和Atrase B的精确分子质量分别为49.3kDa和49.4kDa，但依据不 同的测定方法其表观分子量有所不同，范围在45kDa-65kDa之间:Atrase A在还原性和非还 原性SDS-PAGE中分别为64.6和57. lkDa，凝胶过滤方法测定为56.5kDa; Atrase B在还原性 和非还原性SDS-PAGE中分别为62.2和55.81^)&，凝胶过滤方法测定为54.31^) &。等点聚焦的 测定结果表明，变性条件下目标蛋白Atrase A和Atrase B的等电点分别为9.6和9.7,目标 蛋白没有水解酪蛋白活性，也没有精氨酸酯酶活性和纤维蛋白水解活性；目标蛋白含有糖 基，其中性糖含量为5 %。4. 权利要求1-3任一所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药，其特征在于，其由 上述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶添加其他助剂制成的冻干粉针剂。5. 根据权利要求4所述的基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药，其特征在于，所述 溶栓药由下述组分组成:基于眼镜蛇毒PII I型金属蛋白酶，磷酸钠、精氨酸、吐温80。6. 根据权利要求4所述的基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药，其特征在于，所述 溶栓药冻干粉针剂复溶后由下述组分组成:pH为7.4的0.01M磷酸钠缓冲液0.5ml中含有基 于眼镜蛇毒ΡΠΙ型金属蛋白酶纯化样品0.5mg、质量分数为0.15%的精氨酸、质量分数为 0.01 %的吐温80。7. 基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶在制备溶栓药中的应用。
【文档编号】A61K38/48GK105861476SQ201610305798
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】孙黔云, 王彩娥, 李红玲, 李亚男
【申请人】贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室