通过基因工程改造获得的高活性甘露聚糖酶及其突变位点的制作方法
【专利摘要】本发明公开了通过基因工程改造获得的高活性甘露聚糖酶及其突变位点，该甘露聚糖酶氨基酸序列为将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第221、301和122位中至少一位氨基酸取代修饰后的氨基酸序列，其中第221位氨基酸由亮氨酸取代修饰为异亮氨酸，第301位氨基酸由赖氨酸取代修饰为谷氨酸，第122位氨基酸由谷氨酰胺取代修饰为精氨酸。本发明通过基因工程改造后大幅度提高甘露聚糖酶的酶活。
【专利说明】
通过基因工程改造获得的高活性甘露聚糖酶及其突变位点
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术工程领域，涉及通过基因工程改造获得的高活性甘露聚糖 酶及其突变位点。 技术背景
[0002] 植物是自然界主要的可再生有机资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。而 半纤维素占植物干重的25%_35%，在自然界中含量仅次于纤维素。与纤维素相比，半纤维 素结构与组成更加复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、葡聚糖和阿拉伯聚糖等多种组分。
[0003] β-甘露聚糖是以I，4-i3_D-吡喃甘露糖苷键连接的线状多糖，如果主链某些残基被 葡萄糖取代，或半乳糖通过1，6-α糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则成为异甘露糖，主 要有葡甘露聚糖（glucomannan)、半乳甘露聚糖（galactomannan)和半乳葡甘露聚糖 (galactoglucomannan)。上述物质构成了植物半纤维素的第二大组分。
[0004] 甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是内切β-1，4-甘露聚糖糖苷水解酶的简称，属于半纤 维素酶，能够随机水解甘露聚糖分子主链中的β-l，4-D-甘露糖苷键，在植物、动物和微生物 中均有发现，目前广泛应用于在食品、医药、饲料、纺织、纸浆漂白及能源开发等领域。
[0005] 尽管目前一些β-甘露聚糖酶的晶体结构已经得到解析，但由于β-甘露聚糖酶存在 种类繁多，来源复杂，底物多样等特点，并且β-甘露聚糖酶结构与功能的机理性研究还不够 完善，因此，难以用定点突变等合理性设计的手段对其酶分子进行定点改造。
[0006] 易错PCR技术(error prone PCR)是由Leung等人发明的一种简便快速地在DNA序 列中随机产生突变的方法。其基本原理是通过调整传统PCR反应体系中镁离子和dNTP的浓 度、使用低保真度的DNA聚合酶以及添加锰离子等方法，使DNA在复制过程中在一定程度上 出现差错从而产生序列多样性的文库。该方法的关键在于寻找合适的突变频率，突变频率 过高会导致酶的完全失活，减小了文库的容量;突变频率过低，野生型占有很大的比例，不 利于后期的筛选与鉴定。
[0007] 易错PCR技术作为一种体外分子定向进化技术，具有简单迅速、成本低和可塑性强 等优点，已经逐步的运用到酶分子的改造等方面。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种甘露聚糖酶。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述甘露聚糖酶的应用。
[0010] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0011] 一种甘露聚糖酶，该甘露聚糖酶氨基酸序列为将如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列 的第221、301和122位中至少一位氨基酸取代修饰后的氨基酸序列，其中第221位氨基酸由 亮氨酸取代修饰为异亮氨酸，第301位氨基酸由赖氨酸取代修饰为谷氨酸，第122位氨基酸 由谷氨酰胺取代修饰为精氨酸。
[0012] 优选的，该甘露聚糖酶具有如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO.4所示的氨 基酸序列。
[0013] 上述甘露聚糖酶的编码基因。
[0014] 作为一种优选技术方案，所述的编码基因具有如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
[0015] 含有上述甘露聚糖酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因工程菌或细胞系。
[0016] 用于表达上述的甘露聚糖酶的重组载体、表达盒、转基因工程菌或细胞系。
[0017] -种高活性甘露聚糖酶的突变位点，该突变位点为SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列 的第221、301和122位中的至少一位。
[0018] 上述的甘露聚糖酶在饲料、食品、造纸工业中的应用。
[0019] 本发明从β-甘露聚糖酶产生菌芽孢杆菌(Bacillus sp.MK-2,保藏于中国农业微 生物菌种保藏管理中心(ACCC)，其保藏编号为ACCC19935)中克隆了β-甘露聚糖酶的编码基 因，利用易错PCR技术建立了该基因的突变体文库，从中筛选得到三个酶活大幅度提高的突 变体，获得了三种高活性甘露聚糖酶并确定了其基因突变位点。
[0020] 其一为将如SEQ ID NO. 1所示的野生型甘露聚糖酶第221位氨基酸亮氨酸改以异 亮氨酸取代修饰其序列；其二为将如SEQ ID NO. 1所示的野生型甘露聚糖酶第301位氨基酸 赖氨酸改以谷氨酸取代修饰其序列；其二为将如SEQ ID NO. 1所示的野生型甘露聚糖酶第 122位氨基酸谷氨酰胺改以精氨酸取代修饰其序列。
[0021] 本申请系从芽孢杆菌(Bacillus sp.MK-2)克隆出甘露聚糖酶基因，通过PP43NMK 载体在Bacillus subtilis WB800中实现表达，且酶活力相对较高，具有一定的应用价值， 为进一步增加此酶在工业上的应用价值，本申请通过易错PCR的手段对甘露聚糖酶基因进 行了随机突变，将突变的酶基因与表达载体PP43NMK重组后转入Bacillus subtilis WB800 中，成功构建甘露聚糖酶基因的突变体表达文库，从中筛选具有更高活性的突变体。
[0022] 以下【具体实施方式】中将详述本申请改造甘露聚糖酶蛋白之方法及所得到之改良 甘露聚糖酶蛋白。
[0023]本发明的有益效果：
[0024] 本申请通过易错PCR的手段对甘露聚糖酶基因进行了随机突变，将突变的酶基因 与表达载体PP43NMK重组后转入Bacillus subtilis WB800中，成功构建甘露聚糖酶基因的 突变体表达文库，从中筛选具有更高活性的突变体，该改良甘露聚糖酶蛋白与野生型的露 聚糖酶相比其活性具有显著的提高。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 [0026] 1 材料
[0027] Superrich培养基（1L): 20g酵母粉，25g蛋白胨，3g磷酸氢二钾，30g葡萄糖。
[0028] 枯草芽孢杆菌WB800转化试剂：
[0029] SP-A盐溶液（lL):(NH4)2S〇4 4g，K2HP〇4 · 3H20 28g，KH2P〇4 12g，柠檬酸钠 2g，121 °C 灭菌 20min。
[0030] SP-B盐溶液（IL) :MgS〇4 · 7H20 0·48，121Γ灭菌20min。
[0031 ] 100 X CAYE溶液（100mL):酪蛋白水解物2g，酵母粉IOg，121°C 灭菌20min。
[0032] SPI Medium(IOmL) :4.9mL SP-A盐溶液，4.9mL SP-B盐溶液，100μΙ Glucose(50% w/v(50g/100ml)，115。C灭菌20min)，100μl100 XCAYE。
[0033] SPII Medium(IOmL):9.8mL SPI Medium，100μ1 50mM CaCl2，100yl 250mM MgCl2o
[0034] 100XEGTA溶液：1 OmM EGTA溶液，溶解时需加少量NaOH至pH 8.0。
[0035] 5父]?9盐溶液：他2?〇4.7!12〇12.88，1012?〇4 3.(^，他(：10.58，順4(：11.(^加水至 200mL〇
[0036] M9基本培养基：5 X M9盐溶液200ml，lmol/L的MgS〇4 2ml，20 % (w/v，20g/100ml)的 葡萄糖溶液20ml，lmol/L的Cach 0 · Iml，加水至 1000ml。
[0037] 台盼蓝平板筛选培养基（IL): IOg蛋白胨，5g酵母粉，5g氯化钠，Ig魔芋粉，0.1 g台 盼蓝。
[0038] 2甘露聚糖酶基因的克隆表达
[0039] 2 · lpP43-man表达载体的构建
[0040] 按照Axygen公司基因组提取手册，米用AxyPrep bacteria genome extraction kit提取菌株Bacillus sp.MK-2的基因组(该株菌已经在中国农业微生物菌种保藏管理中 心(ACCC)保藏，其保藏编号是ACCC19935，中国农业微生物菌种保藏管理中心是中国国家级 农业微生物菌种保藏管理专门机构，负责全国农业微生物菌种资源的收集、鉴定、评价、保 藏、供应及国际交流任务，库藏菌种全部对全社会开放共享使用，本领域技术人员可以采用 向该保藏中心购买的方式获得该菌株）。以菌株Bacillus sp.MK-2的基因组为模板，以Pl和 P2为引物扩增甘露聚糖酶基因完整序列（SEQ ID NO. 1)。
[0041 ] Pl:5 '-AACTGCAGCGCATACTGTGTCGCCTGTGAATCCTAATGCCCAGCAGACAAC-3 '
[0042] P2:5 '-CCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCAACGATTGGCGTTAAAGA-3，
[0043] 25μ1扩增体系为： SxPriirit^STAR BuiTcr ( Mg2^plus) 5 μL dNTP 2 μL Pl 1 μL
[0044] Ρ2 ! μL DNA 0.5 μL PrimcSTAR HS DNA Polymerase 0.3μ1 CtdH2O 15.2 μL
[0045] 扩增条件： mV 2 min 98 C IOs 55 0C IOs
[0046] 72V 80s Go lo step 2 31 cycles IOC Forever
[0047] PCR产物I %琼脂糖凝胶电泳检测后，采用DNA纯化试剂盒(Axygen)纯化，备用。
[0048] 将上一步纯化的甘露聚糖酶基因和经AxyPrepplasmid extraction kit提取的质 粒
[0049] pP43NNK分别进行酶切，20μ1酶切体系为： Himilll 2μ1 Pstl 2 μL
[0050] BuITor 2 μ,I 片段/质粒 ：6μ1
[0051 ] ddH20 9 μ!
[0052] 酶切样品置于37°C反应3-5h，片段经PCR纯化试剂盒（AxyPrep PCR DNA purification kit，Axygen)纯化回收，质粒由DNA凝胶试剂盒切胶回收。采用T4连接酶将上 述纯化好的片段和质粒连接起来，构建表达载体pP43-man，酶连体系如下： 酶切的质粒 _4.5:μ1. 酶切的片段 0.5 μΙ
[0053] BuiTcr 1 μ! Τ4 Iigase 1 μL ddH20 3 μL
[0054] 将酶连样品16°C过夜反应(14h)。
[0055] 2.2大肠杆菌0!15€[转化
[0056] (1)将酶连样品与大肠杆菌DH5a感受态（IOOyL)混匀，冰上静置30min。
[0057] (2)混合后的样品于42 °C水浴锅处理90s，再次置于冰上2min。
[0058] (3)加入800yL液体LB培养基，37°C100rpm复苏lh，涂布于Amp IOOyg · ml-1 的LB平 板中，37°C培养12h。挑取单菌落接种于3ml液体LB试管中（含Amp IOOyg · 11114)371:震荡培 养8h，提取质粒。利用相应的内切酶对质粒进行双酶切验证。
[0059] 10μ1酶切体系为： Hindlll 1 μL Pst\ 1 μL
[0060] BulTcr 1 μΙ 质粒 5μ1 ddH20 2 μL
[00611 酶切样品置于37°C反应3-5h，1 %凝胶电泳验证。将酶切验证正确的质粒送至上海 美吉生物有限公司测序以保证插入片段序列的正确性。
[0062] 2.3芽孢杆菌18800转化与表达
[0063] 取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌，于LB培养基平板划线，37°C培养箱静置培养12h; 挑单菌落至5ml LB培养基中，37°C，220rpm培养过夜;取200μ1培养液转接至IOml新鲜SPI培 养基中，37°C，250rpm培养至对数生长末期（约4-5h);取0.4ml生长至对数期末的培养液至 4ml SPII培养基中，37°C，IOOrpm培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入20μ1 IOmmol · IZ1EGTA,再于37°C ,IOOrpm培养10分钟，将上述处理后的菌液分装成0.5ml每管，各 加入1〇μ1的表达载体pP43-man，37°C，170rpm培养90分钟。涂布于Km100 μg/ml的LB平板中， 37°C培养12h。挑取单菌落接种于3ml液体LB试管中（100μg/ml )37°C震荡培养8h，提取质粒， 测序，将转入正确质粒的转化子接入到superrich培养基中进行发酵培养。
[0064] 3β_甘露聚糖酶突变体的获得
[0065] 3.1β_甘露聚糖酶基因突变片段的获得
[0066]以2.1步骤构建的表达载体pP43-man为模板，Ρ1/Ρ2为引物，采用即用型易错PCR试 剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)扩增甘露聚糖酶基因突变片段。
[0067] 30μ1扩增体系： ^ 铝 PCR Mix, 1〇χ 3μ1 易错 PCR V·川 dNTP，l〇x 3μ1 MnCi2,5mM Iu I r n Pl i μι
[0068] ^ P2 ΙμL :pP43.-man 0;5μ1 Taq DNA Polymerase I μ! CtdH2O 17.5 μL
[0069]扩增条件： 9.4 °C 3 min 94 °C I min 60 °C I min
[0070] 72 °C 1.5 mm Go ?ο step 2 13 cycles '10 TJ Forever
[0071 ] PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回并定量。
[0072] 3·2ρΡ43-ΜΑΝ质粒的线性化
[0073]在β-甘露聚糖酶基因内部设计引物Ρ3和Ρ4,以2.1步骤构建的表达载体pP43-man 为模板，扩增线性化的pP43-man质粒。
[0074] P3:5，-ATTGCTGACGGACTTCAAGA-3 '
[0075] P4:5，-GCACACCTTGGTTCTCCAGC-3，
[0076] 25μ1反应体系： 5 X EVO Buffer (with 10 mM MgCl2 ) 5 μL dNTP Mix (10 mM each) 0.5μ1 PhanlaTM EVO Supcr-Fidclily DNA Polymerase (I U/μ!) 0.7μΙ
[0077] pP43 man 0 3μ1 P5 ΙμL P6 ΙμL CidH2P 16,5μ1
[0078] PCR反应条件： 95 V 2 min 95 ? 15s 64 eC 15s
[0079] 72 ID 3.5 min Go to step 2 3 lcyclcs 72 pC 7 min 10 °C Forever
[0080] PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回并定量。
[0081 ] 3 · 3pP43-error_man质粒多聚体的获得
[0082] 按以下反应体系与反应条件进行PCR扩增，以获得pP43-error-man质粒多聚体 (Zhang X-Z et al.，2011)。
[0083] PCR反应体系： 5 x EVO Buffer (with 10 mM MgCl2 ) 5 μ! dNTP Mix (10 mM each) ().5μL PhantaTM EVO Supcr-Fidciily DNA Polymerase (I U/μΙ) 0.7μ1
[0084] p}M3-man OJngZiLil error-man 5 ng/μΙ ddH：)0 Io 25 μ!
[0085] PCR反应条件 95 ? 95'C
[0086] 68 °C 95 V 68'C
[0087] IOC
[0088] 将PCR产物用I %琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0089] 3 · 4pP43-error-MAN 质粒多聚体转化 WB800
[0090]参照步骤2.3的方法将步骤3.3中获得的pP43-error-man质粒多聚体转化芽孢杆 菌WB800，将经过90min复苏得到转化产物加入到IOmL M9基本培养基中，37 °C，170rpm培养 14h。再将上述产物用M9基本培养基稀释20倍，37°C，170rpm培养8h。将最终得到的菌液稀释 适当的倍数涂布在含有30ng/mL卡那霉素的台盼蓝平板筛选培养基上，得到阳性克隆转化 子，建立甘露聚糖酶基因突变体文库。
[0091] 4.甘露聚糖酶基因突变体菌株筛选
[0092]将平板筛选培养基上有透明圈的克隆子，转接到含有发酵培养基(2.0 %酵母粉， 2.5 %蛋白胨，0.3 %磷酸氢二钾，3.0 %葡萄糖，以上％的单位为质量体积比g/ml)的96孔深 孔板中发酵24h，测其酶活力，经多轮筛选之后，筛到20株较高酶活的菌株，经摇瓶发酵，酶 活测定后，筛选得到3株产酶活力明显提高的突变菌株。其分别表达β-甘露聚糖酶L221I (SEQ ID Ν0·2)、β-甘露聚糖酶K301E(SEQ ID Ν0·3)、β-甘露聚糖酶Q122R(SEQ ID Ν0.4)。
[0093] 4.1粗酶液酶活测定：
[0094]酶液在55°C条件下水解魔芋粉，以每分钟产生Ιμπιο?还原糖（以甘露糖计)所需要 的酶液量为一个酶活力单位(U)。
[0095] 对照管：取去离子水0.4ml加入到0.4ml 0.5% (g/ml)魔芋粉底物溶液中，55°C水 浴IOmin后立即加入0.4ml DNS终止反应，100°C煮沸15min显色后放置冰水中冷却。
[0096] 测定管(三个平行）：取适当稀释的粗酶液0.4ml加入到0.4ml 0.5% (g/ml)魔芋粉 底物溶液中，55°C水浴IOmin后立即加入0.4ml DNS终止反应，100°C煮沸15min显色后放置 冰水中冷却。用对照管调零，测出每管的520nm光吸收值。根据光吸收值从标准曲线上得到 还原糖的含量。
[0097]酶活定义单位:酶液在55°C条件下水解魔芋粉，以每分钟产生IMiol还原糖（以甘 露糖计)所需要的酶液量为一个酶活力单位(U)。
[0098] 根据甘露糖标准曲线的结果，得出酶活力计算公式：
[0099] 甘露聚糖酶活力=[(y-b)/k] XN/(VX t XM)
[0100] y:520nm处的光吸收值;b:标准曲线的截距;k:标准曲线的斜率;N:酶液稀的释倍 数;V:稀释后的酶液体积;t:反应时间，单位分钟;M:甘露糖分子量180.16。其酶活力测定结 果见表1。
[0101] 4.2蛋白纯化
[0102]向20mL发酵液，缓慢滴加80mL饱和硫酸铵溶液，此过程应在冰进行，并实时持续搅 拌发酵液。将混合液置于4°C过夜后，于4°C，12000rpm离心15min。弃掉上清，加入2mLpH 7.OTris-HCl缓冲液，充分溶解沉淀。将硫酸铵沉淀后的酶液加入3500Da的透析袋中，并置 于pH 7. OTris-HCl缓冲液中，于4°C透析24h，每隔6h更换一次缓冲液。经过透析之后的酶液 按方法进行镍柱亲和层析进一步的纯化蛋白，经纯化出的蛋白再次透析除去里面的咪唑， 并通过BCA试剂盒测定蛋白含量，计算比活力，结果见表1。
[0103]表1甘露聚糖酶及其突变体活力测试结果
[0105] 5.酶促动力学参数的测定
[0106] 将稀释酶液在最适条件下于不同浓度的魔芋粉底物中反应，计算米氏方程，得出 各参数值，结果见表2。
[0107] 表2甘露聚糖酶及其突变体酶促动力学测试结果
【主权项】
1. 一种甘露聚糖酶，其特征在于该甘露聚糖酶氨基酸序列为将如SEQ ID NO.1所示氨 基酸序列的第221、301和122位中至少一位氨基酸取代修饰后的氨基酸序列，其中第221位 氨基酸由亮氨酸取代修饰为异亮氨酸，第301位氨基酸由赖氨酸取代修饰为谷氨酸，第122 位氨基酸由谷氨酰胺取代修饰为精氨酸。2. 根据权利要求1所述甘露聚糖酶，其特征在于该甘露聚糖酶具有如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。3. 权利要求1或2所述甘露聚糖酶的编码基因。4. 根据权利要求1所述甘露聚糖酶的编码基因，其特征在于所述的编码基因具有如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。5. 含有权利要求3或4所述甘露聚糖酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因工程菌或 细胞系。6. 用于表达权利要求1或2所述的甘露聚糖酶的重组载体、表达盒、转基因工程菌或细 胞系。7. -种高活性甘露聚糖酶的突变位点，其特征在于该突变位点位于SEQ ID NO. 1所示 氨基酸序列的第221、301和122位中的至少一位。8. 权利要求1或2所述的甘露聚糖酶在饲料、食品、造纸工业中的应用。
【文档编号】A23K20/189GK105861466SQ201610323104
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月15日
【发明人】张瑞福, 张稳, 沈其荣, 邵佳慧
【申请人】南京农业大学