一种玉米蔗糖合酶突变基因、编码蛋白质及其应用
【专利摘要】本发明属于生物遗传学技术领域，具体涉及一种玉米蔗糖合酶突变基因、该基因编码的蛋白质，及其应用。本发明所述玉米蔗糖合酶突变体sh1?m，包含如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。而由所述的玉米蔗糖合酶突变体sh1?m编码的蛋白质，则包含如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。本发明所述的sh1?m突变体是在改良郑58自交系的材料(Gai?Z58)中发现的，经验证其基因序列结构，证实所述玉米蔗糖合酶突变体sh1?m，是Sh1基因座的等位基因，可显著提高胚乳直链淀粉含量(16.5％)，具有极好的应用价值。
【专利说明】
一种玉米蔗糖合酶突变基因、编码蛋白质及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物遗传学技术领域，具体涉及一种玉米蔗糖合酶突变基因、该基因 编码的蛋白质，及其应用。
【背景技术】
[0002] 玉米是重要的粮食作物、饲料作物、轻工业原料作物，是世界人口所需要的重要粮 食与工业原料之一，也是世界上分布最广泛的粮食作物之一，其种植面积仅次于小麦和水 稻二位居第三位，在我国更是已发展成为第一大经济作物，同时也成为了研究进化生物学、 分子生物学和遗传学的模式植物。因此，重视和保障玉米作物生产的质量和产量，对粮食安 全和经济发展具有举足轻重的意义。
[0003] 玉米籽粒中70%左右为淀粉，淀粉是动物和人类营养的能量来源，也是重要的工 业原料，被广泛应用于化工、医药、建筑、纺织和塑料等领域，在国民经济中发挥着重要的作 用;其中用高直链淀粉取代聚苯乙烯，生产可降解塑料，大量应用于包装工业和农用薄膜加 工业，这有可能从根本上解决白色污染问题，将为世界环保事业带来一次重大革命。玉米淀 粉是植物淀粉中化学成分最佳的淀粉原料之一，具有高纯度（99.5%)、高提取率（93%-96 % )、营养成分丰富、经济效益佳等优势；当前，玉米淀粉的产量更是占了我国淀粉总产量 的85%以上。
[0004] 淀粉的生物合成是经历了一系列的酶促反应进行，主要涉及到5种关键酶:蔗糖合 酶（sucrose synthase)，ADP_葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-Glucose pyrophosphorylase， AGPase)，淀粉合成酶(starch synthase)，淀粉分支酶（starch branching enzyme)和淀粉 去分支酶(starch debranching enzyme)。其中，鹿糖合酶负责催化鹿糖降解，生成UDP-Glc 和果糖，这一步骤在淀粉合成途径中起着重要的作用。在玉米中编码蔗糖合酶的基因目前 发现有3个，即SUSl、SUS-SH1和SUS2,其中SUS-SHl在合成蔗糖合酶的途径中起着主要的作 用;此外还发现SUS-SHl的第一个内含子在增强基因表达中起着重要的作用。
[0005] 鹿糖合酶（sucrose synthase，SuSy)是鹿糖代谢途径中的一类关键酶，现已证明 它是由分子量约为83-100kD的亚基构成的四聚体，并以2种以上的同工酶形式存在于植物 组织中，大部分以可溶性状态存在于细胞质中，有些不溶性的SuSy附着在细胞膜上。植物代 谢过程中，SuSy既可以催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是一种可逆酶。通常情况下，研究 认为SuSy主要起分解蔗糖的作用，在合成淀粉或细胞壁的组织中最高。SuSy最早是在小麦 中发现的，随后许多SuSy基因和序列相继从马铃薯、玉米、甜菜、胡萝卜和甘蔗等多种作物中 分别被克隆和鉴定。在这些物种中，SuSy由多基因家族编码，家族至少由2个基因组成，在一 些物种中甚至发现了多个SuSy基因，然而它们在植物各组织中的时空表达模式不尽相同， 如水稻中有6个SuSy基因，分别调控不同的生长发育过程。目前的研究认为SuSy的主要生物 学功能有以下几个方面：（1)参与淀粉合成，如马铃薯反义RNA和过表达植株中，SuSy酶活性 和淀粉含量成正相关，从而影响产量；（2)提高植物的抗胁迫能力，低温可以提高白菜中 SuSy的活性，从而提高植物对低温的适应性；（3)影响种子的发育，如在棉花SuSy基因 RNAi 突变体中，种子会出现变形和发育受到阻碍；同样在菜豆中SuSy基因表达受到抑制时，种子 不能正常发育；（4)参与植物的生物固氮，豆科植物的根瘤主要依赖蔗糖代谢提供的能量和 碳骨架来进行固氮，调控SuSy的表达可以影响蔗糖代谢，如豌豆rug4突变体中SuSy活性下 降会显现缺氮症状。
[0006] 当前，玉米基因组测序的完成和注释使研究者能够在基因组水平上对基因启动子 的序列特征和表达模式进行系统的分析。虽然SuSy在植物淀粉合成、逆境胁迫和生长发育 过程中具有重要的功能，然而对其SuSy基因启动子的表达功能还不是很清楚。已有研究通 过PCR的方法从玉米中克隆出SHl基因的启动子，通过遗传转化产生转基因水稻植株，并对 其表达模式进行详细的分析和鉴定，从而为作物的品质改良奠定理论基础。可见，揭示并合 成玉米蔗糖合酶基因的分子机理对于育种应用具有重要的意义。
【发明内容】
[0007] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种玉米蔗糖合酶突变体，以利用基 因工程手段或分子标记技术提高玉米直链淀粉的含量。
[0008]为解决上述技术问题，本发明所述的一种玉米鹿糖合酶突变体shl-m，其特征在 于，包含如SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列。
[0009]优选的，所述的玉米蔗糖合酶突变体Shl-m，其核苷酸序列如SEQ ID N〇:l所示。 [0010] 所述突变体shl-m是Shl基因的等位基因。
[0011]本发明还公开了一种由所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m编码的蛋白质，包含如 SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
[0012]优选的，所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示。
[0013]本发明还公开了所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m在增加玉米直链淀粉含量领域 的应用。
[0014] 本发明还公开了一种玉米蔗糖合酶突变体shl-912A，包含如SEQ ID No:3所示的 核苷酸序列。
[0015] 优选的，所述的玉米蔗糖合酶突变体shl-912A，其核苷酸序列如SEQ ID N〇:3所 不。
[0016]本发明还公开了一种由所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-912A编码的蛋白质，包含 如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列。
[0017] 优选的，所述的玉米蔗糖合酶突变体Shl-912A编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0018] 本发明所述的shl-m突变体是在改良郑58自交系的材料(Gai-Z58)中发现的，经验 证其基因序列结构，证实所述玉米蔗糖合酶突变体shl-m，是Shl基因座的等位基因，可显著 提高胚乳直链淀粉含量测定(16.5%)，具有极好的应用价值。
【附图说明】
[0019] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施案例并结 合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0020]图1为本发明shl-m突变体的图位克隆示意图；
[0021] 图2为本发明所述shl-m突变体表达的籽粒胚乳表型；其中A:shl-m，B:shl-912A， C: shl-mX shl_912A，D: shl_912AX shl-m;
[0022] 图3为InDel标记P20检测B73Xshl-m F2分离群体的实验结果。其*，M:DL- 200011^11?^，？1:873^1:873\811111，？2:8111-111，1-4:?2群体中纯合31115111个体，5-8:卩2群 体中杂合Shlshl个体，9-12 :F2群体中纯合shlshl个体；
[0023] 图4为本发明所述shl-m突变体表达胚乳淀粉粒的形态;A: WT，B: shl-m，C: shl- 912A；
[0024] 图5为本发明所述Shl基因的表达分析结果；
[0025] 图6为本发明Shl基因对淀粉合成途径中相关基因表达的影响。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1 shl-m突变体的获得
[0027]突变体的获得：shl-m突变体是在改良郑58自交系的材料(Gai_Z58)中发现的，本 方案于2012年在河南农大实验田中从改良郑58自交系的一个穗子上发现有胚乳凹陷籽粒， 经过自交实验发现性状遗传稳定，并且其成熟籽粒胚乳自发地表现皱缩，因此，暂定名为 shl-m，并进行进一步的研究。
[0028]本方案以突变体与野生型B73，M〇17品种杂交进行验证其胚乳皱缩表型的基因控 制情况，实验结果见下表1。
[0029] 所述野生型B73的ORF核苷酸序列见SEQ ID No:5所示，而由野生型B73基因编码的 蛋白质，其氣基酸序列如SEQ ID No:6所不。
[0030] 所述改良郑58自交系（Gai-Z58)的ORF核苷酸序列见SEQ ID No:7所示，而由Gai-Z58基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N〇:8所示。
[0031] 实验显示，突变体与B73，M〇17杂交获得的F1种子胚乳均表现正常，获得的^分离群 体其正常胚乳与皱缩胚乳的分离比均完全符合3:1，同时获得的BC 1*离群体其正常胚乳与 皱缩胚乳的分离比完全符合1:1。这些数据表明突变体shl-m的胚乳皱缩表型由隐性单基因 控制。
[0032] 表1三个亲本及其F1力和腸群体的表型分离
[0034] 实施例2 shl-m的图位克隆
[0035] (1)初步定位
[0036]用实验室合成的512对SSR引物借助BSA分离群体分离分析法找到了5个与目标基 因连锁的多态性分子标记P1-P5，位于Bin9.01/9.02区（见下表2)。用这5个多态性标记对 B73与shl-m组配的255个隐性BC1个体进行基因型检测，发现分别有39,10,12,20和27个交 换单株。标记Pl位于靠近端粒的一端，其它4个标记位于靠近着丝粒的一端，将目标基因定 位在Pl和P2之间的物理距离约为8.3Mb的片段内（见图1中A)。
[0037] 为了进一步定位shl-m基因，新鉴定了9个多态性标记，其中P6-P11和P13-P14为 SSR标记，P12为InDel标记(见下表2)。用这9个标记对Pl和P2之间的49个交换单株进行基因 型检测，结果将shl-m基因定位在物理距离约为0.24Mb的两标记P12和P14之间（见图1中B)。 [0038]表2图位克隆shl-m基因用到的引物
[0041 ] (2)精细定位
[0042] 为了精细定位shl-m基因，新鉴定了5个多态性标记包括1个SSR标记P16,3个InDel 标记P15，P17和P19,和1个SNP标记P18(同上表2)。为了获得更多的交换单株，用两个标记 P12和P14对BC1分离群体中的1622个隐性突变个体进行基因型检测。随后用P15-P19这5个 标记对获得的交换单株进行基因型检测。最终将目标定位在物理距离为2. Ikb的标记P17和 P19之间（见图1中C和图1中D)。
[0043] (3)基因克隆及序列分析
[0044] 利用基因分析与预测软件(WWW. softberry · com)对这2 · IKb进行基因预测，结合 maize⑶B网站公布的注释基因，发现该片段位于基因 GRMZM2G089713内，该基因由于转座子 Ds插入导致的突变体sh-m5933和sh-m6233均表现籽粒胚乳皱缩，推测该基因就是shl-m的 候选基因。基因编码区序列使用PCR引物（F: CCCGTCTATTTATTGGTCCCTCT，R: AATGCGAATTGCGGTGAAAC)从野生型 B73、Gai-Z58 和突变体 shl-m、和 shl-912A 叶片 cDNA 中扩 增获得，直接连接克隆载体，测序，然后用序列分析软件DNAs tar进行序列比对。
[0045] 所述突变体shl_912A由Maize Genetics COOP Stock Center惠赠，stock912A，突 变体shl-912A的ORF全长为2292bp，编码的蛋白质氨基酸长度为763aa，比野生型短了39个 氨基酸，其错义突变(Ala728Gly)位于GTl_Sucrose_synthase保守域。所述突变体shl_912A 的核苷酸序列见SEQ ID N〇:3所示，而由突变体shl-912A编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID No:4所示。
[0046] PCR扩增程序：951€5111丨11，951€458,65 1€458,72°(：12〇8，共30个循环，最后721€ I Omin，4 0Cforever 〇
[0047] 序列分析发现突变体shl-m发生5bp CAGGT到ATACC的碱基替换，其中CAG(ATA)位 于第13外显子的末端导致错义突变(Gln665Ile)，GT(CC)位于第13内含子的5'剪切位点导 致错误剪切从而在13内含子发生翻译提前终止(见图1中E)。突变体shl-912A在第三外显子 起始部位发生13bp的缺失，导致起始密码子ATG向下移动117bp，在2183bp有一个C到G的单 碱基的颠换导致错义突变(Ala728Gly)(见图1中F)。野生型ORF全长为2409bp，编码的蛋白 质氨基酸长度为802aa，突变体shl-m的ORF全长为2028bp，编码的蛋白质氨基酸长度为 675aa，比野生型短了 127个氨基酸，其中84个氨基酸位于GTl_Sucrose_synthase保守域。整 段突变体shl-m的核苷酸序列见SEQ ID No: 1所示，而由所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m 编码的蛋白质，其氣基酸序列如SEQ ID No:2所不。
[0048] 实施例3等位性测验
[0049] 为了验证sh I -m是否为Sh 1的等位基因，将sh I -m与sh I-912A双向杂交分别获得F1， 通过观察发现突变体shl-m和shl-912A及其两种^的种子在成熟期均自发地表现胚乳皱缩 (见图2)。这一结果证实shl-m是Shl基因座的等位基因。
[0050] 实施例4突变体shl-m的应用
[00511序列结构显示，在shl-m基因第七和第八内含子缺失143bp，基于此缺失差异我们 开发了 一个InDel标记P20:
[0052] F:CTTGGATACCCTGACACTGGC；
[0053] R:ACGTAGTCCCAGCAGCATCA。
[0054] 该标记可用于该基因的分子标记回交育种，以加速shl-m基因的回交过程，实验结 果见图3。
[0055] PCR扩增程序：951€5111丨11，951€458,651€458,72 1€6〇8，共30个循环，最后721€ I Omin，4 0Cforever 〇
[0056] 实验显示，本发明所述P20可应用于加速shl-m分子标记回交育种的过程。
[0057]实施例4突变体的表型分析 [0058] (1)胚乳直链淀粉含量测定
[0059] 野生型B73胚乳中的直链淀粉含量为27.9 %，而突变体shl-m中的含量则为 32.5%，相比于野生型显著提高16.5% (见下表3)。突变体shl-912A中的直链淀粉含量为 27.35%，与野生型没有显著差异。突变体shl-m与shl-912A相比其直链淀粉含量差异达到 极显著水平，提高18.83% (见下表3)。
[0060] 表3.直链淀粉含量测定· L0062 j a: WT和shl-m的M者性差弁^^平P =
O · 05; b: shl-m和sh卜912A的M者性差弁^^平P = 0.01
[0063] (2)胚乳淀粉粒扫描电镜观察
[0064]野生型的淀粉粒个体大，周围有比较多的蛋白体包裹，外形呈现比较均一的多面 球体，排列比较紧凑，其表面比较粗糙(见图4中A)。与野生型相比，突变体shl-m的淀粉粒个 体略小，较少的蛋白体包裹，外形呈现圆球体，有较多的外形不规则的小淀粉粒，排列比较 松散，表面比较光滑(见图4中B)。突变体shI-912A的淀粉粒略小，排列松散，表面较粗糙(见 图4中C)。
[0065] 实施例5表达分析
[0066] (I)Shl的表达分析
[0067] Shl基因在野生型的根、茎、叶、雌穗和雄穗中均有表达，在雌穗中表达量最高，叶 和雄穗中表达量偏低(见图5中A)。在野生型授粉后5-20天的籽粒中，Shl基因在授粉后5天 的籽粒中表达量最低，10天保持中等表达水平，15天和20天表达量最高(见图5中B)。突变体 shl-m中，该基因的表达谱在授粉后5-20天的籽粒中与野生型相比没有明显差异，在授粉后 15天的籽粒中其表达水平也没有明显差异(见图5中B，图5中C)。在突变体shl-912A中，该基 因的表达谱在授粉后5-20天的籽粒中呈现逐渐升高，且在授粉后15天的籽粒中其表达水平 比野生型和shl-m都显著降低(见图5中B，图5中C)。
[0068] (2) Shl对淀粉合成途径中相关基因表达的影响
[0069]对淀粉合成途径中9个相关基因的表达也进行了检测，结果见图和Bt2分别 编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucose pyrophosphoryIase，AGPase)的大亚基和小亚 基，Dul，Su2和Wxl分别编码淀粉合成酶（starch synthase，SS)的SSIII，SSIIa和GBSSI亚 型，Ael和Sbel分别编码淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE)的SBEIIb和SBEIa亚 型，Sul和Zpul分别编码淀粉去分支酶（starch debranching enzyme，DBE)的isoamylase和 pullulanase亚型。在突变体shl-m中，上述9个基因的表达谱在授粉后5-20天的籽粒中与野 生型相比均有差异，在授粉后15天的籽粒中基因 Sh2，DuI，Sbe I，Su 1和Zpu 1的表达水平均明 显降低(见图6中A和图6中B)。在突变体shl-912A中，基因3112,8七2,〇111，3112,3111和2?111的表 达谱在授粉后5-20天的籽粒中与野生型相比均有差异，基因 Sh2在授粉后15天的籽粒中其 表达水平比野生型显著升高，Zpul显著降低(见图6中A和图6中B)。突变体shl-m与shl-912A 相比，基因3112,〇111，3112，111，461和3匕61的表达谱在授粉后5-20天的籽粒中均有差异，基因 3112,〇111，3匕61和3111的表达水平在授粉后15天的籽粒中均明显降低(见图6中4和图6中8)。
[0070] 可见，本发明所述玉米蔗糖合酶突变体Shl-m，是Shl基因座的等位基因，可有效提 高胚乳直链淀粉含量。
[0071] 显然，上述实例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于 所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变 动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变 动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种玉米蔗糖合酶突变体shl-m，其特征在于，包含如SEQ ID N〇:l所示的核苷酸序 列。2. 根据权利要求1所述的玉米蔗糖合酶突变体shl-m，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1 所示。3. 根据权利要求1或2所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m，其特征在于，所述突变体shl-m是Shi基因的等位基因。4. 一种由权利要求1-3任一所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m编码的蛋白质，其特征在 于，包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。5. 根据权利要求4所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m编码的蛋白质，其特征在于，其氨 基酸序列如SEQ ID No:2所不。6. 权利要求1-3任一所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-m在增加玉米直链淀粉含量领域 的应用。7. -种玉米蔗糖合酶突变体shl-912A，其特征在于，包含如SEQ ID N〇:3所示的核苷酸 序列。8. 根据权利要求7所述的玉米蔗糖合酶突变体shl-912A，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQIDNo:3**。9. 一种由权利要求7或8所述的玉米鹿糖合酶突变体shl-912A编码的蛋白质，其特征在 于，包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列。10. 根据权利要求9所述的玉米蔗糖合酶突变体shl-912A编码的蛋白质，其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
【文档编号】A01H5/00GK105861460SQ201510981546
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年12月24日
【发明人】关海英, 汪黎明, 董永斌, 刘铁山, 何春梅, 刘春晓, 刘强, 董瑞
【申请人】山东省农业科学院玉米研究所