甲状腺过氧化物酶表达方法
【专利摘要】本发明公开了一种甲状腺过氧化物酶表达方法，采用传统杆状病毒表达系统外，还采用家蚕（Bombyx mori）生物反应器表达系统对TPO进行表达，家蚕生物反应器作为新型杆状病毒表达系统，在医药制备方面发挥了重大的作用，展示了广阔的应用前景，方法成功构建了带有绿色荧光基因的杆状病毒转移载体pFBDMY?IG?TPO，利用Tn7转座位点分别转座到带有病毒基因组的asd基因缺失的大肠杆菌受体菌AcMultiBac/rSW106?inv+asd?和BmMultiBac/rSW106?inv+asd?中，用重组AcMultiBac/rSW106/pFBDMY?IG?TPO菌液感染昆虫细胞Spodoptera frugiperda 9（Sf9），得到重组病毒Ac/TPO?IG，利用家蚕幼虫或蚕蛹表达蛋白，不仅显著降低成本、增加蛋白表达量，活性也大大提高。
【专利说明】
甲状腺过氧化物酶表达方法
技术领域
[0001] 本发明属于白蛋表达系统技术领域，具体涉及一种甲状腺过氧化物酶表达方法。
【背景技术】
[0002] 甲状腺是人体最大的内分泌腺，能分泌甲状腺素(T4)，三碘甲状腺原氨酸(T3)等激 素，这些激素受由腺垂体分泌的促甲状腺素(TSH)的调节，在人体生长发育、细胞代谢和体 内激素平衡，以及对维持糖、蛋白质、脂肪等代谢，骨骼肌和各器官系统的发育都起着十分 重要的调节作用。甲状腺功能紊乱为内分泌疾病中最常见者，至今并仍易被漏诊，据美国对 11个城市4.6万人的普查发现，约11%的人存在未被诊断出的各种甲状腺功能紊乱。甲状腺 功能紊乱分为甲状腺功能充进症（hyperthyroidism，简称甲充）和甲状腺功能减退症 (hy po thy r 〇 i d i sm，简称甲减）。
[0003] 甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，ΤΡ0)是一种含有血红素辅基的膜结合 糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3 kb，跨膜区的存在使TPO在表达 时难以分泌出来，伸向充满胶质滤泡腔的部分具有催化活性。TPO作为甲状腺激素合成过程 中的一种重要酶，能催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基 的偶联，最终生成甲状腺素（T3、T4) JPO也是甲状腺微粒体（thyroid microsomal，TM)的主 要抗原成分，当甲状腺发生病变，滤泡细胞结构受到破坏时，TPO于甲状腺滤泡细胞腔的边 缘即甲状腺细胞顶部向外周血遗漏，刺激机体免疫系统产生TPO抗体(TPO-Ab) JPO抗体通 过激活补体、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用和致敏的T杀伤细胞直接杀伤等作用，引起甲 状腺滤泡损伤，间接地抑制甲状腺素的合成，导致甲状腺功能减退。
[0004] 自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)是由T细胞介导的 器官特异自身免疫性疾病，患者血清内存在多种针对甲状腺抗原的自身抗体，甲状腺过氧 化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab)就是其中最重要的一种，普遍存在于 自身免疫性甲状腺疾病中，血清中甲状腺过氧化物酶抗体水平的测定，是对自身免疫性甲 状腺疾病高危人群筛查、诊断和治疗的有效手段。因此，TPO-Ab水平的检测可用于对甲减、 AITD等甲状腺疾病的诊断、病程进展、用药和愈后观察。对于AITD的诊断，TPO-Ab检测较甲 状腺微粒体抗体(TM-Ab)检测特异、直接和灵敏可靠，是诊断AITD的一项不可缺少的实验室 指标，国际上已将TPO-Ab水平作为AITD-个重要的常规检测项目。对原发性甲减患者，结合 hTSH升高，可以发现早期甲减病人。TPO-Ab的测定还可作为Graves病、桥本甲亢等诊断和鉴 别诊断的首选指标，所以，对以TPO抗原为基础的高效、低成本的甲状腺疾病检测试剂盒的 开发显得尤为重要。
[0005]目前，国内外所用的抗原都来自进口，成本较高（10000元/mg)，且较难订货，主要 以罗氏公司生产抗体为多，有关TPO制备的文献报导也很少，只有4~5篇文献。由于它分子量 大、糖基化修饰及磷酸化修饰非常丰富等的限制性，使它在大肠杆菌中难以表达，目前还是 以传统杆状病毒表达系统制备ΤΡ0,1993年，HAUBRUCK等利用杆状病毒表达系统对重组人甲 状腺过氧化物酶进行表达，分别将TPO的全长cDNA和可溶性TPO(缺失C端跨膜区和膜内区87 个氨基酸，并在C端增加含有亲和配体6 XHis的融合蛋白）的序列克隆到杆状病毒表达载 体，并转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda 9，Sf9)细胞。结果，含全长cDNA的重组TPO 蛋白在Sf9细胞内主要以不可溶的形式存在，重组可溶性TPO几乎完全分泌到细胞培养基 中。对全长的TPO和可溶性的TPO利用方便特异的亲和层析法纯化，并测试了它们的抗TPO抗 体的自身抗原性，用纯化后的可溶性TPO作为抗原建立的ELISA实验显示它在筛选自身免疫 甲状腺疾病病人血清中抗TPO抗体的特异性，可行性，和可重复性，在人甲状腺中得到可溶 性TPO和天然TPO的高度相关性，以此得到的抗原能明确的检测出病态血清，一致性达91%。
[0006] Jones等研究了重组免疫原性的甲状腺过氧化物酶在High Five昆虫细胞系中的 高水平表达，将编码膜外区的DNA序列克隆到杆状病毒转移载体pBlueBac III的多角体强 启动子下，并插入到AcMNPV基因组中，分别在两个昆虫细胞系，Sf9和High Five细胞中调 查重组TPO的表达水平，通过放射免疫性鉴定和SDS-PAGE及Western blot分析，这两个细胞 系都能够表达重组TPO蛋白，但High Five细胞的表达水平更高(30 mg/L培养基），并对培养 基中的TPO进行纯化和糖基化及免疫原性分析，凝集素亲和印迹和糖苷酶处理发现高甘露 糖和复合型糖残留这两个都与重组蛋白相关，基于生物素标记的ELISA和基于 125I标记的 免疫沉淀反应研究表明重组TPO和天然TPO对TPO自身抗体具有相同的活性， TPO的糖基化可能会破坏自身耐受性，然而，纯化后糖基化的重组TPO膜外功能区是解 释它在桥本氏甲状腺炎中角色的先决条件，2013年，Liu等就TPO的糖基化对血清中甲状腺 过氧化物酶抗体的识别是否有影响做了研究，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备了 重组TPO膜外功能区蛋白，用ELISA分析了它的抗原性，重组TPO膜外功能区蛋白能够被所有 的54个桥本氏甲状腺炎病人血清和3个TPO单克隆抗体识别，海藻糖，唾液酸和半乳糖都能 在重组TPO膜外功能区蛋白上检测出来，用高碘酸去糖基化后，血清TPO-Ab结合试验只有轻 微的减少，研究说明，High Five昆虫细胞来源的重组TPO膜外功能区蛋白有N-糖基化位 点，但是它在血清TPO-Ab抗体识别中几乎没有影响。
[0007] 现有技术常用的表达系统： 1.大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统应用最广，也是表达单个蛋白的首选系统，能在较短时间内获得表 达产物，方便快捷，可在载体构建中引入合适标签以便于目标产物的纯化和检测，但由于缺 乏翻译后加工能力，许多真核来源蛋白复合物在原核中难以正确装配或者装配后无功能活 性，且对大片段目的基因难以翻译表达，甲状腺过氧化物酶序列较大，在原核中难以表达。
[0008] 2.哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够对其所表达的外源蛋白进行多种修饰，使其能 够形成正确的天然构象。但目前哺乳动物细胞表达系统尚不成熟，细胞生长表达周期长，生 产工艺不易操控，限制了它的大规模应用。
[0009] 3.植物表达系统 通过转基因植物实现外源基因在植物体内的表达虽然已经比较成熟，已经发展了多种 载体构建方式和基因转化技术，但是因为机制太复杂容易产生基因沉默，且利用植物表达 系统表达较多的是植物自身蛋白质。
[0010] 4.昆虫细胞-杆状病毒表达系统 目前，甲状腺过氧化物酶的表达也基本上都是在杆状病毒表达系统内进行，杆状病毒 表达系统之所以能得到广泛的应用。尽管杆状病毒表达系统具有诸多优点，但是由于病毒 自身的特点，该表达系统也有它的不足之处：昆虫细胞对蛋白质的糖基化修饰与哺乳动物 细胞的的糖基化修饰还有一些差异；昆虫细胞培养基需要添加胎牛血清，且杆状病毒对宿 主细胞感染的最终结果是导致宿主细胞死亡，所以在实现外源基因表达时，每一轮实验，都 需要重新培养昆虫细胞，比较费时费力，使该系统的成本大大增加。
[0011] 5.杆状病毒-家蚕表达系统 虽然传统杆状病毒(AcMNPV)表达系统能够介导病毒颗粒在离体培养昆虫细胞内进行 装配，但其培养成本依然较高，需严格的无菌培养环境和价格昂贵的血清和培养基。且大规 模发酵培养昆虫细胞技术还不成熟，导致用培养细胞生产病毒样颗粒存在成本高、效率低 等不足之处。
[0012] 为提高杆状病毒表达载体系统（BEVS)中重组蛋白的分泌水平，东京大学 Futatsumori . Sugai等[19]在家蚕SPl基因的信号肽的基础上，通过向其N末端区域引入碱 性氨基酸(精氨酸)或向其C末端区域引入极性氨基酸(天冬酰胺），设计了几种新的信号肽， 将人白细胞介素 IL-4、IL-13以及IL-Il受体alphal(IL-llR alphal)的胞外区域分别与SPl 信号肽及改造后的SPl信号肽融合，然后采用ELISA方法逐一测试了这些信号肽对重组蛋白 分泌的提升效果。结果显示，在N末端区域引入精氨酸并未促进重组蛋白的分泌，但在C末端 区域引入天冬酰胺则提高了重组蛋白的分泌水平。该项研究提示，在杆状病毒表达载体系 统中，信号肽C末端区域的极性氨基酸对于重组蛋白的分泌至关重要。家蚕皮下注射接种要 求技术高，需预防细菌感染，而且接种工作量大，效率低下，即使操作熟练的人员也很难在 短时间内完成大规模接种，往往会错过病毒接种的最佳时机。
【发明内容】
[0013] 为解决现有技术存在的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种甲状腺过氧化物酶 表达方法，该表达方法TPO蛋白在家蚕-杆状病毒中的表达量和活性都远远高于传统杆状病 毒，活性大约是昆虫细胞表达的12.3倍，是TPO蛋白大量制备的最优表达系统。
[0014] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案:该甲状腺过氧化物酶表达方法，其特征 在于按下述步骤操作： 1) .TPO基因的克隆 ① 引物设计合成，上游添加 EcoR V、EcoR I位点，下游添加 Sal I位点， TP0E5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttc TPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg； ② TPO用LaTaq酶PCR扩增； ③ 琼脂糖电泳检测，检测正确者用胶回收试剂盒回收； 2) . T载体连接、转化、测序验证 为了方便测序检测扩增序列是否正确，将PCR回收产物连接到到pBackzero-T载体上。
[0015] ①连接； ② 转化到TOPlO感受态细胞中，在含有Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落； ③ 菌液PCR验证； ④ 酶切验证，PCR验证阳性的克隆，提质粒做酶切验证； ⑤测序，酶切验证正确的T-TPO; 3) .转移载体pFBDMY-TPO-IG的构建 质粒pFBDMY-IRES-eGFP是先缺失原始pFBDM中MSCl上的Spe I位点，命名为pFBDMY，后 又在BstB I和Pst I位点之间插入IRES和eGFP基因，IRES( internal ribosome entry site)基因，即内部核糖体进入位点，是mRNA分子内（而非5'端)可被核糖体识别并启动翻译 的一种顺式元件，eGFP转移到病毒基因组表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起 报告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表达； 将测序正确的T-TPO和pFBDMY-IRES-eGFP分别用EcoR I/Sal I酶切，回收，连接，PCR 验证，酶切验证，连接体系由如下试剂构成:载体回收lyL、片段回收4yL、Solution I 5yL， 连接混合物16°C反应3 h，其余与T载体的构建方法相同； 4) . Tn7位点的转座 齡制备 AcMultiBac/rSW106_inv+asd-和 BmMultiBac/rSW106_inv+ asd-转座感受态； _转座； 5) .重组病毒菌液感染Sf9昆虫细胞 将构建的pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重组病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆 虫细胞： ① 将 PCR 验证阳性的 AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重组病毒菌液（2~3 个菌落)接种到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培养基，于32°C 200 rpm振荡培养过夜;无 菌条件下分别取I mL菌液至灭菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm离心3 min，弃上清，用 无菌水重悬洗涤三次，洗掉菌液中DAP;最后无菌条件下用I mL无血清无双抗的Grace培养 基重悬沉淀，再用双无 Grace培养基稀释成ΙΟ'ΙΟΛ以六孔板为例，前一天将生长状态良 好的Sf9细胞转移到六孔板，隔夜培养，细胞密度为70%~80%时，吸出培养基，每孔加入I mL 双无 Grace(无血清，无双抗)稀释后的菌液，做好标记，四小时后，吸走上清，加入I mL完全 Grace培养基，三天后焚光检测； ② 将前一步骤①中获得的细胞上清作为Pl代重组杆状病毒，连续传代Pl代病毒，获得 P2、P3代重组杆状病毒； 6) 重组病毒菌液注射家蚕或重组病毒口服感染家蚕，生产重组病毒粒子Bm/TP〇-IG和 Bm/TP〇-IG/IH。
[0016] ELISA检测抗原活性 收集观察有绿色荧光的Sf 9细胞，离心收集上清，用裂解液将细胞沉淀裂解。观察有绿 色荧光的家蚕，从尾部取其血淋巴，解剖，弃中肠，将外皮粉碎。分别取细胞上清，在酶标仪 上波长450 nm处读取数据。
[0017]载体的构建 I) TPO的扩增 以购买的pGEM3Zf_TP0质粒为模板，引物TP0E5El、TP0SalR，用LaTaq进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳见图1。由图1可见，扩得约2500 bp的目的片段，也可见非特异性杂带，属于非特 异性扩增，切胶，用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆至T载进行序列测定。
[0018] 2) pBackZero-T-TPO 酶切验证 将TPO回收片段与PBackZero-T载连接，因 PBackZero-T是一种阳性克隆率极高而背景 极低的PCR产物克隆（TA Cloning)专用载体，几乎能达到99%，不需蓝白斑筛选，不需菌落 PCR验证，可直接提质粒酶切验证。pBackZero-T载体大小是3100 bp左右，酶切验证电泳图 见图2。由图2可看出，pBackZero-T-TPO连接验证正确，送公司测序；目的条带位置正确，较 亮，故先切胶冻存，如果测序正确，直接回收利用。
[0019] 3)测序结果 送去华大基因公司测序的pBackZero-T-TPO序列经过NCBI网站BLAST比对和DNAMAN软 件分析，TPO序列完全正确，没有发生突变，可以进行下一步实验。
[0020] 4) pFBDMY-TP〇-IG菌液PCR检测 以设计的TP0E5El、TP0SalR为引物，转化后的pFBDMY-TP〇-IG菌液为模板做菌液PCR检 测，结果见图3。1_9号是分别以9个单菌落摇起的菌液为模板的扩增产物，10号为阴性对照， 11号为阳性对照，阳性对照是以验证正确的质粒PBackZero-T-TPO为模板，阴性是以水为模 板，由图3可见，1、2、3、4和6号为阳性，扩得到2500 bp左右的片段，说明TPO基因可能已经连 接到转移载体上，取1、2和3号菌液接菌提质粒进一步验证。
[0021] 5) pFBDMY-TP〇-IG酶切验证 取上述菌液PCR验证阳性的1、2和3号菌液接菌提质粒，用EcoR I/Sal I酶切验证，目的 基因 TPO大小2500 bp左右，载体pFBDMY-IG大小6500 bp左右，结果见图4。由图4可见1号质 粒分别切出2500 bp和6500 bp左右的大小，说明1号质粒连接成功，2和3号没有连上，菌液 PCR结果为假阳性，1号质粒保存备用。
[0022] 6)重组病毒菌液PCR验证 分别将构建好的质粒pFBDMY-TPO-IG转座进大肠杆菌受体菌AcMultiBac/ rSW106-inv +ascf和BmMultiBac/rSW106-inv+ ascf中，经蓝白斑筛选，分别挑取4个白斑到含有抗生素和 营养素 Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的培养基中，32 °C过夜培养，做菌液PCR验证，结果见图5。1、2、3 和4号为AcMul tiBac/pFBDMY-TP〇-IG 的PCR 结果，5、6、7和8 号为BmMul t iBac/pFBDMY-TP〇-IG 的PCR结果，P为以质粒pFBDMY-TP〇-IG为模板进行PCR的阳性对照，N为以水为模板的阴性对 照， 另外，将pFBDMY-TPO-IG和pUCDM-IH同时转座进BmMultiBac/rSW106-inv+ asd-中，由于 多角体基因的存在，可以在细胞或家蚕体内形成包涵病毒粒子的多角体，当用多角体喂食 家蚕时，家蚕中肠肠液的强碱性使多角体溶解，释放出病毒粒子，多角体病毒对中肠上皮细 胞具有很强的感染性，这样，可以省去人工注射家蚕的高难度操作。pFBDMY-TPO-IG和 pUCDM-IH同时转座进BmMultiBac/rSW106-inv+ asd-的重组病毒菌液TPO和ph的PCR验证，结 果见图3-6。挑6个白斑，1-6号是TPO的菌液PCR，7号为以pFBDMY-TP〇-IG为模板的TPO阳性对 照，8号为以水为模板的TPO阴性对照，9-14号为菌液的ph PCR，15号为以pUCDM-IH为模板的 Ph阳性对照，16号为以水为模板的ph阴性对照， 由图5可见，1、3、4、5、6、7和8号为阳性，分别挑3管菌接100 yL到5 mL培养基中，过夜 培养，感染Sf9细胞和家蚕。
[0023]由图6可见，挑选的6个菌斑PCR鉴定都是阳性菌，接菌到含有Kan/Tet/Gm/Cm/Spe/ DAP的LB培养基，32 °C过夜培养，注射家蚕。
[0024] 7)重组病毒感染细胞检测 按照前述表达的方法，用缺陷型重组病毒菌液AcMultiBac/rSW106-pFBDMY- TPO-IG- inv+ascf直接感染Sf9昆虫细胞，三天后在倒置荧光显微镜蓝色激发光下可看见细胞发出绿 色荧光，结果见图7 A，为提高病毒的滴度，将收获的Pl代病毒盲传3代，病毒在传代过程中， 毒力增加使细胞病变的时间缩短，感染后表达荧光蛋白的细胞也增多，到第3代病毒感染细 胞72小时观察，结果见图7 B，几乎所有细胞都被感染，都能在荧光显微镜下呈现出绿色荧 光，得到重组病毒Ac/TPO-IG。
[0025] 8)重组病毒感染家蚕荧光检测 按照前述表达的方法，将含有重组病毒的细菌液BmMultiBac/rSW106-pFBDMY -TPO-IG-inv+ascf直接注射五龄家蚕，7天后观察发现，被注射重组病毒菌液的家蚕与正常家蚕有 明显的区别，体态透明，体节缩短，在NiKon荧光解剖镜下观察，可见注射重组病毒菌液的家 蚕有明显的绿色荧光，而正常家蚕没有荧光，随机挑取家蚕拍照，结果见图8。
[0026]从图8 B可以看出，被注射重组病毒的家蚕7天后产生非常明显的绿色荧光，也就 是说杆状病毒携带的荧光蛋白基因得到了很好的表达。而且，被注射的家蚕几乎没有死亡， 这也证明了用缺陷型重组杆状病毒细菌直接注射家蚕来高效表达外源基因，不仅高效方便 而且也是非常安全的。
[0027] 9重组病毒家蚕血淋巴细胞荧光和多角体检测 将含有重组病毒的细菌液BmMultiBac/rSW106-pFBDMY-TP0-IG/pUCDM-IH /inv+ascf 注射五龄家蚕，7天后观察发现，被注射重组病毒菌液的家蚕体态透明，体节缩短，在NiKon 荧光解剖镜下观察，可见注射重组病毒菌液的家蚕有明显的绿色荧光，取其血淋巴，在 TE2000倒置荧光显微镜白光下观察到多角体，见图9 B;在蓝色激发光下观察到绿色荧光， 见图9 C;取注射无菌水的家蚕血淋巴细胞做对照，没有观察到多角体和荧光，见图9 A。在 注射了重组病毒菌液的家蚕血淋巴细胞内可明显看到多角体和绿色荧光，而正常家蚕没 有，说明重组杆状病毒成功在家蚕体内产生，得到的多角体，可以直接口服感染家蚕。
[0028]蛋白表达成本分析 由于各系统表达的TPO后期都需要纯化，所以纯化成本和人力不计，主要比较表达过程 的成本。培养Sf 9细胞的主要成本有:Grace培养基干粉：100元/瓶(配制IL完全培养基），胎 牛血清：3200-9600元/L(配制10 L完全培养基），合计Grace培养基大约600元/L，酵母培养 的主要成本有:酵母提取物：236元/500 g，蛋白胨:380元/500 g，YNB:1100元/500 g(配制 20L培养基），Zeocin抗生素 :384元/mL，合计培养基大约80元/L，家蚕培养主要以桑叶为主， 大约0.1元/头。
[0029]综合以上表达量、活性、成本分析，比较TPO在这两个表达系统中的性价比，以成本 600元为定量，综合以上数据，可得杆状病毒昆虫细胞内能表达TPO 9.5 mg、活性是3.7X 10411]，比活性是3.89\10311]/1职;杆状病毒6000头家蚕内能表达87.6 11^、活性是4.55\ IO5 IU，比活性是5.19X103 IU/mg;酵母内能表达SUM0/TP0 66.75 mg、活性是6.12X103 IU，比活性是0.92 XlO2 IU/mg;利用pPICZa-A载体能表达Z-TPO 30.75 mg、活性是 1.18 X IO4 IU，比活性是3.84 XlO2 IU/mg，见表9。
[0030]表9 TPO蛋白在相同成本600元下不同表达系统中的表达量、抗原活性和比活性比
可看出TPO蛋白在家蚕-杆状病毒中的表达量和活性都远远高于传统杆状病毒，活性大 约是昆虫细胞表达的12.3倍，利用酵母表达系统，虽然目标蛋白的表达量较高，但是活性却 不如杆状病毒，可以对其进一步改进或优化，而杆状病毒家蚕表达系统则可以是TPO蛋白大 量制备的最优表达系统。
[0031] TPO主要借助于ELISA方法研究患者血清中甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)。主要 临床应用有诊断桥本氏病和自身免疫性甲状腺疾病；甲状腺功能亢进症、原发性甲状腺功 能减退症;毒性弥慢性甲状腺肿(Graves);监测免疫治疗效果;检测家族甲状腺疾病的发病 可能;预测孕妇产后甲状腺功能障碍的发生。
[0032]本发明表达纯化的TPO用于制备甲状腺疾病检测试剂盒，试剂盒里TPO的质量要求 OD45q在1.0以上，原始设计方案中期望酵母的活性能达到要求值，并且能分泌到上清中，省 去后续纯化的成本，但是实际在酵母表达体系中，测得OD值没有达到1.0，灵敏度不够，并且 TPO未分泌到上清中，所以目前排除酵母表达系统制备ΤΡ0。使用传统杆状病毒表达ΤΡ0,开 发试剂盒，表达9.5 mg蛋白，表达成本是600元，纯化成本是200元，人工计2000元，估计生产 的成本大约是295元/mg，也可以使用发酵罐高密度发酵，提高效率，与进口 TPO价格的10000 元/mg相比，大大降低了TPO的成本，可用于代替进口产品在国内外出售，降低试剂盒的成 本。TPO在家蚕内的生产效率更高，表达87.6 mg蛋白，表达成本是600元，纯化成本是1850 元，人力计2000元，生产成本大约是51元/mg，且灵敏度更高。传统杆状病毒和杆状病毒-家 蚕生物反应器制备的TPO在今后甲状腺疾病临床检测试剂盒的使用中起着非常重要的作 用，有着广阔的应用前景。
【附图说明】
[0033]图 1 为TPO的PCR产物电泳分析，M:DL 5000 DNA Marker; 图2为口8&。1^61〇-1^?0双酶切产物电泳分析，]\1:01^ 5000 0嫩1&^1?^; 图3为pFBDMY-TP〇-IG菌液PCR电泳检测，1-9:以9个单菌落摇起的菌液作模板的扩增 产物，1 〇:阴性对照，11:阳性对照，M: DL 5000 DNA Marker; 图4为pFBDMY-TP〇-IG双酶切产物电泳分析，1:1号质粒，2:1号质粒酶切，3:2号质粒， 4:2号质粒酶切，5:3号质粒，6:3号质粒酶切，M:DL 10000 Marker; 图5重组病毒菌液TPO PCR检测，l-4:AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG的4个单菌落PCR产 物，5-8:BmMultiBac/pFBDMY-TP〇-IG的4个单菌落PCR产物，P:阳性对照，N:阴性对照，M:DL 5000 Marker； 图6 重组病毒菌液TPO和ph PCR检测，1-6:6个BmMultiBac/pFBDMY-TP〇-IG/pUCDM-IH 单菌落的TPO PCR产物，7:TPO阳性对照，8:TPO阴性对照，9-14:6个BmMultiBac/pFBDMY-TPO-IG/pUCDM-ΙΗ单菌落的ph PCR，15:ph阳性对照，16:ph阴性对照，M:DL 5000 Marker; 图7缺陷型重组病毒菌液直接感染Sf9细胞荧光结果，A:重组病毒菌液直接感染 胞三天后焚光结果B:盲传三代后焚光结果； 图8缺陷型重组病毒菌液直接注射家蚕荧光结果，A:注射重组病毒菌液的家蚕7天后 自然光下照片，B:注射重组病毒菌液的家蚕7天后NiKon焚光解剖镜下的照片，con:用无菌 水注射作对照的家蚕，green:注射重组病毒发绿色焚光的家蚕； 图9缺陷型重组病毒菌液直接注射家蚕血淋巴细胞多角体和荧光观察，A:注射无菌水 的家蚕血淋巴细胞B:注射重组病毒菌液的家蚕血淋巴细胞的多角体观察C:注射重组病毒 菌液的家蚕血淋巴细胞的荧光观察； 图10侵染蛋白介导的直接生产重组病毒的原理与过程图。
【具体实施方式】
[0034] 1菌株、质粒、病毒、细胞、家蚕 用于转化普通质粒的大肠杆菌E.coli TOPlO菌株，严谨型阿拉伯糖启动子控制的带有 入侵蛋白（invasin)的二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型SW106菌株由河南省伏牛山昆虫生物 学实验室构建保存。含两个强启动子（PlO and polh)的质粒pFBDM和pUCDM由T. J. Richmond惠赠，质粒pFBDMY-IG和pUCDM-IH是由本实验改造 pFBDM和pUCDM所得(缺失掉Spe I酶切位点，在BstB I位点和Pst I位点之间插入核糖体结合位点IRES基因（简写I)和起报 告基因作用的加强型绿色荧光蛋白基因 eGFP(简写G)或多角体基因 ph(简写H)，IRES有助于 绿色荧光蛋白和多角体蛋白的表达）。河南省伏牛山昆虫生物学实验室用的TPO基因是由武 汉三鹰公司购买，Sf 9细胞和家蚕品系由上述实验室保存。
[0035] 菌株63115，表达载体??吐31]]\?)8七3广？？102€[4均由河南省伏牛山昆虫生物学实验 室提供，PPahSUMOstar载体是在pPICZa-A的基础上改造来的，在pPICZa-A载体的α信号肽后 增加 SUMO融合蛋白。载体又经改造(增加酶切位点EcoR I、Nde I、Sph I、Xba I及氨苄抗性 基因 amp)，命名为pPahSUM0-Y，pPICZa-Y。
[0036] 1.2酶和试剂 限制性内切酶购自NEB、Fermentas和TaKaRa公司；Solution I DNA连接酶购自TaKaRa 公司；Taq酶及PCR所需试剂、T载体pBackzero-T和DNA分子量MarkeKDL 2000、DL 5000和 DL 10000等)均购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒，凝胶回收试剂盒，PCR溶液回收试剂盒 购自AXYGEN公司；Tris平衡酚购自Solarbio公司；二氨基庚二酸(DAP)、异丙基硫代半乳糖 苷(IPTG)W-半乳糖苷酶(X-Gal)、氨苄青霉素(Amp)、庆大霉素(Gm)、氯霉素(Cm)、博莱霉素 (Zeocin)等抗生素均为Invitrogen公司产品。
[0037] 蛋白MakeHPageRulerTM Prestained Protein Ladder)购自Fermentas公司； Western blot显色液、6XHis单克隆鼠抗、HRP标记羊抗鼠二抗购自碧云天公司，TPO抗体的 活性ELISA试剂盒由郑州安图生物有限公司惠赠，其他的常规生化及分子生物学试剂购自 郑州久是生物公司。引物合成和测序工作由华大基因公司合成。
[0038] 2分子生物学基本操作 2.1质粒的提取 本方法参照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取说明书。
[0039] (1)取1~4 mL在LB培养集中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基，菌液体积应减半 或更少），12000 g离心I min，弃尽上清； (2)加入250 yL的Buffer S1，在振荡器上悬浮沉淀，使溶液完全混匀，不应留有小的菌 块； (3) 加入250 yL的Buffer S2，温和地上下翻转5~6次混合均匀，使菌体充分裂解，直至 形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min; (4) 加入350 yL的Buffer S3,温和并充分的上下翻转颠倒6~8次，12000 g离心10 min; (5) 转移上清到制备管(置于2 mL离心管(试剂盒内提供）中），12000 g离心I min，弃滤 液； (6) 将制备管置回离心管，加500 uL Buffer Wl，12000 g离心I min，弃滤液； (7) 将制备管置回离心管，加700 yL Buffer W2,12000 g离心I min，以同样的方法再 用700 nL Buffer W2洗涤一次，弃滤液； (8) 将制备管置回2 mL离心管中，12000 g离心I min; (9) 将制备管移入新的1.5 mL离心管(试剂盒内提供）中，在制备膜中央加70 uL经65°C 水浴预热的Eluent，室温静置I min，12000 g离心I min; (10) DNA产物-20°C保存备用。
[0040] 2.2琼脂糖凝胶电泳和胶回收 (1)琼脂糖凝胶电泳 按1%比例，称取Ig琼脂糖，加入100 mL的I X TAE缓冲液，加热融化琼脂糖，待冷却至50 °C左右，加入I uL EB混匀后倒板，插上梳子，注意不要有气泡。待胶凝固后，取下梳子上样， 以120 V电压进行电泳。
[0041] (2)琼脂糖凝胶回收(参照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒） ① 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算 凝胶数量(提前记录1.5 mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积； ② 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C加热，间断混合(每 2~3 min)，直至凝胶块完全恪化(约6~8 min); ③ 加入0 · 5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；吸取溶胶管中的混合液，转 移到DNA制备管(置于2 mL离心管中），12000 g离心I min，弃滤液； ④ 将制备管置回2 mL离心管，加500 uL的Buffer Wl，12000 g离心30 s，弃滤液； ⑤ 将制备管置回2 mL离心管，加700 yL的Buffer W2，12000 g离心30 s，以同样的方法 再用700 μL的BufferW2洗涤一次，12000 g离心I min; ⑥ 将制备管置回2 mL离心管中，12000 g离心I min; ⑦ 将制备管移入新的1.5 mL离心管(试剂盒内提供）中，在制备膜中央加25仙经65°C水 浴预热的Eluent，室温静置I min，12000 g离心I min; ⑧ DNA产物-20 °C保存备用。
[0042] (3) PCR溶液回收 本方法参照AxyPrep PCR清洁试剂盒回收说明书。
[0043] ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A(若Buffer PCR-A不足100 uL，加至100 uL);混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管(试剂 盒内提供)中，12000 g离心I min，弃滤液； ② 将制备管置回2 mL离心管，加700 uL Buffer W2,12000 g离心I min，弃滤液(确认 在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇）； ③ 将制备管置于离心管中，将制备管置回2 mL离心管，加500 nL Buffer W2，12000g离 心lmin，建议提醒:从离心机中取出2 mL离心管时，注意不要让管底的Buffer W2接触到制 备管； ④将制备管置于洁净的1.5 mL离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加25 nL Eluent，室温静置I min，12000 g离心I min洗脱DNA，将Eluent加热至65°C将提高洗脱效 率。
[0044] 2.4感受态细胞的制备方法 (I) CaCl2感受态的制备 ① 在无抗LB固体培养基上划线，过夜培养； ② 接种一个单菌落于一个5 mL的LB液体培养基中，37°C，200 r/min振荡培养过夜； ③ 按1:100的比例将过夜培养菌液加入到新鲜无抗的LB液体培养基中，于37°C振荡培 养2~3 h至OD6QQ达到0.4~0.6之间； ④ 将菌液转移至50mL预冷的高压灭菌的聚丙烯离心管中，冰上放置20 min，4°C，3000 g离心10 min，弃上清； ⑤ 细胞沉淀用10 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，4°C，3000 g离心10 min，弃上 清； ⑥ 细胞沉淀用10 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，冰上放置30 min，4°C，3000 g 离心10 min，弃上清； ⑦ 用I mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置4 h; ⑧ 加入终浓度为15%的甘油，轻轻混勾，按每管100 yL分装到预冷的1.5 mL Eppendorf 管中，立即冻存于-80°C冰箱。
[0045] (2)酵母感受态的制备 ① 在无抗YPDS固体培养基上划线，30°C培养2~3天，至长出单菌落； ② 挑取单菌落GS115菌接种于5 mL YH)液体培养基，30 °C培养过液； ③ 取过液培养的菌液2 mL接种于100 mL新鲜YPD液体培养基，再于30°C培养至 0D600=1.3~1.5; ④ 在4°C，4000 rpm离心2 min，用 10 mL (TC LiAc:DTT(9:l)重悬，处理20 min; ⑤ 离心同上，再重悬于10 mL 0°C无菌水； ⑥ 重复⑤； ⑦ 离心同上，重悬于10 mL (TC I M山梨醇溶液； ⑧ 离心同上，再重悬于I mL (TC I M山梨醇溶液，分装，每80 nL-管，置于冰上（当天 使用）。
[0046] 2.5昆虫细胞培养基本操作 (1)细胞的复苏 非原代培养细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏： ① 水浴锅温度调至37°C，并将含10% FBS的培养液置于其中预热； ② 从液氮罐中取出所要细胞，立即置于37°C水浴锅使其快速解冻； ③ 将冻存管及培养液瓶的外表面用医用酒精擦拭，放入超净台； ④ 将细胞悬液移到离心管中，并加入I mL培养基，用吸管轻轻吹打； ⑤ 1500 rpm离心3 min; ⑥ 弃去上清液，加入I mL培养液，吹打均匀，使细胞悬浮； ⑦ 将细胞悬液移到50 mL培养瓶中，补加约5 mL培养液;置于细胞培养箱培养。
[0047] (2)细胞的传代 培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累(可见 到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存，这时就需 要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
[0048]悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即 可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000~ 1500 rpm离心3 min，弃上清，加入约2 mL培养液，吹打至均匀，滴加2~3滴至已加入新鲜培 养液的培养瓶中，然后置于培养箱中培养(抒松培养基瓶盖）。
[0049] (3)细胞的冻存 ① 细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害； ② 贴壁细胞经消化、离心收集，悬浮细胞经离心收集； ③ 大约IO6个细胞加入I mL冻存液，用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液； ④ 把细胞悬液加入到冻存管中。如用1.8 mL的冻存管，每个冻存管最好不要加入超过 1.5 mL细胞悬液； ⑤ 在冻存管上标明细胞名称及冻存日期； ⑥ 用厚布或卫生纸包裹冻存管，置于4°C 0.5 h，然后置于-20°C 2 h，再置于-40°C 2 h，然后置于-80°C过夜;第二天将细胞置于液氮中； ⑦ 记下冻存管存放的位置，作好冻存记录。
[0050] 2.6家蚕品系与饲养条件 实验室所用的家蚕品系为大造 P50，蚕卵保存在4°C，相对湿度75%~85%，使用时，给蚕卵 解除滞育： (1) 取4°C条件下保存的滞育蚕卵，25°C条件下在21.92%的HCl(取59 mL 37%的HCl定 容至100 mL)中浸泡80 min; (2) 用清水冲洗干净，25°C条件下再用3%的甲醛(取8.1 mL 37%的甲醛溶液定容至100 mL)浸泡30 min; (3) 用清水冲洗至无味，阴干后在28°C条件下恒温培养至孵化。
[0051] 孵化后的幼虫在恒温25°C左右，自然光周期条件下，用新鲜桑叶饲养。
[0052]该甲状腺过氧化物酶表达方法，按下述步骤操作： I).TPO基因的克隆 ① 引物设计合成，上游添加 EcoR V、EcoR I位点，下游添加 Sal I位点， TP0E5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttc TPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg； ② TPO用LaTaq酶PCR扩增，以购买的pGEM3Zf-TP0为模板，配制PCR体系：LaTaq 0·5μ UlOXLaTaq Buffer 5yL、10X dNTP 4yL、引物TP0E5El(20mM)lyL、引物TP0SalR(20mM)ly L、模板〇.5yL、ddH2〇 up to 5〇yL。
[0053] ③PCR扩增程序，95°C预变性5 min，95°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸3 min，从第二步开始循环，总共30个循环，最后再72°C延伸10 min。
[0054] ④琼脂糖电泳检测。120 V电压，电泳30 min，凝胶成像系统检测分析，检测正确者 用胶回收试剂盒回收。
[0055] 2). T载体连接 为了方便测序检测扩增序列是否正确，将PCR回收产物连接到到pBackzero-T载体上。
[0056] :書连接，配制连接体系：T载体0.3uL、PCR片段SJyUSolution I 2.5uL，连接混 合物16°C反应30 min。
[0057] ②转化到T0P10感受态细胞中，连接产物全量（5 uL)加入至100 uL冰上解冻的 T0P10感受态细胞中，冰中放置30 min，42°C热激90 S后，再冰浴2 min，加入800 UL LB培养 基，37 °C振荡培养60 min，在含有Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
[0058]③菌液PCR验证，挑选5~10个单菌落，分别接种到800 uL添加有Amp抗生素的LB液 体培养基，37°C，200 rpm振荡过夜培养，各取I uL菌液为模板，用TP0E5E1、TP0SalR作引物， 做PCR检测，并作阴阳性对照。
[0059] ④酶切验证，PCR验证阳性的克隆，接菌到5 mL含Amp抗生素的LB液体培养基中，37 °C，200 rpm振荡过夜培养，提质粒做酶切验证。
[0060] ⑤测序，酶切验证正确的Τ-ΤΡ0,取两个克隆的菌液500 UL加15%甘油寄到北京奥 科生物公司测序。
[0061 ] 3).转移载体pFBDMY-TP〇-IG的构建 质粒pFBDMY-IRES-eGFP是先缺失原始pFBDM中MSCl上的Spe I位点，命名为pFBDMY，后 又在BstB I和Pst I位点之间插入IRES和eGFP基因，IRES( internal ribosome entry site)基因，即内部核糖体进入位点，是mRNA分子内（而非5'端)可被核糖体识别并启动翻译 的一种顺式元件，eGFP转移到病毒基因组表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起 报告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表达； 将测序正确的T-TPO和pFBDMY-IRES-eGFP分别用EcoR I/Sal I酶切，回收，连接，PCR 验证，酶切验证，连接体系由如下试剂构成:载体回收lyL、片段回收4yL、Solution I 5yL， 连接混合物16°C反应3 h，其余与T载体的构建方法相同。
[0062] 4乂 Tn7位点的转座 二制备 AcMul tiBac/rSWl 06-inv+asd-和 BmMul tiBac/rSWl 06-inv+ asd-转座感受态 取一管保种的AcMultiBac/rSW106-inv+asd-菌液，在加有Kan/Tet/Spe/DAP/ IPTG/X-Gal抗生素平板上面划线，32°C培养48 h，挑取蓝斑单菌落接种于5 mL含Kan/Tet/Spe/DAP 的LB培养基中，32°C培养过夜;按1:100吸取过夜的AcMultiBac/rSW106-inv+ascT菌液至含 DAP的LB培养基中，30°C恒温振荡培养至0D600=0.2时，加入终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖诱 导激活宿主菌rSW106上Cre酶，继续培养至OD 6qq=O . 4~0.6，CaCl2常规方法制备感受态细胞， 每管分装100 ]jL，按相同的方法制备BmMultiBac/rSW106-inv+ascT感受态。
[0063] ζ 转座 取一管上面做好的AcMultiBac/rSW106_inv+asd-感受态，冰上解冻，加入8 yL质粒 pFBDMY-TPO-IG，冰浴30 min，42°C热激90 s，再置于冰上冷却3 min，后加入I mL含有DAP的 LB培养基，32 °C 恒温，200 rpm，振荡培养6 h左右，涂含Kan/Tet/Gm/DAP/Spe/IPTG/X-Gal 的 LB平板，32°C恒温培养24 h~48 h，至蓝白斑出现，在蓝斑附近挑取5~10个大且圆的白斑到 Kan/Tet/Cm/DAP的LB培养基，32 °C恒温振荡过夜培养，用TPO的引物做PCR验证，验证正确的 菌种保留备用；按照同样的方法，将质粒pFBDMY-TPO-I G和pUCDM-1H同时转座到 BmMultiBac/rSW106-inv+asd_感受态细胞，得到重组病毒的阳性菌液； 5) .重组病毒菌液感染Sf9昆虫细胞 将构建的pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重组病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆 虫细胞： I 将PCR验证阳性的AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重组病毒菌液（2~ 3个菌落)接种到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培养基，于32°C200 rpm振荡培养过夜;无 菌条件下分别取I mL菌液至灭菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm离心3 min，弃上清，用 无菌水重悬洗涤三次，洗掉菌液中DAP;最后无菌条件下用I mL无血清无双抗的Grace培养 基重悬沉淀，再用双无 Grace培养基稀释成ΙΟ'ΙΟΛ以六孔板为例，前一天将生长状态良 好的Sf9细胞转移到六孔板，隔夜培养，细胞密度为70%~80%时，吸出培养基，每孔加入I mL 双无 Grace(无血清，无双抗)稀释后的菌液，做好标记，四小时后，吸走上清，加入I mL完全 Grace培养基，三天后焚光检测； ②将前一步骤①中获得的细胞上清作为Pl代重组杆状病毒，连续传代Pl代病毒，获得 P2、P3代重组杆状病毒； 6) 重组病毒菌液注射家蚕或重组病毒口服感染家蚕，生产重组病毒粒子Bm/TP〇-IG和 Bm/TP〇-IG/IH。
【主权项】
1. 一种甲状腺过氧化物酶表达方法，其特征在于按下述步骤操作： 1).TP0基因的克隆 ① 引物设计合成，上游添加 EcoR V、EcoR I位点，下游添加 Sal I位点， TP0E5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttc TPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg； ② TP0用LaTaq酶PCR扩增； ③ 琼脂糖电泳检测，检测正确者用胶回收试剂盒回收； 2 ). T载体连接、转化、测序验证 为了方便测序检测扩增序列是否正确，将PCR回收产物连接到到pBackzero-T载体上； :1:连接； ② 转化到T0P10感受态细胞中，在含有Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落； ③ 菌液PCR验证； ④ 酶切验证，PCR验证阳性的克隆，提质粒做酶切验证； ⑤ 测序，酶切验证正确的T-TP0; 3) .转移载体pFBDMY-TPO-IG的构建 质粒pFBDMY-IRES-eGFP是先缺失原始pFBDM中MSC1上的Spe I位点，命名为pFBDMY，后 又在BstB I和Pst I位点之间插入IRES和eGFP基因，IRES( internal ribosome entry site)基因，即内部核糖体进入位点，是mRNA分子内（而非5'端)可被核糖体识别并启动翻译 的一种顺式元件，eGFP转移到病毒基因组表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起 报告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表达； 将测序正确的T-TP0和pFBDMY-IRES-eGFP分别用EcoR I/Sal I酶切，回收，连接，PCR 验证，酶切验证，连接体系由如下试剂构成:载体回收lyL、片段回收4yL、Solution I 5yL， 连接混合物16°C反应3 h，其余与T载体的构建方法相同； 4) . Τη7位点的转座 X.制备AcMultiBac/rSW106_inv+asd-和BmMultiBac/rSW106_inv+ asd-转座感受态； S转座； 5) .重组病毒菌液感染Sf9昆虫细胞 将构建的pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重组病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆 虫细胞： T 将PCR验证阳性的AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重组病毒菌液（2~3 个菌落)接种到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培养基，于32°C200 rpm振荡培养过夜;无 菌条件下分别取1 mL菌液至灭菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm离心3 min，弃上清，用 无菌水重悬洗涤三次，洗掉菌液中DAP;最后无菌条件下用1 mL无血清无双抗的Grace培养 基重悬沉淀，再用双无 Grace培养基稀释成ΙΟ'ΙΟΛ以六孔板为例，前一天将生长状态良 好的Sf 9细胞转移到六孔板，隔夜培养，细胞密度为70%~80%时，吸出培养基，每孔加入1 mL 双无 Grace(无血清，无双抗)稀释后的菌液，做好标记，四小时后，吸走上清，加入1 mL完全 Grace培养基，三天后焚光检测； ②将前一步骤①中获得的细胞上清作为P1代重组杆状病毒，连续传代P1代病毒，获得 P2、P3代重组杆状病毒； 重组病毒菌液注射家蚕或重组病毒口服感染家蚕，生产重组病毒粒子Bm/TPO-IG和Bm/ TPO-IG/IHo2.如权利要求1所述的甲状腺过氧化物酶表达方法，其特征在于：步骤4)Tn7位点的转 座按下述操作： ::Γ.制备 AcMultiBac/rSW106_inv+asd-和 BmMultiBac/rSW106_inv+ asd-转座感受态 取一管保种的AcMultiBac/rSW106-inv+asd-菌液，在加有Kan/Tet/Spe/DAP/ IPTG/X-Gal抗生素平板上面划线，32°C培养48 h，挑取蓝斑单菌落接种于5 mL含Kan/Tet/Spe/DAP 的LB培养基中，32°C培养过夜;按1:100吸取过夜的AcMultiBac/rSW106-inv+ascT菌液至含 DAP的LB培养基中，30°C恒温振荡培养至0D600=0.2时，加入终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖诱 导激活宿主菌rSW106上Cre酶，继续培养至0D 6Q()=0.4~0.6，CaCl2常规方法制备感受态细胞， 每管分装100 ]jL，按相同的方法制备BmMultiBac/rSW106-inv+ascT感受态； ?转座 取一管上面做好的AcMultiBac/rSW106_inv+asd-感受态，冰上解冻，加入8 yL质粒 pFBDMY-TPO-IG，冰浴30 min，42°C热激90 s，再置于冰上冷却3 min，后加入1 mL含有DAP的 LB培养基，32 °C 恒温，200 rpm，振荡培养6 h左右，涂含Kan/Tet/Gm/DAP/Spe/IPTG/X-Gal 的 LB平板，32°C恒温培养24 h~48 h，至蓝白斑出现，在蓝斑附近挑取5~10个大且圆的白斑到 Kan/Tet/Cm/DAP的LB培养基，32 °C恒温振荡过夜培养，用TP0的引物做PCR验证，验证正确的 菌种保留备用；按照同样的方法，将质粒pFBDMY-TPO-I G和pUCDM-1Η同时转座到 BmMultiBac/rSW106-inv+asd_感受态细胞，得到重组病毒的阳性菌液。
【文档编号】C12N15/866GK105861458SQ201610246851
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】姚伦广, 王铁军, 阚云超, 胡小敏, 郭保党, 吕慧芳, 邢秋婷, 王立方
【申请人】南阳师范学院