向阴道递送过氧化物产生酶的制作方法

专利名称：向阴道递送过氧化物产生酶的制作方法
背景技术：
健康的阴道微环境包含过氧化氢并具有约4-5的pH。健康阴道内的优势生物包括乳酸杆菌和其它革兰氏阳性菌；不过，病原生物，如念珠菌(Candida)，也在正常阴道环境中以低水平存在。许多方式都可以破坏正常的环境，包括一系列抗生素、绝经期和其它因素。这些破坏经常导致感染，或病原微生物数目的增多以及乳酸杆菌和其它革兰氏阳性有益菌的减少。当革兰氏阳性菌在阴道中减少或消失时，阴道pH上升，氧化作用降低，并且由革兰氏阴性菌或其它病原微生物，包括革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性球菌的异常增多导致正常阴道细胞菌群的紊乱，这能够引发对人身体的伤害并且导致各种疾病和症状，包括细菌性阴道炎。
现有的用于治疗革兰氏阳性菌菌群减少和病原微生物数目增多的方法并不特别有效。例如，使用抗菌药物抑制革兰氏阴性菌和其它异常细菌的生长。不过，这些药物可能对病人导致显著的副作用。而且，抗菌药物也可能抑制革兰氏阳性菌的生长，导致重建健康阴道微环境的困难。在阴道中直接给药乳酸杆菌也不十分有效，因为它经常不能带来稳定的菌群建群。这两种治疗以及许多其它的治疗的其它限制，是它们不是简单地通过维持、改善或产生可接受的阴道环境条件来试图使阴道菌群生长环境正常化。
因而，本领域需要治疗正常阴道细菌菌群紊乱和促进革兰氏阳性菌，包括乳菌杆菌的阴道生长/重新建群的组合物和方法。
发明概述本发明涉及这样一种发现，即阴道菌群的失调可以通过向哺乳动物，例如人的阴道(阴道内地)给药有效量的至少一种过氧化物产生酶，如过氧化氢产生酶，以及有效量的至少一种合适的底物来进行有效治疗。例如，本发明涉及过氧化物产生酶长期产生低剂量的过氧化物以便有助于恢复和/或维持健康的阴道微环境的用途。因此，本发明提供诱导和维持阴道中氧化性微环境的治疗性和/或预防性组合物和方法，从而控制引发阴道菌群紊乱的微生物的生长。
本发明的一个实施方案是一种组合物，所述组合物用于哺乳动物中阴道细菌菌群紊乱的治疗性或预防性治疗，包括阴道给药有效量的含有酶的组合物，所述酶能够在向所述哺乳动物的阴道给药所述组合物后产生过氧化物。此外，该组合物可以包括所述酶能够作用其以便产生过氧化物的底物，和/或一种载体用于递送至阴道。例如，所述底物包括可氧化的底物，而所述酶是氧化还原酶，其作用产生过氧化物，如过氧化氢。所述载体可以是任何材料，包括栓塞、注射器样的涂药器或液体。
本发明的另一个实施方案是一种治疗或预防哺乳动物中阴道细菌菌群紊乱的方法，包括包括阴道给药有效量的组合物，所述组合物含有能够在向所述哺乳动物的阴道给药所述组合物后产生过氧化物的酶。此外，该组合物可以包括所述酶能够作用其以便产生过氧化物的底物和/或一种载体用于递送至阴道。
本发明的一个实施方案是一种用于哺乳动物中阴道细菌菌群紊乱的治疗性或预防性治疗的制品，包括能够产生过氧化物的酶，该制品适用于阴道。
附图简述

图1是缘自乙醇氧化酶(1.0单位于0.5ml)活性以羧甲纤维素(0.25％w/v)随着时间(于pH 6.3，不加入起始过氧化物，37℃于标准大气压摇动)产生过氧化氢的图示。
图2是用各种浓度的过氧化氢随着时间(LBG培养基，pH 6.9和37℃于标准大气压摇动)抑制大肠杆菌(E.coli)生长的图示。
图3是用各种浓度的过氧化氢随着时间(蛋白胨培养基，pH 6.5和37℃于标准大气压摇动)抑制白色念珠菌(C.albicans)生长的图示。
图4是pH对过氧化氢生产影响的图示。描述了缘自乙醇氧化酶活性以羧甲纤维素作为pH功能的过氧化氢生产(不加入起始过氧化物，37℃于标准大气压摇动8小时后)。
图5是起始过氧化氢(H2O2)H2O2对生产影响的图示。描述了缘自缘自乙醇氧化酶活性以羧甲纤维素作为添加的起始过氧化氢功能的过氧化氢生产(于pH6.3，37℃于标准大气压摇动8小时后)。
图6描绘一种柱塞。
图7描绘一种注射器样的涂药器。
发明详述阴道感染或阴道细菌菌群紊乱通常是阴道微菌群失调的结果。一般，病原因素正常条件下低水平存在于健康阴道系统中。当一种减少乳酸杆菌和其它有益微生物的事件(例如，系统性抗生素或绝经期)发生时，有害的微生物增殖并在阴道中或阴道周围诱导致病状态，所述有益微生物正常情况下在健康系统中是占优势的。一种在阴道中的有益菌(例如，乳菌杆菌)抑制病原微生物生长的方法是通过过氧化氢的产生。过氧化氢，尽管对乳酸菌或阴道组织无害，但对于病原生物是有害的并且作用来使它们的数目保持在低水平。因而，向阴道给药一种或多种过氧化物产生酶，例如，过氧化氢产生酶对于抑制病原微生物的生长是有用的，同时允许乳酸杆菌增殖并且控制阴道微环境，并且因而建立一个健康的阴道环境。
本发明的方法和组合物对于阴道微菌群紊乱的预防性和/或治疗性治疗是有用的。如本文所用的，术语“阴道微菌群紊乱”意为阴道菌群正常动态平衡的失调，如与健康阴道环境相比革兰氏阳性菌的减少和/或革兰氏阴性菌的增多。本发明的方法或组合物可以起作用的具体紊乱或失调包括，但不限于，真菌性(例如，酵母感染)、细菌性(例如，细菌性阴道病)、病毒性或寄生虫性(例如，毛滴虫)感染。所述感染包括那些被特征描述/诊断为阴道炎、阴道念珠菌病和阴道病的那些感染。一些引发这类感染的微生物的例子包括念珠菌属，特别是白色念珠菌(Candida albicans)和热带念珠菌(C.tropicalis)，和T.glabrata，加德纳菌属(阴道性的)，各种混合的厌氧细菌和消化链球菌属(Peptostreptococcus)细菌。如果不予治疗的话，这些阴道感染可以导致阴道的病理性分泌、女性患者极大的不适，和/或严重的医学后果。
如本文所用的，术语“酶”意为一种作为催化剂在化学反应中起作用的分子。术语“底物”意为一种酶对其作用以产生一种所需产物的材料或物质。
如本文所用的，术语“有效量”意为对于治疗特定感染(例如，阴道微菌群紊乱)有效的并且为本领域技术人员可以确定的量。例如，有效量的酶和/或底物是足以抑制病原微生物(例如，革兰氏阴性菌)的量。
术语“可药用的”在此用于意指可以用于对人或其它哺乳动物进行治疗而不会引发不良作用，如毒性或起泡的材料。
如本文所用的，术语“过氧化物”意为任何包含二价离子-O-O-的化合物，包括，但不限于，包含，R1-O-O-R2型的氧-氧单键的化合物。例如，一种R1-O-O-R2型的化合物，其中R1和R2可以是氢、烷基、酮、R-羰基、芳基或其任何组合。
如本文所用的，“生物粘附剂”是一种粘附于活体或刚杀死的生物表面，如粘膜(例如，粘膜粘附剂)或皮肤组织上的材料。在本发明中有用的生物粘附剂包括，但不限于，商业上现有的以聚卡波非名义由A.H.Robins Co.of Richmond，Virginia出售的材料，和由B.F.Goodrich Chemical Co.of Cleveland，Ohio出售的CARBOPOL″Ex55″也称作CARBOPOL976和NOVEON All。建议的粘膜粘附剂包括，但不限于，聚(丙烯酸)(PAA)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、纤维素衍生物、壳聚糖、藻酸盐、果胶和明胶。
如本文所用的，术语“治疗性的”意为治愈或恢复健康，而术语“预防性的”意为保持健康或预防疾病或有助于疾病的预防。
I.酶和底物在本发明的方法和组合物中，可以使用多种酶-底物组合。本发明的治疗性和/或预防性组合物的酶组分包含一种或多种过氧化物产生酶，包括，但不限于，脂加氧酶、前列腺素合酶或氧化还原酶。
脂加氧酶和前列腺素合酶与氧一起作用于花生四烯酸以产生非过氧化氢结构。例如，一种由脂加氧酶催化的反应产生5-HPETE，而由前列腺素合酶催化的反应产生前列腺素G2，两种产物都具有过氧化物功能(Biochemistry，Voet和Voet，第二版，John Wiley &Sons，纽约，第707-708页(1995)。
在一个优选的实施方案中，所述酶为氧化还原酶。氧化还原酶能够氧化一种或多种底物以产生过氧化氢(例如，葡萄糖氧化酶，它将葡萄糖和氧转化为葡萄糖酸和过氧化氢；或乙醇氧化酶，它催化伯醇与氧的相互作用以产生过氧化氢)。这种酶包括那些根据国际生化与分子生物学协会命名委员会(NC-IUBMB)划分为E.C.1.-.-.-酶(氧化还原酶)的那些，例如，划分为E.C.1.1.-.-酶(作用于供体的CH-OH基因上)的那些，或划分为E.C.1.1.3.-酶(以氧作为受体)的那些。
本发明中有用的氧化还原酶和底物的例证性例子在表1中给出。
表1氧化还原酶
在病理状态下，阴道pH一般是大约6-7的pH，它比健康状态的pH约4-4.5要高得多。多种过氧化物产生酶在pH6-7左右产生高水平的过氧化物。这些酶的活性随着pH的降低而降低。这种现象可以用于自我限制本发明的组合物和方法的酶。即，如果将一种酶和一种底物置于pH升高的阴道系统中，该酶将产生过氧化物。这种过氧化物将抑制病原微生物并允许有益微生物增殖。由了重建了健康的阴道内环境稳定，pH会下降并且所述酶的活性会下降。这与过氧化物产生的需要减弱相应，并且过氧化物的产生将于正常、健康的pH上减少。
此外，几种过氧化物产生酶在高浓度的过氧化物，例如，大于或等于0.1％的过氧化物存在时失活。这避免了过氧化物的过量产生，并将过氧化物保持于对有益的阴道细菌和/或健康阴道组织有害的浓度之下。因而，本发明的一个实施方案提供自我限制的酶，包括相对于pH和环境中过氧化物浓度而自我限制的酶。
此外，可以给药在本发明的组合物和方法中有用的酶，而不用给药合适的底物。由哺乳动物阴道细胞分泌而存在于阴道中的物质或由存在于阴道中的微生物产生的产物可以作为底物对于由本发明的组合物和方法的酶所进行的过氧化物生产有用。
II.过氧化物产生酶系统的其它组分除了催化过氧化物产生的酶和合适的底物，本发明的组合物可以进一步包含至少一种其它的对于阴道状况的治疗性和/或预防性治疗，或减轻其症状的用途有效的制剂，所述状况如阴道微菌群紊乱。例如，本发明的组合还可以包含一种或多种酸以帮助降低阴道的pH。建议的酸包括，但不限于，醋酸、已酸、硼酸和乳酸。
此外，本发明的组合物还可以包括一种局部麻醉剂，如盐酸利多卡因，或局部类固醇，如皮质类固醇，以减轻疼痛或搔痒。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物可以进一步包括一种或多种生物粘附剂或粘膜粘附剂。包括一种生物粘附剂的组合物的益处在于阴道给药后，所述组合物可以保持于原地几天，以提供长期的治疗。此外，包含生物粘附剂的组合物的较少应用是达到充分功效所必需的。另外，生物粘附剂，包括热胶化粘膜粘附剂，在促进有益菌的生长中作为一种加温剂而起作用。
本发明的组合物还可以包括其它的抗微生物剂，如抗细菌剂，包括但不限于甲硝唑、多粘菌素或噻肟单酰胺菌素。本发明的组合物还可以包括防御素(抗微生物肽)和/或精蛋白。另外，本发明的组合物还可以包括抗真菌剂，包括但不限于酮康唑、三康唑、伊曲康唑或氟康唑。
在本发明中有用的组合物还可以包含一种或多种可药用的添加剂，本文指一般用于辅助处长贮存时间并且使消费者接受本发明的方法和组合物的佐剂。示例性的佐剂包括，但不限于防腐剂、润滑剂、润滑油、乳化剂、湿润剂、着色剂、提供香味和/或气味的制剂(气味剂)。所述酶和/或底物可以包括在，例如，微胶粒或脂质体，或一些其它的胶囊形式中，或者作为一种前体药物或以一种延长释放的形式进行给药以提供延长的保存期和/或递送效果(例如，持续释放)。
可以包括在本发明的组合物中的建议的防腐剂包括，但不限于，乙醇、抗坏血酸棕榈酸酯、苯甲酸、丁羟茴醚、丁羟甲苯、氯代丁醇、乙二胺、羟苯乙酯、乙基香草醛、甘油、羟苯甲酯、硫代甘油、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、羟苯丙酯、黄樟油、苯甲酸钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、山梨酸、二氧化硫、马来酸或没食子酸丙酯。
可以包括在本发明的组合物中的建议的润滑剂包括，但不限于，脂性或油性物质，包括蓖麻油、硫化蓖麻油、可可脂、椰子油、冷膏、玉米油、棉花子油、玫瑰水油膏、白腊和白矿脂的组合物、月桂硫酸钠、丙二醇和硬脂醇的组合物、芝麻油、可可油、肉豆蔻醇或鲨鱼肝油。
可以包括于本发明组合物中的典型润滑剂或油包括，但不限于，石蜡油、白腊或黄腊、可可脂、油酸甘油酯、橄榄油、希蒙得木油、石蜡、淀粉甘油剂、羊毛脂、亲水矿脂、矿物油、软脂、甘油单硬脂酸酯、硬脂酸、聚乙二醇、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚山梨酯、胆固醇或较高分子量的脂。润滑剂和滑润剂为产品提供合适的滑触的感觉和擦进表层的特性，以增强使用的舒适性并且鼓励消费者在需要的时候随时使用该产品。
乳化剂用来产生水包油乳剂。在本发明的组合物中有用的典型乳化剂包括，但不限于，藻酸钠、阿拉伯胶、卡波姆、羧甲基纤维素钠、角叉菜胶、明胶、羟乙基纤维素、羟丙纤维素、羟丙基甲基纤维素、octoxynol-9、油醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨润土、石墨、氢氧化镁、十二烷基硫酸钠、脱水山梨醇酯、硬脂醇、黄蓍胶、月桂酸钾、聚氧乙烯脱水山梨醇-油酸酯或黄原胶。
可以包括于本发明的组合中的温润剂包括，但不限于，甘油、丙二醇、吡咯烷酮羧酸、乳酸钠、尿素或某些天然脂混合物。建议的其它湿润剂包括，但不限于，某些蛋白质、明胶、透明质酸、维生素或一些天然成分。
III.剂量A.剂量形式对于治疗性、预防性和/或保健性的用途来说，可以向阴道给药本发明的组合物，所述组合物作为一种制品或载体以阴道插入物、注射器样涂药器、片剂、栓剂、子宫托、粉末/滑石粉或其它固体、溶液、液体、喷雾剂、气雾剂、可药用的载体、冲洗剂、油膏、卫生栓、泡沫、乳膏、胶，包括生物粘附胶(例如，一种粘膜热胶组合物(参见，例如，递交于2002年4月30日的美国申请号10/135805，在此将其并入作为参考))、膏、微胶囊、阴道海绵、阴道环，或受控的持续释放组合物的形式存在。受控的持续释放物可以通过加入时控添加剂来获得，如本领域已知的聚合结构、微胶囊、基体等。本发明的组合物还可以通过利用热熔挤压制品，如生物粘附性热熔挤压膜片(参见，例如，美国专利号6,375,963，在此将其并入作为参考)进行给药。
本发明的液体组合物可以由吸收性材料，如卫生栓或海绵，或作为喷雾/气雾剂(利用泵型或气雾喷雾器应用于感染区域)进行给药。使用掺入本发明的阴道内组合物的卫生栓的益处在于它不能被稀释或被月经血或其它阴道排出物冲走。提供溶液形式的组合物，使得将该组合物作为阴道冲洗剂进行给药成为可能，所述组合物起初可以以浓缩的液体形式，或作为一种需要在使用前加入水、盐水或其它合适的稀释剂的可溶性粉末、片剂等进行提供。
本发明的组合物可以通过多种方法进行应用，包括利用涂药器或者患者自已插入。例如，利用涂药器，如公知的用于施用阴道产品的挤压型或柱塞型涂药器，可以向阴道施用药膏、洗液、栓剂、泡沫、糊剂、油膏、胶、片剂或卫生栓。将所述组合物作为栓剂进行给药是有益的，因为它提供方便、舒适的应用，增强的安全性和/或整洁性。将所述组合物作为具有低表面张力的药膏进行给药是有益的，因为它提供均一的湿润作用，有助于组合物穿入阴道皱褶，并且作为温润剂起作用。
一个优选的实施方案提供在注射器样涂药器中的本发明的组合物(20；也称为栓塞型涂药器(参见图7))。例如，可以将胶，包括但不限于生物粘附胶，置入注射器样涂药器(20)的第一药室中(60)并且以障壁加以封闭(30；障壁的存在使得酶和底物相分离，从而不会反应，同时在装配、运输和处理时保持于同一涂布器中，但是当使用者压下栓塞时将破裂)，所述胶包含底物，包括但不限于羧甲基纤维素。随后将酶，包括但不限于乙醇氧化酶，置入注射器样涂药器的第二药室(50)中并且例如通过冻干进行稳化以作保存，从而有助于保藏稳定。将酶药室按顺序置于胶药室的出口处。使用时，将涂药器插入阴道中并且压下栓塞(40)，它将酶再水化并且将其带出涂药器进入阴道。因而，在使用时酶和底物的结合将酶活化。
另一个优选的实施方案提供结合卫生栓的本发明的组合物(10；图6)。例如，将一种酶，如乙醇氧化酶作为溶液应用于卫生栓材料中并且在纤维上进行干燥。或者，可以首先将酶干燥并且随后应用于卫生栓。在应用过程中，所述酶被阴道中的湿气再水化，因而将酶活化。或者，在向阴道给药之前可以用一种溶液将卫生栓再水化。随后所述酶可以对作为底物的卫生栓材料起作用，可以将一种单独的底物置于卫生栓上，或者所述酶可以利用一种已经存在于阴道中的底物在阴道中产生过氧化物。
在本发明中有用的酶和/或底物可以是限定于或者是结合于一种制品或载体/递送媒介物上。在一个实施方案中，所述酶和/或底物可以随时去除，从而终止过氧化物的产生(例如，去除包括产生过氧化物的底物和/或酶的卫生栓)，并且因而终止治疗。
本发明的一个实施方案提供载体的用途，所述载体作用来向阴道递送酶并且作为那些酶的底物。在本发明的这一实施方案中，催化过氧化物产生的酶的底物也是递送该酶到阴道的载体。例如，可以将乙醇氧化酶干燥并且置于一种聚(乙烯醇)支持物上。在放入阴道之前将该支持物再水化。再水化的酶在水和氧存在时氧化聚(乙烯醇)，以产生过氧化氢和氧化的聚(乙烯醇)。另一个例子是一种含有粘膜粘附材料的水成胶，在使用之前与所述酶混合或者作为配制过程的一部分，所述粘膜粘附材料如羧甲纤维素(优选混以一种热胶粘膜粘附剂)。再水化的酶随后氧化载体，胶中的羧甲纤维素，并且产生过氧化物。另一个实施方案提供酶包装于聚合微粒中。在原位上，包含醇基的聚合物被所述酶所氧化。在这种情况下，酶的释放可以由所述微粒控制以长期生产所需的产品(例如，持续释放)。递送酶并且作为底物起作用的载体或制品的一个例子是卫生栓。卫生栓包含纤维质材料或包括但不限于人造丝或棉的材料。纤维质材料包含能够被本发明的氧化还原酶氧化的醇基，以产生过氧化物，所述酶包括乙醇氧化酶。结合的酶递送介质和底物不限于在阴道中产生过氧化物，还可以应用于多种生物医药用途，其中需要递送酶和该酶的产物。需要对酶的底物进行适当地工程化设计以便它们能够加工进递送介质中，这种工程化设计可以为本领域技术人员所认识。
此外，独立于酶的活性，递送/底物物质可以以一种有益的方式产生改变阴道环境的降解产物。这类物质可以包括被酶所作用的主链聚合物，将可以水解降解为酸或产酸物的寡聚物支链移植于其上。所述支链可以或不可以作为所述酶的底物而起作用。例如，可以制成一种具有聚已内酯支链的聚(乙烯醇)主链，产生聚[聚羟基己酸乙烯酯]。所述聚(乙烯醇)可以作为乙醇氧化酶的底物而起作用以产生过氧化氢。聚已内酯将水解降解为已酸。这种酸有助于降低pH和控制有害细菌生长，因而有助于恢复阴道的平衡。此外，这种物质是可以熔解处理的并且可以形成一个系统以控制所述酶的递送。此外，Laureth-4(例如，一种Laureth-4终端过氧化物)的过氧化物会释放Laureth-4和过氧化物(例如，过氧化氢)。Laureth-4降低金黄色葡萄球菌(S.aureus)的TSS-1生产并且存在过氧化物以抑制不需要的厌氧菌和阴道加德纳氏菌(Gardneralla vaginalisis)，因而减弱毒素的产生，同时重建阴道菌群。
B.酶/底物的量为了有效，在本发明组合物中酶和/或底物的量是足以恢复或保持阴道细菌菌群的健康内环境稳定或抑制引发阴道感染，如细菌性阴道炎的微生物生长的量，同时允许有益微生物繁殖。这种量是本领域技术人员可以确定的。
例如，本发明的组合物能够以单位剂量的形式，例如，含有0.5-1000国际单位(IU)，方便地2-500IU，最方便地，10-100IU酶/剂量形式进行给药、例如，一个单位剂量形式可以含有1单位、2单位、3单位或更多单位的酶/大约0.5ml可药用载体。酶的浓度可以方便地进行变化以适应阴道中不同体积的粘液/流体。以总体积大约为0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml或更多的可药用载体可以轻易实现递送。可氧化的底物通常以占组合物重量大约0.05％-约99％的量存在于治疗性或预防性组合物中，如占组合物重量大约0.2％-约10％。通过变化酶和底物的浓度，可以控制过氧化物产物的水平。
本发明组合物给药的确切方案必须依赖治疗的个体受试者的需要和治疗类型。例如，治疗包括感染的阴道菌群紊乱的酶的有效量，部分地依赖于过氧化物是否会进行治疗性或预防性使用、所述组合物和紊乱的严重性或感染和/或感染的性质、个体的体格大小和体重等。例如，在月经期间优选递送比非月经时期产生更多过氧化氢的组合物。确定合适的方案在技术人员的技术范围之内。
应用含有所述酶的组合物的持续时间还依赖于所述应用是否是为预防性的目的，其中所述应用可以是，例如，每天一次或每周一次，持续确定的时间，例如，一周、月或更久，或者所述应用是否是为治疗性目的，其中可能会采用强度更大的使用所述组合物的治疗方案，持续例如2、3、4、5、6、7、10或14天或更久的时间。因而，治疗性治疗可以跨越几天或几周，有可能是以天为基础的，并且可以是一天多次。例如，所需的剂量可以方便地以单一剂量或于合适的时间间隔给药的分次剂量来给予，所述时间间隔例如每天两次、三次、四次或更多次小剂量。小剂量本身可以进一步分割为，例如不连续的松散间隔给药。
在实践中，与活性酶单位接触的持续时间有可能会影响在剂量中所用的活性酶单位的所需浓度。例如，据认为提供延长释放的载体能够提供较低浓度的活性酶单位每剂量，但是是在一个较长的时间上提供的。相反地，较短持续时间的处理，如冲洗液，能够提供较高浓度的活性酶单位每剂量。任何在感染位点提供有效浓度的活性酶或者提供充分预防效应的包含足够酶的剂量形式都在常规实验的范围之内，所以也在本发明的范围之内。
在基本治疗之后，如抗生素或抗真菌药，或预防性地，如在月经期间给与乳酸杆菌一次“加强”，可以给药本发明的组合物以直接治疗阴道微菌群紊乱或感染。
IV.实施例下列实施例意在例示本发明并且不应理解为限制性的A.过氧化物的产生对几种酶，包括葡萄糖氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、半乳糖氧化酶、乙酶氧化酶和丙酮酸氧化酶测试在五种底物上的过氧化氢生产，所述底物包括卫生栓材料(例如，纤维质材料，包括，但不限于，绵和人造丝纤维)、葡聚糖、羧甲纤维素、壳聚糖和聚(乙烯醇)。
在试管中将一个单位的每种酶与0.05ml每种底物的饱和溶液(在蒸馏的、去离子水中)进行组合并且以缓冲液(0.5M tris缓冲液，pH调节至6.3)稀释至0.5ml。对于不溶性底物来说，将一块底物(大约0.25克)置于试管中。将试管置于37℃的振荡温育器中。12小时后，移去试管并且通过已建立的方法(Graf，E.和Penniston，J.T.，″Method for Determination of Hydrogen Peroxide，With ItsApplication Illustrated byGlucose Assay，″Clinical Chemistry，26，658-660(1980))对溶液测试H2O2的水平。结果以μg H2O2/ml的形式显示于表2中。(对于在时间上过氧化氢的产生，参见表1)。
表2产生的μg H2O2/ml乙醇氧化酶在大多数底物上具有最高水平的H2O2产生。
对聚(乙烯醇)进行修饰以提高可处理性并且增强聚(乙烯醇)的酸递送能力。这些修饰包括将聚(醋酸乙烯酯)与聚(已内酯)反应以产生一种修饰以聚(已内酯)链的碳主链。用于产生这种物质的方法如下向甲苯中的四份聚(醋酸乙烯酯)溶液加入1份聚已内酯和催化量的对-甲苯磺酸。将得到的溶液加热回流并且通过部分充满了10％碳酸氢钠溶液的Dean-Stark分水器除去释放的醋酸。当醋酸释放停止时，将反应物冷却并且用水洗涤。在真空下去除甲苯以产生修饰的pva/polycap聚合物。
酶对于聚(己内酯)链的作用可以发生在醇末端以及在己内酯的酯键的水解中产生的醇上，所述水解也产生酸。通过直接比较(数据未显示)，乙醇氧化酶在这种物质上产生比在未修饰的聚(乙烯醇)上多产生22％的H2O2。
B.H2O2的效力对H2O2对于抑制病原微生物，如白色念珠菌和大肠杆菌的生长的效力进行测试。在各种浓度的H2O2存在时亚培养病原微生物，利用595nm处的光密度(吸光度)追踪它们的生长(图2和3)。在其间发生两种微生物的生长抑制(在6小时期间)的值是大约0.01和大约0.001％H2O2，这相应于表2中大约10到大约100μg H2O2/ml的范围(图2和3)。这些数据显示由酶进行的H2O2的生产可以产生具有治疗益处的H2O2水平。
C.过氧化物生产的自我限制特征进一步研究了一种酶-底物组合，乙醇氧化酶-羧甲纤维素。在试管中将一个单位的酶与0.05ml的2.5％羧甲纤维素进行组合并且以合适pH的缓冲液稀释至0.5ml。将试管置于37℃的振荡温育器中。8小时后，移去试管并且对溶液测试H2O2的水平。
在病理(感染)状态下，阴道pH6-7高于健康状态的pH(pH 4-4.5)。乙醇氧化酶于pH 6.3产生高水平的过氧化氢。不过，乙醇氧化酶的活性随着pH的降低而降低(图4)。因而，如果将酶和底物置于pH升高的感染的阴道系统，该酶将产生过氧化氢。这种过氧化氢将抑制病原微生物并且允许有益微生物增殖。由于重建了健康的阴道内环境稳定，pH将下降而酶，例如乙醇氧化酶的活性将降低。这与过氧化物产生的需要减弱相对应，并且有效地保证了在不需要时不会产生过氧化氢。
本系统的另一个益处是某些酶，如乙醇氧化酶，在高浓度的过氧化氢存在时失活(图5)。这一特性避免了过氧化氢的过量产生，并保持于对有益的阴道细菌和阴道组织有害的水平之下。
本文将所有引用的出版物、专利和专利申请并入作为参考，如同个别地并入作为参考一样。已经参照各种实施方案和技术对本发明进行了介绍。不过，应当理解可以进行许多变化和修饰，同时将其保持于本发明的精神和范围之内。
权利要求
1.一种用于治疗性和预防性治疗哺乳动物中阴道细菌菌群紊乱的组合物，所述治疗包括阴道给药有效量的含有酶的组合物，所述酶能够在向所述哺乳动物给药所述组合物之后产生过氧化物。
2.权利要求1的组合物，其中所述酶包括氧化还原酶、脂加氧酶或前列腺素合酶。
3.权利要求2的组合物，其中所述氧化还原酶包括选自下列的酶苹果酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、芳基醇氧化酶、1-古洛糖酸内酯氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、1-山梨糖氧化酶、吡哆醇4-氧化酶、乙醇氧化酶、儿茶酚氧化酶、(S)-2-羟酸氧化酶、蜕皮素氧化酶、胆碱氧化酶、仲醇氧化酶、4-羟基扁桃酸氧化酶、长链醇氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硫胺素氧化酶、1-半乳糖酸内酯氧化酶、纤维二糖氧化酶、非洲防己碱氧化酶、羟基植烷酸氧化酶、核苷氧化酶、N-芳基己糖胺氧化酶、聚乙烯醇氧化酶、甲醇氧化酶、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶、香草基-醇氧化酶、D-甘露醇氧化酶及其混合物。
4.权利要求2的组合物，其中所述氧化还原酶包括葡萄糖氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、乙醇氧化酶或丙酮酸氧化酶。
5.权利要求2的组合物，其中所述氧化还原酶包括乙醇氧化酶。
6.权利要求1的组合物，其中所述酶包括自我限制的酶。
7.权利要求1的组合物，其中所述酶在高水平的过氧化物或低pH存在时失活。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含底物，所述酶能够对所述度物作用以产生过氧化物。
9.权利要求8的组合物，其中所述底物包含可氧化的底物。
10.权利要求9的组合物，其中所述可氧化的底物包含(S)-苹果酸、β-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、胆固醇、芳族伯醇、伯醇、L-古洛糖酸-1，4-内酯、D-半乳糖、D-木糖、L-山梨糖、D-葡萄糖酸-1，5-内酯、吡哆醇、儿茶酚、(S)-2-羟酸、蜕皮素、胆碱、仲醇、(S)-2-羟基-2-(4-羟基苯基)醋酸、长链醇、长链脂肪醇、sn-甘油3-磷酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、硫胺素、L-半乳糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-阿卓糖酸-1，4-内酯、L-岩藻糖酸-1，4-内酯、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯、D-苏氨酸-1，4-内酯、纤维糊精、纤维素、乳糖、4-β-D-葡糖基-D-甘露糖、非洲防己碱、L-2-羟基植烷酸、肌苷、腺苷、核苷、2’-脱氧核苷、阿拉伯糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-羟乙酰葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、聚乙烯醇、甲醇、脂族醇、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯、香草醇、甘露醇、D-阿拉伯糖醇、D-山梨糖醇或其混合物。
11.权利要求9的组合物，其中所述可氧化的底物包含纤维素、葡聚糖、羧甲纤维素、壳聚糖或聚(乙烯醇)。
12.权利要求9的组合物，其中所述可氧化的底物包含聚(乙烯醇)，聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，或其组合。
13.权利要求8的组合物，其中所述底物包含纤维素、葡聚糖、羧甲纤维素、壳聚糖、聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，并且所述酶包含乙醇氧化酶。
14.权利要求8的组合物，其中所述底物包含聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，并且所述酶包含乙醇氧化酶。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含一种载体，用于将所述组合物递送至阴道中。
16.权利要求15的组合物，其中所述载体包含阴道插入物、片剂、栓剂、子宫托、粉末、滑石粉或其它固体、溶液、液体、喷雾剂、气雾剂、冲洗剂、油膏、卫生栓、注射器样涂药器、泡沫、乳膏、凝胶、生物粘附凝胶、糊剂、微胶囊、阴道海绵、阴道环、受控的持续释放组合物或其组合。
17.权利要求15的组合物，其中所述酶限制于载体上。
18.权利要求17的组合物，其中所述载体包含卫生栓。
19.权利要求15的组合物，其中所述载体也是底物，所述酶能够对其作用以产生过氧化物。
20.权利要求19的组合物，其中所述载体和底物包含卫生栓材料。
21.权利要求19的组合物，其中所述载体和底物包含聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，所述凝胶包含粘膜粘性物质的胶或其组合。
22.权利要求8或15的组合物，其中所述酶、底物或载体产生不同于过氧化物的有益物质。
23.权利要求22的组合物，其中所述有益物质包含酸。
24.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含酸、抗生素、麻醉剂、防御素或抗真菌药。
25.权利要求1的组合物，其中所述哺乳动物为人。
26.权利要求8的组合物，其中所述组合物包含大约0.5-约1000单位的酶和大约0.05％-约99％重量的底物。
27.一种治疗或预防哺乳动物中阴道细菌菌群紊乱的方法，包括阴道给药有效量的含有酶的组合物，所述酶能够在向所述哺乳动物给药所述组合物之后产生过氧化物。
28.权利要求27的方法，其中所述酶是一种氧化还原酶。
29.权利要求28的方法，其中所述氧化还原酶包含选自下列的酶苹果酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、胆固醇氧化酶、芳基醇氧化酶、1-古洛糖酸内酯氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、1-山梨糖氧化酶、吡哆醇4-氧化酶、乙醇氧化酶、儿茶酚氧化酶、(S)-2-羟酸氧化酶、蜕皮素氧化酶、胆碱氧化酶、仲醇氧化酶、4-羟基扁桃酸氧化酶、长链醇氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硫胺素氧化酶、1-半乳糖酸内酯氧化酶、纤维二糖氧化酶、非洲防己碱氧化酶、羟基植烷酸氧化酶、核苷氧化酶、N-芳基己糖胺氧化酶、聚乙烯醇氧化酶、甲醇氧化酶、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯氧化酶、香草基-醇氧化酶、D-甘露醇氧化酶及其混合物。
30.权利要求28的方法，其中所述氧化还原酶包括葡萄糖氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、乙醇氧化酶或丙酮酸氧化酶。
31.权利要求28的方法，其中所述氧化还原酶包括乙醇氧化酶。
32.权利要求27的方法，其中所述酶包括自我限制的酶。
33.权利要求27的方法，其中所述酶在高水平的过氧化物或低pH存在时失活。
34.权利要求27的方法，其中还包含一种底物，所述酶能够对其作用以产生过氧化物。
35.权利要求34的方法，其中所述底物包含可氧化的底物。
36.权利要求9的组合物，其中所述可氧化的底物包含(S)-苹果酸、β-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、胆固醇、芳族伯醇、伯醇、L-古洛糖酸-1，4-内酯、D-半乳糖、D-木糖、L-山梨糖、D-葡萄糖酸-1，5-内酯、吡哆醇、儿茶酚、(S)-2-羟酸、蜕皮素、胆碱、仲醇、(S)-2-羟基-2-(4-羟基苯基)醋酸、长链醇、长链脂肪醇、sn-甘油3-磷酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、硫胺素、L-半乳糖酸-1，4-内酯、L-半乳糖酸-1，4-内酯、D-阿卓糖酸-1，4-内酯、L-岩藻糖酸-1，4-内酯、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯、D-苏氨酸-1，4-内酯、纤维糊精、纤维素、乳糖、4-β-D-葡糖基-D-甘露糖、非洲防己碱、L-2-羟基植烷酸、肌苷、腺苷、核苷、2’-脱氧核苷、阿拉伯糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-羟乙酰葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、聚乙烯醇、甲醇、脂族醇、D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯、香草醇、甘露醇、D-阿拉伯糖醇或D-山梨糖醇或其混合物。
37.权利要求35的方法，其中所述可氧化的底物包含纤维素、葡聚糖、羧甲纤维素、壳聚糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯醇)的衍生物或其组合，所述聚(乙烯醇)的衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)。
38.权利要求35的方法，其中所述可氧化的底物包含聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物或其组合，所述聚(乙烯醇)的衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)。
39.权利要求34的方法，其中所述底物包含纤维素、葡聚糖、羧甲纤维素、壳聚糖、聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，并且所述酶包含乙醇氧化酶。
40.权利要求34的方法，其中所述底物包含聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，并且所述酶包含乙醇氧化酶。
41.权利要求27的方法，其中还包含载体，用于将所述组合物递送至阴道中。
42.权利要求41的方法，其中所述载体包含阴道插入物、片剂、栓剂、子宫托、粉末、滑石粉或其它固体、溶液、液体、喷雾剂、气雾剂、冲洗剂、油膏、卫生栓、注射器样涂药器、泡沫、乳膏、胶、包括生物粘附胶、糊剂、微胶囊、阴道海绵、阴道环、受控的持续释放组合物或其组合。
43.权利要求41的方法，其中所述酶限制于载体上。
44.权利要求43的方法，其中所述载体包含卫生栓。
45.权利要求44的方法，其中从阴道中去除所述卫生栓导致治疗的终止。
46.权利要求41的方法，其中所述载体也是底物，所述酶能够对其作用以产生过氧化物。
47.权利要求46的方法，其中所述载体和底物包含卫生栓材料。
48.权利要求46的方法，其中所述载体和底物包含聚(乙烯醇)或聚(乙烯醇)的衍生物，所述衍生物包括已经与聚(己内酯)反应过的聚(醋酸乙烯酯)，所述凝胶包含粘膜粘性物质的胶或其组合。
49.权利要求34或41的方法，其中所述酶、底物或载体产生一种不同于过氧化物的有益物质。
50.权利要求49的方法，其中所述有益物质是酸。
51.权利要求27的方法，其中还包含酸、抗生素、麻醉剂、防御素或抗真菌药。
52.权利要求27的方法，其中阴道细菌菌群紊乱是与健康阴道环境相比革兰氏阳性菌数目减少或革兰氏阴性菌数目增多。
53.权利要求27的方法，其中阴道细菌菌群紊乱是一种阴道感染。
54.权利要求53的方法，其中阴道感染是细菌性或真菌性源的。
55.权利要求53的方法，其中阴道感染是与健康阴道相比革兰氏阴性细菌浓度提高的结果。
56.权利要求53的方法，其中阴道感染是与健康阴道相比革兰氏阳性细菌浓度下降的结果。
57.权利要求53的方法，其中阴道感染是细菌性阴道炎。
58.权利要求27的方法，其中所述组合物的给药促进革兰氏阳性细菌的生长。
59.权利要求27的方法，其中所述组合物的给药抑制革兰氏阴性细菌的生长。
60.权利要求34的方法，其中所述组合物包含大约0.5-约1000单位的酶和大约0.05％-约99％重量的底物。
61.权利要求27的方法，其中所述哺乳动物为人。
62.一种用于治疗性和预防性治疗哺乳动物中阴道细菌菌群紊乱的制品，所述制品包含能够产生过氧化物的酶，所述制品适用于阴道。
63.权利要求62的制品，所述制品包含阴道插入物、片剂、栓剂、子宫托、粉末、滑石粉或其它固体、溶液、液体、喷雾剂、气雾剂、冲洗剂、油膏、卫生栓、注射器样涂药器、泡沫、乳膏、胶、包括生物粘附胶、糊剂、微胶囊、阴道海绵、阴道环、受控的持续释放组合物或其组合。
64.权利要求62的制品，所述制品包含一种卫生栓。
65.权利要求64的制品，其中所述卫生栓包含纤维质材料。
66.权利要求65的制品，其中所述纤维质材料包含人造丝、棉或其组合。
67.权利要求62的制品，所述制品包含注射器样涂药器。
68.权利要求62的制品，所述制品还包含底物，所述酶能够对所述底物作用以产生过氧化物。
69.权利要求68的制品，所述制品包含注射器样涂药器。
70.权利要求69的制品，其中底物和酶都存在于注射器样涂药器中。
71.权利要求70的制品，其中底物和酶被注射器样涂药器中的障壁所分隔。
全文摘要
本发明涉及阴道内给药过氧化物产生酶和底物的方法和组合物，以促进革兰氏阳性菌的生长，抑制革兰氏阴性菌，促进氧化性环境，和/或治疗或预防阴道细菌菌群紊乱，所述阴道细菌菌群紊乱伴有革兰氏阳性菌的减少和诸如革兰氏阴性菌的病原微生物的增多，导致阴道感染。
文档编号A61F13/02GK1725991SQ200380106378
公开日2006年1月25日 申请日期2003年10月9日 优先权日2002年12月30日
发明者R·佩恩, C·塞尔 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司