专利名称：以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法
技术领域：
本发明涉及以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术：
肝癌一直被认为是全球最常见的恶性肿瘤之一，治愈率非常低。尽可能及早发现并进行手术切除是目前治疗肝癌最有效手段。甲胎蛋白是一种典型的肿瘤标志物，主要存在于肝癌细胞、卵黄囊细胞和其它恶性肿瘤患者的血清当中。正常情况下甲胎蛋白存在于胎儿发育的早期肝脏和卵黄囊中，出生后几个月至一年内降至正常水平。因此，除了孕妇和新生儿，人体内仅能检测到微量的甲胎蛋白，正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20ng/mL。当肝细胞发生癌变时，恢复了产生这种蛋白质的功能。在肝癌病人的血清样本检测中，甲胎蛋白的阳性率为75-80%。因此血清中甲胎蛋白含量不仅可作为原发性肝癌和畸胎瘤 的早期诊断指标之一，也可作为疗效观察和愈后判断的指标。目前，甲胎蛋白的临床检测多采用基于过氧化物酶的酶联免疫分析方法，由于过氧化物酶价格昂贵，容易失活，标记过程复杂。因此，寻找能够替代天然过氧化物酶的模拟酶和催化体系，并探寻优良的氢供体底物以提高模拟酶催化反应灵敏度是体外免疫诊断试剂和方法研发的新途径。纳米材料具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势，在模拟生物酶方面显示出极其诱人的应用前景。用纳米人工模拟酶替代在体外免疫诊断试剂中广泛使用的辣根过氧化物酶，不但能解决目前体外免疫诊断试剂的稳定性和检测准确性的问题，还能降低体外免疫诊断试剂的生产成本，提高检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用裸纳米金为模拟过氧化物酶，标记抗体，采用双抗体夹心法建立了的新型的甲胎蛋白测定方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案所述的一种以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是以裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，利用双夹心抗体法测定甲胎蛋白，裸纳米金催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐，根据显色溶液的紫外吸收特征，来测定甲胎蛋白浓度。所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是所使用的裸纳米金采用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备，将500 μ L浓度为O. I g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入I. O毫升浓度为O. lg/L的硼氢化钠水溶液，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌而形成裸纳米金。所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是以裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，取22yg鼠抗人甲胎蛋白抗体加入I. OmL裸纳米金溶液，振荡反应30min,高速离心lh，除去上清，沉淀用1% BSA的PBS溶液洗涤两次后重新定容到I. OmL。所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是双夹心抗体法测定甲胎蛋白是以过氧化氢和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐为底物。所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是利用裸纳米金催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的产物吸光度值A45tl以判断甲胎蛋白的浓度。所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是过氧化氢和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的体积比为I : 1，过氧化氢和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的体积优选为50 μ L0所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是过氧化氢浓度为 6. Omol/Lo所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的浓度为2. 4mmol/L。
所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是显色反应为恒温45°C避光反应25min。所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜；用PBS/T溶液洗涤3次；加入100 μ L不同浓度的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入50 μ L的裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，37°C孵育2h ;用PBS/T溶液洗涤5次，加2.4mmol/L 3，3，，5，5，-四甲基联苯胺盐酸盐和6. OmoI/L H2O2各50 μ L，恒温45°C避光反应25min后，在每孔中加入2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值；随着甲胎蛋白浓度的增大，吸光度逐渐增大，在5 100ng/mL范围内吸光度与甲胎蛋白浓度呈线性关系，检测限为 I.4ng/mL。本发明所述的一种以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其具体步骤如下(一 )裸纳米金的制备以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。裸纳米金的制备首先，500 μ L浓度为0. lg/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入I. O毫升浓度为0. lg/L的硼氢化钠水溶液(加入时间控制在5分钟内)，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌I小时。(二)抗体标记取22 μ g鼠抗人甲胎蛋白抗体加入I. OmL步骤(一)制备的裸纳米金溶液，振荡反应30min，高速离心lh，除去上清，沉淀用I % BSA的PBS溶液洗涤两次后重新定容到I. OmL。(三)甲胎蛋白的测定将抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L不同浓度的甲胎蛋白标准品(5-100ng/mL)，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，加入步骤(二)制备的裸纳米金标记抗体，每孔50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐和H2O2各50 μ L，45°C避光反应25min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L，终止反应并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。本发明的优点(1)本方法所使用的纳米金直接由硼氢化钠还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。(2)裸纳米金标记抗体过程简单。(3)裸纳米金催化底物活性稳定。
图I为裸纳米金的紫外吸收光谱图。图2为裸纳米金标记抗体的紫外吸收光谱图。图3为裸纳米金标记抗体用量对甲胎蛋白检测信号的影响图。图4为显色反应温度对甲胎蛋白检测信号的影响图。图5为过氧化氢浓度对甲胎蛋白检测信号的影响图。图6为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐浓度对甲胎蛋白检测信号的影响图。 图7为显色反应时间对甲胎蛋白检测信号的影响图。图8为不同浓度甲胎蛋白的检测信号图。
具体实施例方式实施例I :裸纳米金的制备首先，将500 μ L浓度为O. lg/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入I. O毫升浓度为O. lg/L的硼氢化钠水溶液(加入时间控制在5分钟内)，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌I小时得到裸纳米金。裸纳米金溶液为酒红色，最大吸收波长为516nm(见图I)。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。实施例2 裸纳米金标记抗体取22 μ g鼠抗人甲胎蛋白抗体加入I. OmL实施例I制备的裸纳米金溶液，振荡反应30min，高速离心lh，除去上清，沉淀用I % BSA的PBS溶液洗涤两次后重新定容到I. OmL，获得裸纳米金标记抗体。裸纳米金最大吸收波长红移至522nm(见图2)。实施例3 甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L浓度为100ng/mL的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体(5-200 μ L)，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加2. 4mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和6. Omol/L H2O2各50 μ L，45°C避光反应25min后在每孔中加入2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。如图3所示，吸光度在裸纳米金标记抗体用量为50 μ L时达到最大。实施例4 甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L浓度为100ng/mL的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加2. 4mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和6. Omol/L H2O2各50 μ L，恒温(25-65°C )避光反应25min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。如图4所示，显色反应温度为45°C时吸光度达到最大。
实施例5 甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L浓度为100ng/mL的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加2.4mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和不同浓度H2O2 (O. 1-6. Omol/L)各50 μ L，恒温45°C避光反应25min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。如图5所示，过氧化氢浓度为6. Omol/L时吸光度达到最大。实施例6:甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L浓度为100ng/mL的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T 溶液洗涤5次。加不同浓度3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐(O. 4-4. OmmoI/L)和6. Omol/LH2O2各50 μ L，恒温45°C避光反应25min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。如图6所示，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐浓度为
2.4mmol/L时吸光度达到最大。实施例7 甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L浓度为100ng/mL的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加2. 4mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和6. Omol/L H2O2各50 μ L，恒温45°C避光反应2. 5-30min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。如图7所示，显色反应时间达到25分钟后吸光度达到最大。实施例8 甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入IOOyL不同浓度的甲胎蛋白标准品(5-100ng/mL)，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加2. 4mmol/L 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和6. 0mol/L H2O2各50 μ L，恒温45°C避光反应25min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L，终止反应并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。如图8所示，随着甲胎蛋白浓度的增大,吸光度逐渐增大,在5 100ng/mL范围内吸光度与甲胎蛋白浓度呈线性关系，检测限为I. 4ng/mL。实施例9 血清中甲胎蛋白测定将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4°C封闭过夜。用PBS/T溶液洗涤3次。加入100 μ L血清，37°C孵育2h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入实施例2制备的裸纳米金标记抗体50 μ L，37°C孵育2h。用PBS/T溶液洗涤5次。加2. 4mmol/L 3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐和6. 0mol/L H2O2各50 μ L，恒温45°C避光反应25min后每孔加2mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应，并用酶标仪测定450nm处的吸光度值。结合实施例8计算血清中甲胎蛋白浓度。
权利要求
1.一种以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，以裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，利用双夹心抗体法测定甲胎蛋白，裸纳米金催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐，根据显色溶液的紫外吸收特征，来测定甲胎蛋白浓度。
2.根据权利要求I所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是所使用的裸纳米金采用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备，将500 μ L浓度为0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀释，在剧烈搅拌下加入I. O毫升浓度为O. I g/L的硼氢化钠水溶液，反应溶液颜色从浅黄色变成酒红色，暗处继续快速搅拌而形成裸纳米金。
3.根据权利要求I或2所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是以裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，取22 μ g鼠抗人甲胎蛋白抗体加入I. O mL裸纳米金溶液，振荡反应30 min，高速离心I h，除去上清，沉淀用1% BSA的PBS溶液洗涤两次后重新定容到I. O mL。
4.根据权利要求3所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是双夹心抗体法测定甲胎蛋白是以过氧化氢和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐为底物。
5.根据权利要求I或4所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是利用裸纳米金催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的产物吸光度值A450以判断甲胎蛋白的浓度。
6.根据权利要求5所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是过氧化氢和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的体积比为I: I，过氧化氢和3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的体积优选为50 μ L，三者混合后进入流动池反应，产生的化学发光强度经光电倍增管检测以测定奶粉中胆固醇。
7.根据权利要求5所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是过氧化氢浓度为6. O mol/L。
8.根据权利要求5所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐的浓度为2. 4 mmol/L。
9.根据权利要求5所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是显色反应为恒温45°C避光反应25 min。
10.根据权利要求3所述的以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，其特征是将甲胎蛋白抗体包被于96孔酶标板板底，4 °〇封闭过夜；用？85/1'溶液洗涤3次；加入100 μ L不同浓度的甲胎蛋白标准品，37°C孵育2 h后用PBS/T溶液洗涤5次，分别加入50μ L的裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，37°C孵育2 h ;用PBS/T溶液洗涤5次，加2. 4 mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和6. O mol/L H2O2各50 μ L，恒温45°C避光反应25 min后，在每孔中加入2 mol/L硫酸终止液50 μ L终止反应,并用酶标仪测定450 nm处的吸光度值；随着甲胎蛋白浓度的增大，吸光度逐渐增大，在5 100 ng/mL范围内吸光度与甲胎蛋白浓度呈线性关系，检测限为1.4 ng/mL。
全文摘要
本发明公开一种以裸纳米金为模拟过氧化物酶的甲胎蛋白测定方法，是以裸纳米金标记甲胎蛋白抗体，采用双夹心抗体法，利用裸纳米金的模拟过氧化物酶特性，催化过氧化氢和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系，根据显色产物吸光度特征检测甲胎蛋白。在5~100ng/mL范围内显色产物吸光度与甲胎蛋白浓度呈线性关系，检测限为1.4ng/mL。
文档编号G01N33/574GK102914512SQ20121042509
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者陈伟, 林新华, 刘爱林, 王胜, 邓豪华 申请人:福建医科大学