重组蔗糖合酶的生产方法、及其在生产蔗糖测定试剂盒中的应用、生产腺苷二磷酸葡糖的...的制作方法

专利名称：：重组蔗糖合酶的生产方法、及其在生产蔗糖测定试剂盒中的应用、生产腺苷二磷酸葡糖的...的制作方法发明所涉及的产业领域本发明涉及利用适当的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株最优化生产对可溶的、活性形式的重组蔗糖合酶(SS)，SS用于制备测定蔗糖的试剂盒的应用，设计SS的最佳形式以便合成腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)，和转基因植物的生产，所述叶片和贮藏组织积累高水平的ADPG和富含直链淀粉的淀粉，原因在于在过量表达SS的植物中胞质ADPG的过量生产。现有技术淀粉是植物中碳水化合物的主要贮存形式。它在诸如种子(小麦属、大麦属、玉蜀黍属、豌豆属等)和块茎(其中是马铃薯和薯蓣属)等器官中大量积累，而且是人类饮食的基本成分。并且，淀粉在纸张、化妆品、药品和食品工业中广泛应用，而且还用作制造生物可降解塑料和环境友好油漆的基本成分。由于它是由共价结合的葡萄糖分子组成，因此，在工业生产的多个领域中优先对这种多糖合成中所涉及的过程进行研究。ADPG是植物中在异养器官(图1A)和叶片中(图2A)淀粉生物合成的通用前体，并且广泛地认为它的生产由ADPG焦磷酸化酶(AGPase)或ADPG合酶(EC2.7.7.27)专一地控制(Okita，T.W.(1992)Isthereanalternativepathwayforstarchsynthesis？PlantPhysiol.100，560-56；Müller-Rber，B.，Sonnewald，U.Willmitzer，L.(1992)InhibitionoftheADPglucosepyrophosphorylaseintransgenicpotatoesleadstosugar-storingtubersandinfluencestuberformationandexpressionoftuberstorageproteingenes.EMBOJ.11，1229-1238；Stark，D.M.，Timmerman，K.P.，Barry，G.F，Preiss，J.，Kishore，G.M.(1992)RegulationoftheamountofstarchinplanttissuesbyADPglucosepyrophosphorylase.Science258，287-282；Neuhaus，E.H.，Husler，R.E.，Sonnewald，U.(2005)Notimetoshifttheparadigmonthemetabolicpathwaytotransitorystarchinleaves.TrendsPlantSci.atpress)。植物中所产生的淀粉的多种应用主要基于直链淀粉和支链淀粉的比例，它决定了淀粉颗粒的结构以及它在水性悬浮液中的黏性。所述直链淀粉和支链淀粉的比例，除了其它因素外，取决于植物细胞中ADPG的浓度(Clarke，B.R.，Denyer，K.，Jenner，C.F.，Smith，A.M.(1999)Therelationshipbetweentherateofstarchsynthesis，theadenosine5’-diphosphoglucoseconcentrationandtheamylosecontentofstarchindevelopingpeaembryos.Planta209，324-329)。SS(EC2.4.1.13，SS)(UDP-葡萄糖D-果糖-2-葡萄糖苷转移酶)是一种催化从蔗糖和UDP到UDPG和果糖的生产的可逆酶。尽管，如图1A所示，传统上认为SS具有产生UDPG的作用，其代谢过程导致淀粉在诸如胚乳和块茎的异养组织中产生(Zrenner，R.，Salanoubat，M.，Willmitzer，L.，Sonnewald，U.(1995)Evidenceforthecrucialroleofsucrosesynthaseforsinkstrengthusingtransgenicpotatoplants.PlantJ.7，97-107；Boroja-Fernández，E.，F.J.，Saikusa，T.，Rodríguez-López，M.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2003)SucrosesynthasecatalyzesthedenovoproductionofADPglucoselinkedtostarchbiosynthesisinheterotrophictissuesofplants.PlantCellPhysiol.44，500-509；Pozueta-Romero，J.，F.J.，Rodríguez-López，M.，Boroja-Fernández，E.，Akazawa，T.(August2003)Newwavesinthestarchfield.Lett.PlantCellPhysiol.24-32)，但是有参考文献报道该酶在体外应用其它的核苷酸二磷酸生产相应的糖核苷酸的潜能(Murata，T.，Sugiyama，T.，Minamikawa，T.，Akazawa，T.(1996)Enzymicmechanismofstarchsynthesisinripeningricegrains.Mechanismofthesucrose-starchconversion.Arch.Biochem.Biophys.113，34-44；Delmer，D.P.(1972)ThepurificationandpropertiesofsucrosesynthasefrometiolatedPhaseolusaureusseedlings.J.Biol.Chem.247，3822-3828)。尽管有可疑的生理相关性(Okita，T.W.(1992)Isthereanalternativepathwayforstarchsynthesis？PlantPhysiol.100，560-56；Müller-Rber，B.，Sonnewald，U.Willmitzer，L.(1992)InhibitionoftheADPglucosepyrophosphorylaseintransgenicpotatoesleadstosugar-storingtubersandinfluencestuberformationandexpressionoftuberstorageproteingenes.EMBOJ.11，1229-1238)，已表明SS能够直接产生ADPG，其可以用于异养组织和光合组织(图1B和2B)中的淀粉生产(Pozueta-Romero，J.，Perata，P.，Akazawa，T.(1999)Sucrose-starchconversioninheterotrophictissuesofplants.Crit.Rev.PlantSci.18，489-525；Baroja-Fernández，E.，F.J.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2001)ReappraisalofthecurrentlyprevailingmodelofstarchbiosynthesisinphotosynthetictissuesaproposalinvolvingthecytosolicproductionofADPglucosebysucrosesynthaseandoccurrenceofcyclicturnoverofstarchinthechloroplast.PlantCellphysiol.42，1311-1320；Baroja-Fernández，E.，F.J.，Saikusa，T.，Rodríguez-López，M.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2003)SucrosesynthasecatalyzesthedenovoproductionofADPglucoselinkedtostarchbiosynthesisinheterotrophictissuesofplants.PlantCellPhysiol.44，500-509；Baroja-Fernández，E.，F.J.，Zandueta-Criado，A.，Morán-Zorzano，M.T.，Viale，A.M.，Alonso-Casajús，N.，Pozueta-Romero，J.(2004)MostofADPglucoselinkedtostarchbiosynthesisoccursoutsidethechloroplastinsourceleaves.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101，13080-13085)。按照这一假说(完全和详尽地基于生物化学类型的证据)，SS负责淀粉生物合成必需的重要的ADPG分子库的合成。然而，这一假说没有由基因工程或传统的作物改良技术在实验上得以证明，并且与表明AGPase是植物中ADPG的唯一来源的遗传和分子类型的无数的测试不相一致。(Okita，T.W.(1992)Isthereanalternativepathwayforstarchsynthesis？PlantPhysiol.100，560-56；Müller-Rber，B.，Sonnewald，U.Willmitzer，L.(1992)InhibitionoftheADPglucosepyrophosphorylaseintransgenicpotatoesleadstosugar-storingtubersandinfluencestuberformationandexpressionoftuberstorageproteingenes.EMBOJ.11，1229-1238；Neuhaus，E.H.，Husler，R.E.，Sonnewald，U.(2005)Notimetoshifttheparadigmonthemetabolicpathwaytotransitorystarchinleaves.TrendsPlantSci.atpress)基于一种叫做葡萄糖-1-磷酸(G1P)的昂贵的物质的使用，诸如UDPG和ADPG的糖核苷酸在商业上分别由诸如UDPG焦磷酸化酶(UGPase)和AGPase的酶催化的焦磷酸化酶反应而生产。对实行糖核苷酸生产的备选方法是基于SS的使用，其发展很大程度上受到大肠杆菌(Escherichiacoli)对大量的真核蛋白表达和有效处理的局限性的妨碍。这种局限性激发一些研究者通过应用诸如酵母菌的真核类型的生物工厂(biologicalfactories)来生产重组的SS(Zervosen，A.，Rmer，U.，Elling，L.(1998)Applicationofrecombinantsucrosesynthase-largescalesynthesisofADP-glucose.J.Mol.CatalysisBEnzymatic5，25-28；Rmer，U.，Schrader，H.，Günther，N.，Nettelstroth，N.，Frommer，W.B.，Elling，L.(2004)Expression，purificationandcharacterizationofrecombinantsucrosesynthaseIfromSolanumtuberosumL.forcarbohydrateengineering.J.Biotechnology107，135-149)。备选地，用于糖核苷酸生产的SS必须通过从植物提取液纯化蛋白的昂贵过程进行纯化(专利DE4221595(1993)，纯化的蔗糖合酶用于核苷酸激活的糖或寡糖的生产)。所述从植物提取液中获得的SS具有如下缺点它具有对UDP的偏好和对ADP的很低的亲和力(PresseyR(1969)Potatosucrosesynthasepurification，properties，andchangesinactivityassociatedwithmaturation.PlantPhysiol.44，759-764；Nguyen-Quock，B.，Krivitzky，M.，Huber，S.C.，Lecharny，A.(1990)Sucrosesynthaseindevelopingmaizeleaves.PlantPhysiol.94，516-523；Morell，M.，Copeland，L.(1985)Sucrosesynthaseofsoybeannodules.PlantPhysiol.78，149-154)。最近，已经完成了从大肠杆菌(E.coli)培养物中纯化重组SS(Nakai，T.，Tonouchi，N.，Tsuchida，T.，Mori，H.，Sakai，F.，Hayashi，T.(1997)“ExpressionandcharacterizationofsucrosesynthasefrommungbearseedlinginEscherichiacoli”Biosci.Biotech.Biochem.61，1500-1503；Nakai，T.，Konishi，T.，Zhang，Z-Q.，Chollet，R.，Tonouchi，N.，Tsuchida，T.，Yoshinaga，F.，Mori，H.，Sakai，F.，Hayashi，T.(1997)“AnincreaseinapparentaffinityforsucroseofmungbeansucrosesynthaseiscausedbyinvitrophosphorylationordirectedmutagenesisofSerll”PlantCellPhysiol.39，1337-1341；Barratt，D.H.P.，Barber，L.，Kruger，N.J.，Smith，A.M.，Wang，T.L.，Martin，C.(2001)Multiple，distinctisoformsofsucrosesynthaseinpea.PlantPhysiol.127，655-664；Christopher，B.，William，B.，Robert，H.“Bacterialsucrosesynthasecompositionsandmethodsofuse”专利WO9803637)。然而，在这种原核系统内生产SS与下述问题相关，如(1)产生的SS的量很低(30毫克/克细菌，Nakai，T.Tonouchi，N.，Tsuchida，T.，Mori，H.，Sakai，F.，Hayashi，T.(1997)“ExpressionandcharacterizationofsucrosesynthasefrommungbeanseedlingsinEscherichiacoli”Biosci.Biotech.Biochem.61，1500-1503；Li，C.R.，Zhang，X.B.，Hew，C.S.(2003)“Cloning，characterizationandexpressionanalysisofasucrosesynthasegenefromtropicalepiphyticorehidOncidiumgoldiana.Physiol.Plantarum118，352-360)，(2)获得的活性SS的量很低或等于零(0.05-1.5单位/mg，(Nakai，T.，Tonouchi，N.，TsuchidaT.，Mori，H.，Sakai，F.，Hayashi，T.(1997)“ExpressionandcharacterizationofsucrosesynthasefrommungbeanseedlingsinEscherichiacoli”Biosci.Biotech.Biochem.61，1500-1503；Li，C.R.，Zhang，X.B.，Hew，C.S.(2003)“Cloning，characterizationandexpressionanalysisofasucrosesynthasegenefromtropcalepiphyticorchidOncidiumgoldiana.Physiol.Plantarum118，352-360)；5.6U/mg(Rmer，U.，Schrader，H.，Günther，N.，Nettelstroth，N.，Frommer，W.B.，Elling，L.(2004)Expression，purificationandcharacterizationofrecombinantsucrosesynthaseIfromSolanumtuberosumL.forcarbohydrateengineering.J.Biotechnology107，135-149)，(3)重组的SS必须通过诸如层析、电泳、等电聚焦等蛋白纯化的常规方法进行纯化，上述方法，结合起来，证明是昂贵的而且不能保证处于均一状态下的蛋白的纯化，和(4)由于细菌的正确折叠蛋白的机制失活，大部分的SS形成包含体或以无活性聚集体的形式聚集下来，(Miroux，B.，Walker，J.E.(1996)“Over-productionofproteinsinEscherichiacolimutanthoststhatallowsynthesisofsomemembraneproteinsandglobularproteinsathighlevels”J.Mol.Biol.260，289-298)。本发明描述一种系统的开发，该系统基于适宜的大肠杆菌(E.coli)的应用和合适的表达载体的应用，其中所述的表达载体允许大规模生产和对活性形式的重组SS的不同变种的快速而容易的纯化。一些所述的变种具有比从植物提取液中获得的那些蛋白更高的对ADP的亲和力，可以用于从诸如蔗糖、UDP和ADP的便宜物质生产UDPG和ADPG。层析技术组成用于测定诸如植物提取液、血清、尿、果汁、酒、水果和食品的复合样品中蔗糖含量的有力工具(D’Aoust，M-A.，Yelle，S，Nguyen-Quock，B.(1999)Antisenseinhibitionoftomatofruitsucrosesynthasedecreasesfruitsettingandthesucroseunloadingcapacityofyoungfruit.PlantCell11，2407-2418；Tang，G-Q.，Sturm，A.(1999)Antisenserepressionofsucrosesynthaseincarrotaffectsgrowthratherthansucrosepartitioning.PlantMol.Biol.41，465-479；Frias，J.，Price，K.R.，Fenwich，G.R.，Hedley，C.L.，Sorensen，H.，Vidal-Valverde，C.(1996)J.Chromatogr.A719，213-219)。此类技术要求高级专业技术人员并包括在设备上的大量投资。不幸地是，基于通过转化酶作用的蔗糖分子水解和后续的对葡萄糖和/或果糖分子的分光光度和荧光测定的备选方法(Sweetlove，L.J.，Burrell，M.M.，apRees，T.(1996)StarchmetabolismintubersoftransgenicpotatowithincreasedADPglucosepyrophosphorylase.Biochem.J.320，493-498；Stitt，M.，Lilley，R.M.，Gerhardt，R.，Heldt，H.W.(1989)Metabolitelevelsinspecificcellsandsubcellularcompartmentsofplantleaves.MethodsEnzymol.174，518-552；Holmes，E.W.(1997)Coupledenzymaticassayforthedeterminationofsucrose.Anal.Biochem.244，103-109；MethodsofAnalysis(1996)CodeofPracticeforEvaluationofFruitandVegetableJuices.AssociationoftheIndustryofJuicesandNectarsfromFruitsandVegetablesoftheEurcpeanEconomicCommunity)受到技术本质的局限，例如对应样品中存在的内源葡萄糖和/或果糖的测量的减少。样品中葡萄糖和/或果糖的丰度能够增加妨碍蔗糖的可靠而准确测定的本底噪声。在大多数情况下，在得出关于样品的真实蔗糖含量的可靠陈述前，有必要进行彻底的检验(Worrell，A.C.，Bruneau，J-M.，Summerfelt，K.，Boersig，M.，Voelker，T.A.(1991)Expressionofamaizesucrosephosphatesynthaseintomatoaltersleafcarbohydratepartitioning.PlantCell3，1121-1130)。基于转化酶的应用的测定蔗糖的试剂盒可以从诸如Sigma、BiopharmGmbH和Megazyrne的公司获得。备选地，已经开发了一种蔗糖测定的自动化方法，其基于对由于细菌源性的蔗糖磷酸化酶的作用而释放的葡萄糖-1-磷酸的测定(Vinet，B.，Panzini，B.，Boucher，M.，Massicotte，J.(1998)Automatedenzymaticassayforthedeterminationofsucroseinserumandurineanditsuseasamarkerofgastricdamage.Clin.Chem.44，2369-2371)。本发明描述开发一种简单的、可靠的和便宜的测定样品中蔗糖的备选方法，其基于SS和水解ADPG或UDPG的偶联酶的应用。关于细胞内ADPG水平的控制因素的考虑主要围绕在合成酶AGPase的调节上(Preiss，(1988)Biosynthesisofstarchanditsregulation.TheBiochemistryofPlants.14卷，AcademicPress，纽约，182-249页；Pozueta-Romero，J.，Perata，P.，Akazawa，T.(1999)Sucrose-starchconversioninheterotrophictissues.Crit.Rev.Plant.Sci.18，489-525)。实际上，大部分关于ADPG生产和产生工业目的淀粉的植物的生产的专利和科学出版物围绕着AGPase的应用(Stark，D.M.，Timmerman，K.P.，Barry，G.F.，Preiss，J.，Kishore，G.M.(1992)RegulationoftheamountofstarchinplanttissuesbyADPglucosepyrophosphorylase.Science258，287-282；Slattery，C.J.，Kavakli，H.，Okita，T.W.(2000)Engineeringstarchforincreasedquantityandquality.TrendsPlantSci.5，291-298)。然而，尽管它们还没有用遗传/分子类型的证据所证实，近来的生物化学类型的科学研究表明，如图1B和2B所示，SS可能参与淀粉生物合成必需的ADPG的直接合成中(Baroja-Fernández，F.，F.J.，Saikusa，T.，Rodríguez-López，M.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2003)SucrosesynthasecatalyzesthedenovoproductionofADPglucoselinkedtostarchbiosynthesisinheterotrophictissuesofplants.PlantCellPhysiol.44，500-509)。这一假说是非常有争议的，记住(a)SS从未与叶片中淀粉的生产相关，(b)在质体膜上需要存在ADPG的易位体，该易位体将SS产生的ADPG胞质库与质体内部存在的淀粉合酶连系起来，和(c)包含SS作为ADPG生产来源是直接与许多生物化学/遗传/分子类型的测试相抵触的，所述测试看起来是表明AGPase是ADPG唯一的来源(Okita，T.W.(1992)Isthereanalternativepathwayforstarchsynthesis？PlantPhysiol.100，560-56；Müllen-Rber，B.，Sonnewald，U.Willmitzer，L.(1992)InhibitionoftheADPglucosepyrophosphorylaseintransgenicpotatoesleadstosugar-storingtubersandinfluencestuberformationandexpressionoftuberstorageproteingenes.EMBOJ.11，1229-1238；Stark，D.M.，Timmerman，K.P.，Barry，G.F.，Preiss，J.，Kishore，G.M.(1992)RegulationoftheamountofstarchinplanttissuesbyADPglucosepyrophosphorylase.Science258，287-282；Neuhaus，E.H.，Husler，R.E.，Sonnewald，U.(2005)Notimetoshifttheparadigmonthemetabolicpathwaytotransitorystarchinleaves.TrendsPlantSci.atpress)。可能由于所有这些原因，直到现在从未设计过量表达SS用于生产高水平的淀粉的植物。然而，本发明第一次描述过量表达SS以增加它们的ADPG和淀粉的生产的转基因植物的生产。相反地，我们表明由于不存在AGPase而缺乏淀粉的植物具有正常的ADPG水平。所有这些都表明，如图1B和2B所示，SS参与淀粉生物合成所必需的ADPG的直接合成中，并且负责植物细胞中积聚的大部分ADPG的合成。尽管基于图1A所展示的通路，按照该通路SS参与贮藏组织中的UDPG(但不是ADPG)合成中，许多工作描述了由于SS活性减少而引起淀粉含量减少的植物的生产(Chourey，P.S.，Nelson，O.E.(1976)Theenzymaticdeficiencyconditionedbytheshrunken-1mutationsinmaize.Bochem.Genet.14，1041-1055；Zrenner，R.，Salanoubat，M.，Willmitzer，L.，Sonnewald，U.(1995)Evidenceforthecrucialroleofsucrosesynthaseforsinkstrengthusingtransgenicpotatoplants.PlantJ.7，97-107；Tang，G-Q.，Sturm，A.(1999)Antisenserepressionofsucrosesynthaseincarrot(DaucuscarotaL.)affectsgrowthratherthansucrosepartitioning.PlantMol.Biol.41，465-479)。就这种意义来说，按照图1B和2B所示的代谢方案，还没有SS的过量表达可能被用于生产由于ADPG水平增加而具有高淀粉含量的植物实验证据。然而，基于SS生产细胞壁多糖生物合成的前体分子(UDPG)的能力，描述由于SS的过量表达而具有高纤维含量的棉属植物或具有高纤维素含量的谷类植物的生产的工作已经公布并取得专利权(Timothy，H.J.，Xiamomu，N.，Kanwarpal，S.“Manipulationofsucrosesynthasegenestoimprovestalkandgrainquality”专利WO02067662；Robert，F.，Danny，L.，Yong-Ling，R.“Modificationofsucrosesynthasegeneexpressioninplanttissueandusestherefor”专利WO0245485；Christopher，B.，William，B.，Robert，H.“Bacterialsucrosesynthasecompositionsandmethodsofuse”专利WO9803637)。本发明首先涉及大量生产可溶的、易纯化的、具有高特异性活性的重组SS的方法的开发和最优化，其基于合适的大肠杆菌(E.coli)菌株的应用和使SS具有组氨酸尾从而可能获得SS的表达载体的应用。本发明进一步涉及制备测定蔗糖的试剂盒的步骤，其基于具有SS活性的与ADPG或UDPG代谢酶偶联的酶产物的应用。本发明还涉及起始于特意为所述目的而设计的SS变种的糖核苷酸如ADPG或UDPG的最优化生产。最后，详细给出随着SS的过量表达而具有高含量的蔗糖、ADPG和淀粉、和高直链淀粉/支链淀粉比例的转基因植物的设计。发明详述编码SS的cDNA的扩增野生型蔗糖合酶SS4的核苷酸序列已知(Fu，H.，Park，W.D.(1995)Sink-andvascular-associatedsucrosesynthasefunctionsareencodedbydifferentgeneclassesinpotato.PlantCell7，1369-1385)，对应基因的5’和3’端设计并制造2条特异的引物。应用上述引物，通过常规PCR技术从马铃薯叶片cDNA文库中扩增出一段2418碱基对的DNA片段，称为SSX。将所述PCR片段插入到pSKBluescript质粒(Stratagene)中，制成pSS构建体(图3A)，将其在宿主细菌XL1Blue中扩增。活性重组SS在大肠杆菌(E.coli)特殊菌株的生产用限制性内切酶NcoI和NotI消化pSS。将释放出来的片段(其含有编码SS的cDNA，SSX)克隆到在多聚接头区域具有编码富含组氨酸序列的核苷酸序列的pET-28a(+)表达质粒(Novagen)的相同的限制酶切位点，其与重组蛋白融合。将由此得到的质粒(称为pET-SS，图3C)通过电穿孔插入到各种大肠杆菌(E.coli)的菌株中。将转化了pET-SS的大肠杆菌(E.coli)菌株BLR(DE3)(Novagen)于2003年10月29日保藏在位于BurjassotCampus，Burjassot46100(巴伦西亚，西班牙)巴伦西亚大学的研究大厦的西班牙典型培养物保藏中心(SpanishTypeCultureCollection)，保藏号为CECT5850。将所述细菌在LB培养基中在20℃孵化。SSX的过量表达通过在20℃生长的100ml细胞培养物中加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)而实现。经过6小时的诱导培养后，将所述细菌收集下来并悬浮在4ml的结合缓冲液(Novagen，His-结合纯化试剂盒)中，然后超声处理并在40,000g离心20分钟。将上层清液流过NovagenHis-结合纯化试剂盒的亲和柱，其中上层清液中含有在N-末端带有富含组氨酸残基的氨基酸序列的重组SS。遵循试剂盒的用法说明，用6ml推荐的洗脱缓冲液将SS洗脱下来，其中洗脱缓冲液中含有200mM咪唑而不是1M。洗脱后，将所述蛋白立即进行透析，以去除任何痕量的咪唑，其不可逆地使SS失活。被最优化用于产生ADPG的SS异构体的生产使用合适的引物，用pSS作模板，设计突变的变种SS5，制成构建体pSS5。这是使用QuikChange基因定点诱变试剂盒(Stratagene)进行的。将pSS5用NcoI和NotI消化。将释放出来的片段(其含有SS5)克隆到pET-28a(+)表达质粒的相同的限制酶切位点，制成pET-SS5，将其通过电穿孔插入到大肠杆菌(E.coli)BLR(DE3)菌株中。将转化了pSS5的大肠杆菌(E.coli)菌株XL1Blue于2003年10月29日保藏在位于BurjassotCampus，Burjassot46100(巴伦西亚，西班牙)巴伦西亚大学的研究大厦的西班牙典型培养物保藏中心，保藏号为CECT5849。过量表达SS4的转基因植物的生产在本发明中，SS以下述方式过量表达(a)组成性地，(b)在叶片中特异表达和(c)在诸如块茎的贮藏器官中的特异表达。对于组成性地过量表达SS的植物的生产，设计并制造由烟草花叶病毒的35S组成性启动子作用控制的构建体。在pSS中SSX的5’和3’区域连续插入35S启动子和NOS终止子，制成质粒p35S-SS-NOS，其限制性酶切图谱如图4B所示。为了能够通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)将该构建体转移到植物的基因组，首先必须将它克隆到二元质粒(binaryplasmid)中。为此，将p35S-SS-NOS连续用酶NotI、T4DNA聚合酶和HindIII消化，并克隆到预先连续用酶EcoRI、T4DNA聚合酶和HindIII消化的二元质粒pBIN20(图4A)中(Hennegan，K.P.，Danna，K.J.(1998)pBIN20AnimprovedbinaryvectorforAgrobacterium-mediatedtransformation.PlantMol.Biol.Rep.16，129-131)。由此获得的质粒称为pBIN35S-SS-NOS(图4C)。为了特异地在光照的叶片中过量表达SS，用PCR扩增编码烟草RUBISCO(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)小亚基的基因的启动子区域(称为RBCS)(Barnes，S.A.，Knight，J.S.，Gray，J.C.(1994)Alterationoftheamountofthechloroplastphosphatetranslocatorintransgenictobaccoaffectsthedistributionofassimilatebetweenstarchandsugar.PlantPhysiol.106，1123-1129)。将所述核苷酸序列(其赋予在光合活性细胞内的特异表达)插入到pGEMT-easy载体(Promega)，制成pGEMT-RBCSprom(图5A)。将该构建体用HindIII和NcoI消化，并将释放出来的片段克隆到p35S-SS-NOS对应的限制酶切位点，制成pRBCS-SS-NOS(图5B)。将该构建体连续用HindIII、T4DNA聚合酶和NotI消化。将释放出来的片段克隆到连续用HindIII、T4DNA聚合酶和EcoRI消化的pBIN20中。由此得到的构建体称为pBINRBCS-SS-NOS(图5C)。在大肠杆菌(E.coli)(XL1Blue)中扩增后，将pBIN35S-SS-NOS和pBINRBCS-SS-NOS插入到根癌农杆菌(A.tumefaciens)C58GV2260中(Debleare，R.，Rytebier，B.，deGreve，H.，Debroeck，F.，Schell，J.，vanMontagu，M.，Leemans，J.(1985)“EfficientoctopineTiplasmid-derivedvectorsofAgrobacteriummediatedgenetransfertoplants”Nucl.AcidsRes.13，4777-4788)，其被用于通过常规技术转化诸如番茄(Lycopersiconsculentum)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)和稻属的物种(Horsch，R.B.，Fry，J.E.，Hoffmann，N.L.，Eichholtz，D.，Rogers，S.G.，Fraley，R.T.(1985)“Asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants”Science277，1229-1231；Pozueta-Romero，J.，Houlné，G.，Schantz，R.Chamarro，J.(2001)“EnhancedregenerationoftomatoandpepperseedlingexplantsforAgrobacterium-mediatedtransformation”PlantCellTiss.Org.Cult.67，173-180；Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.，Kumashiro.T.(1994)“Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ.6，271-282)。所述转化了pBIN35S-SS-NOS的根癌农杆菌C58GV2260于2003年10月29日保藏在位于BurjassotCampus，Burjassot46100(巴伦西亚，西班牙)巴伦西亚大学的研究大厦的西班牙典型培养物保藏中心，保藏号为CECT5851。测定蔗糖的测定试剂盒的制备一种设计用于蔗糖测定的试剂盒，如下述方案I所示的包含在用于蔗糖的分光光度和荧光测定的试剂盒中的酶促反应，上述测定基于蔗糖到糖核苷酸的转化及随后糖核苷酸到葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和NAD(P)H的转化。所述试剂盒基于在核苷酸二磷酸(例如UDP或ADP)存在下SS对蔗糖分子的作用，释放出等摩尔量的果糖和相应的糖核苷酸。如果由所述反应产生的糖核苷酸是UDPG，该糖核苷酸受到诸如Nudix类型的UDPG焦磷酸化酶(EC3.6.1.45)的UDPG水解酶的作用(Yagi，T.，Baroja-Fernández，E.，Yamamoto，R.，F.J.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2003)Cloning，expressionandcharacterizationofamammalianNudixhydrolase-likeenzymethatcleavesthepyrophosphatebondofUDP-glucose.Biochern.J.370，409-415)orUDPGhydrolase(Burns，D.M.，Beacham，I.R.(1986)NucleotidesequenceandtranscriptionalanalysisoftheE.coliushAgene，encodingperiplasmicUDP-sugarhydrolase(5’-nucleotidase)regulationoftheushAgene，andthesignalsequenceofitsencodedproteinproduct.Nucl.AcidsRes.14，4325-4342)。由上述水解酶作用释放出的G1P通过葡糖磷酸变位酶(PGM)作用而转化，产生葡萄糖-6-磷酸(G6P)，其依次可以通过G6P脱氢酶(G6PDH)的作用而经受与NAD(P)+的偶联反应，产生在340nm处通过荧光测定法和分光光度法可以容易地测定的6-磷酸葡糖酸和NAD(P)H。依次地，释放出的NAD(P)H可以与FMN-氧化还原酶/荧光素酶作用偶联，产生可以由分光光度测定法定量的光。备选地，如方案II所示，产生的UDPG可以与UDPG脱氢酶(EC1.1.1.22)偶联，其在NAD的存在下给出等摩尔量的UDP-葡糖醛酸和NADH，所述UDP-葡糖醛酸和NADH在340nm下可以通过荧光测定法或分光光度法测定。依次地，释放出的NADH可以与FMN-氧化还原酶/荧光素酶作用偶联，产生可以由分光光度测定法定量的光。产生可以由分光光度测定法定量的光。方案II如果SS催化反应的产物是ADPG，ADPG受到诸如细菌ADPG焦磷酸化酶(EC3.6.1.21)的ADPG水解酶的作用(Moreno-Bruna，B.，Baroja-Fernández，E.，F.J.，Bastarrica-Berasategui，A.，Zandueta--Criado，A.，Rodríguez-López，M.，Lasa，I.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2001)AdenosinediphosphatesugarpyrophosphatasepreventsglycogenbiosynthesisinEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，8128-8132)。释放出的G1P通过葡糖磷酸变位酶作用而转化，产生葡萄糖-6-磷酸(G6P)，其依次可以通过G6P脱氢酶作用而经受与NAD(P)+的偶联反应，产生在340nm处通过荧光测定法或分光光度法可以容易地测定的6-磷酸葡糖醛酸和NAD(P)H。在任何情况中，与由SS调节的糖核苷酸的产生所偶联的酶促反应方案完美地适用于电流分析法检测。实施本发明的实施例下文描述实施例，其详细地显示将编码马铃薯SS的异构体的cDNA克隆到合适的表达载体中和对酶以其活性形式生产和积聚最优化的一种大肠杆菌(E.coli)菌株中的步骤。其它实施例描述重组SS用于制备测定植物样品、血清、尿、果汁、加糖果汁饮料、提神饮料等的蔗糖的测定试剂盒的应用。另一个实施例描述用于诸如UDPG和ADPG的糖核苷酸的大量生产的最优化的SS变种的应用。最后，另一个实施例描述由于在过量表达SS的植物中的高ADPG生产活性而具有高含量的蔗糖、ADPG和淀粉、和高直链淀粉/支链淀粉比例的植物的生产。实施例1在大肠杆菌(Escherichiacoli)BLR(DE3)中表达带有组氨酸尾的重组SS，其易于纯化并且具有高特异性活性已知编码马铃薯SS异构体的SS4基因的核苷酸序列，可以设计2条特异性引物，其序列从5’-3’方向为SEQIDNO1和SEQIDNO2。应用上述引物，通过常规PCR方法从马铃薯块茎cDNA文库中扩增出一段称为SSX的DNA片段，将所述片段插入到pSKBluescript质粒(Stratagene)中，将其在宿主细菌XL1Blue中扩增。SSX的核苷酸序列为SEQIDNO3，其与SS4(GenBank入藏登记号U24087)有细微的不同。从序列SEQIDNO3推断的氨基酸序列与SS4细微不同，因此称为SSX。在pET-28a(+)质粒中表达SEQIDNO3后推断的氨基酸序列为SEQIDNO4，其包含一段融合到从SEQIDNO3推断的氨基酸序列氨末端的富含组氨酸的38个氨基酸的序列。通过添加1mMIPTG来在转化了pET-SS的BL21(DE3)细菌中诱导生产SSX。在37℃继续培养6小时后，可以观察到转化了pET-SS的细菌积聚了一种聚集体形式的蛋白，其大小与SS相符。然而，所述细菌并不具有SS活性。这一在SS活性形式表达中的失败可以归因于大肠杆菌(E.coli)在对特定的大分子量的真核蛋白的正确折叠中存在的问题(Miroux，B.，Walker，J.E.(1996)“Over-productionofproteinsinEscherichiacolimutanthoststhatallowsynthesisofsomemembraneproteinsandglobularproteinsathighlevels”J.Mol.Biol.260，289-298)。为了克服这一问题的目的，研究了在其它细菌菌株中和在20℃温度下生产活性SS的能力。在所有的研究中，SSX的生产通过添加1mMIPTG而诱导。继续孵化6小时后，将所述细菌进行超声处理和离心。将由此获得的上层清液进行SS活性分析。在这些条件下，如图6所示，从生产可溶的、活性SS的观点来看，证明BLR(DE3)菌株是最有效的。所述转化了pET-SS的大肠杆菌(E.coli)菌株BLR(DE3)(Novagen)于2003年10月29日保藏在西班牙典型培养物保藏中心，保藏号为CECT5850。与文献中描述的重组SS的非常低的生产力(30毫克每克细菌)(Nakai，T.，Tonouchi，N.，Tsuchida，T.，Mori，H.，Sakai，F.，Hayashi，T.(1997)“ExpressionandcharacterizationofsucrosesynthasefrommungbeanseedlingsinEscherichiacoli”Biosci.Biotech.Biochem.61，1500-1503；Li，C.R.，Zhang，X.B.，Hew，C.S.(2003)“Cloning，characterizationandexpressionanalysisofasucrosesynthasegenefromtropicalepiphyticorchidOncidiumgoldiana.Physiol.Plantarum118，352-360)相比，在CECT5850的全蛋白库中重组SSX的供量(contribution)大约为20％。将所述上层清液流经His-结合亲和柱(Novagen)，具有组氨酸尾的重组蛋白特异性地保留在柱中。洗脱并将纯化的SS透析之后，将它与50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKCl/2mMUDP一起孵化。根据UDPG的生产测定的特异性活性是80单位/mg蛋白，远高于文献中描述的0.05-5单位/mg重组SS的活性(Nakai，T.，Tonouchi，N.，Tsuchida，T.，Mori，H.，Sakai，F.，Hayashi，T.(1997)“ExpressionandcharacterizationofsucrosesynthasefrommungbeanseedlingsinEscherichiacoli”Biosci.Biotech.Biochem.61，1500-1503；Li，C.R.，Zhang，X.B.，Hew，C.S.(2003)“Cloning，characterizationandexpressionanalysisofasucrosesynthasegenefromtropicalepiphyticorchidOncidiumgoldiana.Physiol.Plantarum118，352-360)；Rmer，U.，Schrader，H.，Günther，N.，Nettelstroth，N.，Frommer，W.B.，Elling，L.(2004)Expression，purificationandcharacterizationofrecombinantsucrosesynthaseIfromSolanumtuberosumL.forcarbohydrateengineering.J.Biotechnology107，135-149)，并且高于从植物提取液中纯化的SS对应的3单位/mg的活性(PresseyR(1969)Potatosucrosesynthasepurification，properties，andchangesinactivityassociatedwithmaturation.PlantPhysiol.44，759-764.)。所述单位(unit)定义为每分钟催化产生1摩尔UDPG的酶的量。在500mM蔗糖存在下，对UDP的亲和力是Km(UDP)＝0.25mM，而在1mMUDP存在下，对蔗糖的Km是30mM。在UDP存在下对蔗糖的亲和力显著地高于在酵母菌中获得的重组SS所表现出的亲和力(Km＝95mM，Rmer，U.，Schrader，H.，Günther，N.，Nettelstroth，N.，Frommer，W.B.，Elling，L.(2004)Expression，purificationandcharacterizationofrecombinantsucrosesynthaseIfromSolanumtuberosumL.forcarbohydrateengineering.J.Biotechnology107，135-149)。实施例2基于使用来自大肠杆菌(E.coli)的重组SS的UDPG和ADPG的大规模生产将100毫升含有1M蔗糖，50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKCl/100mMUDP和30单位的重组马铃薯SS的溶液在37℃孵化12小时之后，有效地和经济地生产出3克高纯度的UDPG，其中所述重组马铃薯SS通过在BLR(DE3)中表达pET-SS并随后进行纯化获得。将所述溶液在100℃加热90秒使反应终止，然后以10,000g转速离心10分钟。将上层清液应用到制备级HPLC色谱仪(WatersAssociates)，并且按照文献(Rodríguez-López，M.，Baroja-Fernández，E.，Zandueta-Criado，A.，Pozueta-Romero，J.(2000)Adenosinediphosphateglucosepyrophosphataseaplastidialphosphodiesterasethatpreventsstarchbiosynthesis.Proc.Natl.Acad.Sci.美国97，8705-8710)所描述纯化UDPG。ADPG的生产要求产生一种SS的突变形式，该突变形式对ADP的亲和力远高于所描述的从植物组织中提取的SS(PnesseyR(1969)Potatosucrosesynthasepurification，properties，andchangesinactivityassociatedwithmaturaton.PlantPhysiol.44，759-764；Nguyen-Quock，B.，Krivitzky，M.，Huber，S.C.，Lecharny，A.(1990)Sucrosesynthaseindevelopingmaizeleaves.PlantPhysiol.94，516-523；Morell，M.，Copeland，L.(1985)Sucrosesynthaseofsoybeannodules.PlantPhysiol.78，149-154)。称为SS5的这一异构体通过使用QuikChange基因定点诱变试剂盒(Stratagene)对SSX进行点诱变和连续应用下述引物对而获得，其中所述引物对的序列为[SEQIDNO5，SEQIDNO6]，[SEQIDNO7，SEQIDNO8]和[SEQIDNO9，SEQIDNO10]。由此获得的被称为SS5的核苷酸序列为序列SEQIDNO11。SS5(Susy5)氨基酸序列中相对于SS4-Susy4-(数据库中所示)的变化在表I中为阴影部分所示。将序列SEQIDNO11在pET-28a(+)质粒中表达后推断的氨基酸序列为SEQIDNO12，其包含一段融合到从SEQIDNO11推断的氨基酸序列氨末端的富含组氨酸的38个氨基酸的序列。表I包含所述融合到SS5氨末端部分的富含组氨酸的38个氨基酸。表I表达pET-SS5之后获得的重组SS5在UDP和ADP存在下，分别具有80单位/mg蛋白和65单位/mg蛋白的Vmax。在500mM蔗糖存在下，对UDP和ADP的亲和力非常相似(Km＝0.2mM，对ADP和UDP)，而在饱和浓度的UDP和ADP存在下，对蔗糖的Km分别为30mM和100mM。这些动力学参数与那些对从马铃薯块茎和其它物种的其它组织提取的SS进行描述的参数有很大的不同，按照那些参数，所述酶的Vmax在UDP存在下比在ADP存在下高10倍(PresseyR(1969)Potatosucrosesynthasepurification，properties，andchangesinactivityassociatedwithmaturation.PlantPhysiol.44，759-764；Morell，M.，Copeland，L.(1985)Sucrosesynthaseofsoybeannodules.PlantPhysiol.78，149-154；Nguyen-Quock，B.，Krivitzky，M.，Huber，S.C.，Lecharny，A.(1990)Sucrosesynthaseindevelopingmaizeleaves.PlantPhysiol.94，516-523)。转化了pSS5的大肠杆菌(E.coli)菌株XLlBlue保藏在西班牙典型培养物保藏中心，保藏号为CECT5849。将100毫升含有1M蔗糖，50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKCl/100mMADP和30单位的重组马铃薯SS的溶液在37℃孵化12小时之后，有效地和经济地生产出3克高纯度的ADPG，其中所述重组马铃薯SS通过在BLR(DE3)中表达pET-SS5并随后在His-结合柱上进行纯化获得。将所述溶液在100℃加热90秒使反应终止，然后以10,000g转速离心10分钟。将上层清液应用到制各级HPLC色谱仪(WatersAssociates)，以纯化ADPG。实施例3测定蔗糖的酶促试剂盒的制备为测定蔗糖，制备具有下述成分和最终量/浓度的下述反应混合物1.基于糖核苷酸水解酶的应用的试剂盒a.2单位的SS(重组或非重组)b.2mMADP或UDP(分别取决于是生产ADPG还是UDPG)c.2单位ADPG焦磷酸化酶或2单位UDPG焦磷酸化酶(分别取决于它是否要包含在所述ADP或UDP反应混合物中)d.2单位的PGMe.2单位的G6PDHf.0.5mMNAD(P)g.反应缓冲液50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKClh.预先过滤的测试样品2.基于UDPG脱氢酶的应用的试剂盒a.2单位的SS(重组或非重组)b.2mMUDPc.2单位的UDPG脱氢酶d.0.5mMNADe.反应缓冲液50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKClf.预先过滤的测试样品对测试样品中存在的蔗糖的量的测定是基于对按照方案I和方案II所示的偶联反应产生的NAD(P)H的荧光测定或分光光度测定(在340nm)。为测定不同发育程度的大麦属种子的蔗糖含量(图7)，反应发生在ELISA板的300微升的孔中，在37℃反应3分钟。测试样品的体积是20微升，由试剂a-g(试剂盒#1)和a-e(试剂盒#2)结合组成的混合物的体积是280微升。空白包含除SS外混合物的所有成分。用多扫描分光光度计进行测量。发现用类型“1”的试剂盒和类型“2”的试剂盒获得的数值与用导言中描述的层析技术测定的数值相当(Baroja-Fernández，E.，Saikusa，T.，Rodríguez-López，M.，Akazawa，T.，Pozueta-Romero，J.(2003)SucrosesynthasecatalyzesthedenovoproductionofADPglucoselinkedtostarchbiosynthesisinheterotrophictissuesofplants.PlantCellPhysiol.44，500-509)。实施例4过量表达SS的转基因植物的生产图8-10展示从组成性(35S-SS-NOS)和特异性(RBCS-SS-NOS)过量表达SS的马铃薯植物的叶片中获得的结果。如图8所示，在任意所述植物的叶片中的SS活性比在野生型植物(WT)相同器官中的活性高2-10倍。所述叶片具有下述特征1.生产ADPG的SS活性(图8)与淀粉(图9)和ADPG(图10)的水平之间的明显的相关性。这一特征不仅在叶片中还在诸如块茎和种子的贮藏组织(参见下文)中观察到。2.相对于野生型植物叶片的高淀粉含量(图9)。例如，在8小时光照/16小时黑暗的光周期和20℃生长的“野生型”马铃薯植物的叶片的淀粉含量是5微摩/克鲜重，而过量表达SS的转基因植物的叶片的淀粉含量是8微摩/克鲜重。当光周期变长时，将加强野生型植物和转基因植物之间的这种差别，以致过量表达SS的植物的叶片含有比野生型植物叶片多4倍的淀粉。3.相对于非转化植物的相同组织或器官的高ADPG含量(图10)。在8小时光照/16小时黑暗的光周期和20℃生长的野生型马铃薯植物的叶片中平均含量是0.35纳摩/克鲜重，而过量表达SS的植物的叶片可以具有2.5纳摩/克鲜重的含量。4.在光周期期间，ADPG和淀粉都表现出短暂的聚集(图11)。两种物质的聚集比例与SS活性保持正相关性，表明SS在ADPG生产和蔗糖代谢与淀粉代谢之间的联系中起着重要的作用，这与淀粉生物合成“传统”模型(图2A)所揭示的内容相反，并证实了图2B所示的“备选”模型假说，SS在ADPG产生中以及在蔗糖代谢和淀粉代谢的联系中起到重要的作用。5.诸如葡萄糖和果糖的可溶性糖的正常水平。然而，在转基因叶片中葡萄糖-6-磷酸和蔗糖的水平高于在野生型马铃薯叶片中观察到的结果(表2)。表2在对照植物(WT)叶片中和35S-SuSy-NOS来源的叶片中，代谢物水平(用nmol/g鲜重表示)。用粗体字显示与在野生型(WT)中观察到的数值有显著区别的数值。6.当与非转化的植物相比时，过量表达SS的植物外部形态学没有异常。图12-14显示在组成性过量表达SS(35S-SS-NOS)的马铃薯块茎中获得的结果。所述结果与那些在特异性块茎启动子(patatina基因的启动子)控制下过量表达SS的块茎中观察到的结果基本上相同。如图12所示，在任何一种所述植物的块茎中的SS活性高于在野生型植物的相同器官中的活性？？？倍。所述块茎具有下述特征1.生产ADPG的SS活性(图12)和淀粉(图13)与ADPG(图14)水平之间的明显的相关性。2.相对于非转化植物块茎的高淀粉含量(图13)。例如，“野生型”植物的块茎中的淀粉含量是约300毫摩/克鲜重(相当于54mg淀粉/克鲜重)，而在过量表达SS的块茎中，淀粉含量是450-600毫摩/克鲜重。3.相对于野生型植物块茎的高ADPG含量(图14)。在野生型块茎中的平均含量是5纳摩/克鲜重，而过量表达SS的块茎具有7-9纳摩/克鲜重的含量。在稻属种子、番茄属和烟草叶片、和番茄属果实中获得的结果，与图8-14显示的结果性质上相似。在所有情况下，存在淀粉含量的增加和直链淀粉/支链淀粉比例的增加。按照目前关于淀粉的生物合成的观点(在图1A和2A中举例说明)，随着SS的过量表达而具有高ADPG和淀粉含量的植物的生产是完全预料不到的，这或许可以解释为什么过量表达SS的植物设计早先没有被采用作为提高淀粉生产的策略。基于本工作所获得的结果表明SS，而不是AGPase，是植物中积聚的ADPG的基本来源。按照当前的模型，AGPase是ADPG的唯一来源。然而，令人吃惊地是，在AGPase-缺陷植物中的ADPG水平从未被研究过。为了探究本发明的重要性，我们第一次分析了在具有减少的AGPase活性的拟南芥属(Arabidopsis)和马铃薯植物中的ADPG和淀粉水平。如图15A所示，在AGPase-缺陷的TL25拟南芥(TL25Arabidopsis)植物中的淀粉水平(Lin，T.P.，Caspar，T.，Somerville，C.R.，Preiss，J.(1988)IsolationandcharacterizationofastarchlessmutantofArabidopsisthalianalackingADPglucosepyrophosphorylaseactivity.PlantPhysiol.88，1131-1135)低于在野生型植物中观察到的结果。然而，ADPG水平是正常的(图15B)。但是，在AGP62和AGP85马铃薯植物中的淀粉水平(Miille-Rber，B.，Sonnewald，U.Willmitzer，L.(1992)InhibitionoftheADPglucosepyrophosphorylaseintransgenicpotatoesleadstosugar-storingtubersandinfluencestuberformationandexpressionoftuberstorageproteingenes.EMBOJ.11，1229-1238)相对于在野生型植物叶片中观察到的结果是减少的(图16A)。然而，ADPG水平是完全正常的(图16B)。综合起来看，这些观察资料(a)表明SS，而不是AGPase，是植物中ADPG的主要来源，和(b)在证明SS的过量表达引起植物具有高淀粉含量后，突出了本发明的重要性。附图描述图1在异养器官中的淀粉生物合成机制。(A)“传统”机制，按照该机制SS参与UDPG的生产，在UDPG焦磷酸化酶(UGPase)、胞质葡糖磷酸变位酶(PGM)、质体葡糖磷酸变位酶、ADPG焦磷酸化酶(AGPase)和淀粉合酶的联合作用后，UDPG最终转化为淀粉。(B)“备选”机制，按照该机制SS参与胞质中的ADPG直接生产。然后ADPG通过易位体的作用被转运到造粉质体。一旦进入造粉质体，淀粉合酶利用ADPG生产淀粉。图2叶片中淀粉生物合成的机制。(A)“传统”机制，按照该机制，淀粉生物合成的全过程发生在叶绿体内。按照这一观点，淀粉新陈代谢和蔗糖是不相联系的。而且，SS不参与糖异生过程。(B)淀粉生物合成的“备选”机制，按照该机制，SS包含在胞质中的ADPG直接合成中。然后ADPG被转运到质体内部，在这里淀粉合酶利用它作为淀粉合成反应的底物。图3从pET-28a(+)和pSS构建pET-SS表达质粒的步骤。图4从pBIN20和p35S-SS-NOS构建pBIN35S-SS-NOS表达质粒的步骤。图5从pGEMT-RBCSprom、p35S-SS-NOS和pBIN20构建pRBCS-SS-NOS表达质粒的步骤。图6pET-SS在不同大肠杆菌菌株中的表达。(A)在转化了pET或pET-SS的细菌提取液中的SS活性(毫单位(mU)/毫克细菌蛋白)。反应发生在蔗糖降解和产生ADPG的方向。所述反应混合物包含50mMHEPES(pH7.0)，1mMEDTA，20％聚乙二醇，1mMMgCl2，15mMKCl和2mMADP。反应在37℃发生10分钟。(B)来自转化了pET和pET-SS的大肠杆菌(E.coli)不同菌株的蛋白提取液的SDS-PAGE。重组SSX的位置用星号表示。图7使用基于SS、ADPG(UDPG)焦磷酸化酶、PGM和G6PDH的偶联反应的试剂盒对大麦属胚乳不同发育阶段的蔗糖的测定。所述结果与下述实验平行获得的结果一致(a)通过使用基于SS和ADPG(UDPG)脱氢酶偶联反应的试剂盒，和(b)通过使用在与Carbo-PacPA1柱相连的DX-500Dionex系统中带有电泳检测的高效液相色谱(HPLC)。横坐标开花后的天数纵坐标蔗糖含量(μmol/gFW)图8在野生型(WT)马铃薯植物和在将构建体35S-SS-NOS(通过根癌农杆菌CECT5851菌株的作用)或RBCS-SS-NOS整合入其基因组后过量表达SSX的马铃薯植物的叶片中的SS活性。活性用毫单位(mU)每克鲜重表示。所述单位定义为每分钟产生1微摩尔ADPG所需的SS的量。图9在野生型(WT)马铃薯植物和在将构建体35S-SS-NOS(通过根癌农杆菌CECT5851菌株的作用)或RBCS-SS-NOS整合入其基因组后过量表达SSX的马铃薯植物的叶片中的淀粉含量。图10在野生型(WT)马铃薯和在将构建体35S-SS-NOS(通过根癌农杆菌CECT5851菌株的作用)或RBCS-SS-NOS整合入其基因组后过量表达SSX的马铃薯植物的叶片中的ADPG含量。图11(A)淀粉和(B)ADPG在8小时光照和16小时黑暗的光周期期间在野生型植物(●)、35S-SS-NOS(■)和RBCS-SS-NOS(▲)的叶片中的短暂积聚。图12在野生型马铃薯植物(WT)、再生对照(RG)和在构建体35S-SS-NOS整合到其基因组(通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CECT5851菌株的作用)后过量表达SSX的马铃薯植物的块茎(线条4，5，6和12)中的SS活性(参考于鲜重，FW)。活性用毫单位(mU)每克鲜重表示。所述单位定义为每分钟产生1微摩尔ADPG所需的SS的量。图13在野生型马铃薯植物(WT)、再生对照(RG)和在构建体35S-SS-NOS整合到其基因组(通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CECT5851菌株的作用)后过量表达SSX的马铃薯植物的块茎(线条4，5，6和12)中的淀粉含量(参考于鲜重，FW)。图14在野生型马铃薯植物(WT)和在构建体35S-SS-NOS整合到其基因组(通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CECT5851菌株的作用)后过量表达SSX的马铃薯植物的块茎中的ADPG含量(参考于鲜重，FW)。图15在AGPase-缺陷的拟南芥(Arabidopsisthaliana)TL25的叶片中(A)淀粉和(B)ADPG含量。图16在AGPase-缺陷的马铃薯AGP62和AGP85的叶片中(A)淀粉和(B)ADPG含量。序列表<110>纳瓦拉公立大学<120>重组蔗糖合酶的生产方法、及其在生产蔗糖测定试剂盒中的应用、生产腺苷二磷酸葡糖的方法和获得具有积累了高浓度的腺苷二磷酸葡萄糖和淀粉的叶片和储藏器官的转基因植物的方法<130>PCT-180<150>ES200400257<151>05.02.04<160>12<210>1<211>25<212>DNA<213>马铃薯<220><223>SS45′区域的启动子<400>ctgccatggctgaacgtgttttgac25<210>2<211>27<212>DNA<213>马铃薯<220><223>SS43′区域的启动子<400>cttcattcactcagcagccaatggaac27<210>3<211>2418<212>DNA<213>马铃薯<220><223>SSX<400>atggctgaacgtgttttgactcgtgttcatagccttcgtgaa42cgtgttgatgcaactttagctgctcaccgcaatgagatactg84ctgtttctttcaaggatcgaaagccacggaaaagggatattg126aaacctcatgagcttttggctgagttcgatgcaattcgccaa168gatgacaaaaacaaactgaacgaacatgcattcgaagaactc210ctgaaatccactcaggaagcgattgttctgcccccttgggtt252gcacttgctattcgtttgaggcctggtgtctgggaatacatc294cgtgtgaacgtcaatgcactagttgtcgaggagctgtccgtc336cctgagtatttgcaattcaaggaagaacttgtcgacggagcc378tcgaatggaaattttgttctcgagttggatttcgagcctttc420actgcatcctttcctaaaccaaccctcaccaaatctattgga462aatggagttgaattcctcaataggcacctctctgccaaaatg504ttccatgacaaggaaagcatgaccccgcttctcgaatttctt546cgcgctcaccattataagggcaagacaatgatgctgaatgat588aggatacagaattcgaatactcttcaaaatgtcctaaggaag630gcagaggaatacctcattatgctttccccagatactccatat672ttcgaattcgagcacaagttccaagaaatcggattggagaag714ggatggggggacacggcggagcgtgtgctagagatggtatgc756atgcttcttgatctccttgaggctcctgactcatgtactctt798gagaagttcttggggagaattcctatggttttcaatgtggtt840atcctttcccctcatggatattttgcccaagaaaatgtcttg882ggttatcccgacaccggtggccaggttgtctacattttagat924caagttcccgccttggagcgtgaaatgcttaagcgcataaag966gagcaaggacttgatatcatcccccgtattcttattgttact1008cgtctgctgcccgatgcagttggaaccacttgtggtcagagg1050attgagaaggtgtatggagcagaacactcacatattcttagg1092gtcccttttaggactgagaagggcattgttcgcaaatggatc1134tctcgctttgaagtgtggccatacatggagacattcattgag1176gatgttgcaaaagaaatttctgcagaactgcaggccaagcca1218gatttgataattggaaactacagtgagggcaatcttgctgct1260tctttgctagctcacaagttaggcgtaactcagtgcaccatt1302gcccacgcgttggagaaaacgaagtatcctgattccgacatt1344tactggaaaaagtttgatgaaaaataccatttctcgtcccag1386tttaccgctgatctcattgcaatgaatcacactgatttcatc1428atcaccagcaccttccaggagatagcaggaagcaaggacact1470gtaggacaatatgagagccatatggcattcacaatgcctgga1512ttgtacagagttgttcacggcattaatgtgttcgaccccaaa1554ttcaacattgtctcacctggagctgatattaatctctacttc1596tcgtactccgaaacggagaagagacttacagcatttcaccct1638gaaattgatgagctgctgtatagtgatgttgagaatgacgag1680catctgtgtgtgctcaaggacaggactaaaccaattttattc1722acaatggcaaggttggatcgtgtgaagaatttaactggactt1764gttgagtggtacgccaagaatccacgactaaggggattggtt1806aacctggttgtagttggcggagatcgaaggaaggaatccaaa1848gatttggaagagcaggcagagatgaagaagatgtatgagcta1890attgagactcataatttgaatggccaattcagatggatttct1932tcccagatgaaccgagtg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yrarglysmetalaglualavalproleualaala825830835840glu84权利要求1.-一种以其可溶、活性形式有效生产高水平的重组蔗糖合酶(SS)酶的方法，其特征在于其包括a)从编码马铃薯SS异构体SS4的基因的核苷酸序列获得2个由SEQIDNO1和SEQIDNO2序列代表的引物，基于马铃薯叶片cDNA文库，使用该引物通过PCR扩增由SEQIDNO3序列代表的2418碱基对的cDNA片段，b)将所述cDNA片段插入到第一载体，c)将所述第一载体插入到第一宿主微生物，所述载体在其中被扩增，d)用至少2个限制性内切酶消化扩增的构建体，e)在上述消化后，获得包含编码SSX的cDNA的DNA片段，其推断的氨基酸序列由SEQIDNO4代表，f)在与其相同的限制酶切位点处，将所述片段克隆到包含编码富含组氨酸序列的核苷酸序列的载体中，将所述富含组氨酸的尾融合到SS，得到第二表达载体，g)将第二载体插入到第二宿主微生物中，所述载体在其中被表达，h)在适宜的培养条件下孵化所述转化的微生物，以合成可溶、活性形式的SSX，i)分离并纯化活性形式的SSX。2.-前述权利要求中要求的生产重组SS的方法，其特征在于步骤b)所用的第一表达载体是质粒pSK，当插入SEQIDNO3序列时，得到图3A的构建体pSS。3.-前述权利要求中要求的生产重组SS的方法，其特征在于步骤c)所用的扩增pSK质粒的第一宿主微生物是大肠杆菌(E.coli)细菌XL1Blue。4.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于步骤d)中所用的限制性内切酶是NcoI和NotI。5.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于，步骤f)中，步骤d)后释放的DNA片段克隆的限制酶切位点与图3B所示的质粒pET-28a(+)相同，得到图3C所示的pET-SS质粒。6.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于步骤g)中所用的第二宿主微生物是大肠杆菌的BLR(DE3)菌株。7.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于步骤g)中转化的菌株是CECT5850，其在步骤h)中在适宜的培养条件下孵化，以合成可溶的、活性形式的SSX。8.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于合成SSX的适宜的培养条件包括将所述细菌培养物置于20℃的温度。9.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于SSX的纯化优选地通过用于富含组氨酸残基的氨基酸序列的亲和层析和使用含有优选浓度为200mM的咪唑的洗脱缓冲液实现。10.-前述权利要求任一项中要求的生产重组SS的方法，其特征在于，为保持纯化的SSX酶处于其活性形式，将所述从亲和层析洗脱下来的纯化酶立即进行透析，以去除任何痕量的咪唑。11.-一种生产重组马铃薯SS5异构体的方法，其特征在于其包括a)应用构建体pSS作为模板，和，通过连续地应用序列为[SEQIDNO5，SEQIDNO6]、[SEQIDNO7，SEQIDNO8]和[SEQIDNO9，SEQIDNO10]的引物对后进行定向诱变，获得由序列SEQIDNO11代表的2418碱基对的DNA片段，b)将所述DNA片段插入到第一载体，c)将所述第一载体插入到第一宿主微生物，所述载体在其中被扩增，d)用至少2个限制性内切酶消化扩增的构建体，e)在上述消化后，获得编码SS5的DNA片段，其氨基酸序列由SEQIDNO12代表，f)在与其相同的限制酶切位点处，将所述片段克隆到包含编码富含组氨酸序列的核苷酸序列的载体中，将所述富含组氨酸的尾融合到SS5，得到第二表达载体，g)将所述第二载体插入到第二宿主微生物中，所述载体在其中被表达，h)在适宜的培养条件孵化所述转化的微生物，以合成可溶、活性形式的SS5，i)分离并纯化活性形式的SS5。12.-权利要求11中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于步骤b)得到构建体pSS5。13.-权利要求11或12任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于步骤c)中所用的用于扩增pSS5的第一宿主微生物是大肠杆菌(E.coli)细菌XL1Blue。14.-权利要求11至13任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于步骤d)中所用的限制性内切酶是NcoI和NotI。15.-权利要求11至14任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于，步骤f)中，步骤d)后释放的DNA片段克隆的限制酶切位点与质粒pET-28a(+)相同，得到pET-SS5质粒。16.-权利要求11至15任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于步骤g)中所用的第二宿主微生物是大肠杆菌BLR(DE3)菌株。17.-权利要求11至16任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于步骤g)中转化的菌株是CECT5849，其在步骤h)中在适宜的培养条件下孵化，以合成可溶的、活性形式的SS5。18.-权利要求11至17任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于合成SS5的适宜的培养条件包括将所述细菌培养物置于20℃的温度。19.-权利要求11至18任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于SS5的纯化优选地通过亲和层析和使用含有优选浓度为200mM的咪唑的洗脱缓冲液实现。20.-权利要求11至19任一项中要求的生产重组SS5的方法，其特征在于，为保持纯化的SS5酶处于活性形式，将所述从亲和层析洗脱下来的纯化酶立即进行透析，以去除任何痕量的咪唑。21.-按照权利要求1至10的方法的要求可获得的一种可溶的、活性的重组SSX酶产品，其特征在于其具有由SEQIDNO4序列代表的推断序列，并显示出蔗糖合酶(SS)活性。22.-权利要求21中要求的可溶的、活性的重组SSX酶产品，其特征在于，在蔗糖和UDP存在下，它具有80U/mg蛋白的特异活性，和Km(UDP)＝0.25mM和Km(蔗糖)＝30mM的动力学参数。23.-权利要求21和22的可溶的、活性的重组酶产品的SS5异构体，其可按照权利要求11至20的方法获得，其特征在于其具有SEQIDNO12序列所示的推断的氨基酸序列，并显示出蔗糖合酶(SS)活性。24.-权利要求23中要求的重组SS5异构体，其特征在于，在UDP和ADP存在下，它分别具有80U/mg蛋白和60U/mg蛋白的特异活性，和关于UDP和ADP的Km(UDP)＝Km(ADP)＝0.3mM的动力学参数。25.-权利要求21和22的酶产品在生产UDPG中的应用，其特征在于通过在适宜的条件下孵化UDP和SSX，接着分离和纯化产生的UDPG。26.-权利要求25中要求的应用，其特征在于其包括a)将100ml下述溶液在37℃孵化12h蔗糖1MHEPES，pH7.050mMEDTA1mM聚乙二醇20％MgCl21mMKCl15mMUDP100mMSSX30Ub)通过加热终止反应，优选地在100℃加热90s，c)10000g离心10min，d)将上述上层清液通过HPLC进行色谱分析，通过常规方法洗脱和纯化UDPG。27.-权利要求23和24的酶产品在生产ADPG中的应用，其特征在于通过在适宜的条件下孵化ADP和SS5，接着分离和纯化产生的ADPG。28.-权利要求27中要求的应用，其特征在于其包括e)将100ml下述溶液在37℃孵化12h蔗糖1MHEPES，pH7.050mMEDTA1mM聚乙二醇20％MgCl21mMKCl15mMADP100mMf)通过加热终止反应，优选地在100℃加热90s，g)10000g离心10min，h)将上述上层清液通过HPLC进行色谱分析，通过常规方法洗脱和纯化ADPG。29.-具有蔗糖合酶(SS)活性的酶产品在制造用于蔗糖的分光光度/荧光/电流测定的测定试剂盒中的应用。30.-权利要求29中要求的应用，其特征在于其包含下述孵化培养基a.2单位的SSb.2mMADPc.2单位的植物、动物或微生物源性的ADPG焦磷酸化酶d.2单位的PGMe.2单位的G6PDHf.0.5mM的NAD(P)g.100ml的反应缓冲液50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKClh.先前过滤的测试样品。31.-权利要求29中要求的应用，其特征在于其包含下述孵化培养基a.2单位的SSb.2mMUDPc.2单位的植物、动物或微生物源性的UDPG焦磷酸化酶d.2单位的PGMe.2单位的G6PDHf.0.5mM的NAD(P)g.100ml的反应缓冲液50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKClh.先前过滤的测试样品。32.-权利要求29中要求的应用，其特征在于其包含下述孵化培养基a.2单位的SSb.2mMUDPc.2单位的UDPG脱氢酶d.0.5mM的NADe.100ml的反应缓冲液50mMHEPES，pH7.0/1mMEDTA/20％聚乙二醇/1mMMgCl2/15mMKClf.先前过滤的测试样品。33.-权利要求29至32任一项中要求的应用，其特征在于存在于测定试剂盒中的SS不加区别地是SS4、SS5或SSX或其结合。34.-编码SS的DNA在生产表达SS的转基因植物中的应用，其特征在于将包含并表达所述DNA的基因构建体插入到合适的载体，并将所述基因构建体转入植物的基因组。35.-权利要求34中要求的应用，其特征在于所用的cDNA编码SSX。36.-权利要求35中要求的应用，其特征在于其包含下述步骤a)在pSS质粒中分别在5’和3’区域连续插入启动子35S和终止子NOS，插入编码SS的SSX基因或任意其它版本，以产生质粒p35S-SS-NOS，其限制性酶切图谱如图4B所示，b)将p35S-SS-NOS用酶NotI、T4DNA聚合酶和HindIII连续消化，c)将所产生的片段克隆到预先用EcoRI、T4DNA聚合酶和HindIII连续消化的二元质粒pBIN20中，获得图4C所示的质粒pBIN35S-SS-NOS，d)在大肠杆菌(E.coli)(XL1Blue)中扩增pBIN35S-SS-NOS，e)将前述步骤扩增的基因构建体插入到根癌农杆菌C58:GV2260中，获得转化的菌株CECT5851f)用转化的菌株CECT5851转染植物。37.-权利要求35中要求的应用，其特征在与它包含下述步骤a)在pGEMT质粒中连续插入编码RUBISCO小亚基的基因的启动子，以产生质粒pGEMT-RBCSprom，其限制性酶切图谱如图5A所示，b)将pGEMT-RBCS用酶HindIII和NcoI消化，以将释放出的片段插入到p35S-SS-NOS对应的限制酶切位点，得到pRBCS-SS-NOS，其限制性酶切图谱如图5B所示，c)将pRBCS-SS-NOS用酶HindIII、T4DNA聚合酶和NotI连续消化，并将释放出的片段克隆到用HindIII、T4DNA聚合酶和EcoRI连续消化的pBIN20中，得到pBINRBCS-SS-NOS，其限制性酶切图谱如图5C所示，d)在大肠杆菌(E.coli)(XL1Blue)中扩增pBINRBCS-SS-NOS，g)将前述步骤扩增的基因构建体插入到根癌农杆菌C58:GV2260中，并用转化的菌株转染植物。38.-通过权利要求33至37的应用的方法可获得的转基因植物，其特征在于过量表达SS酶活性。39.-权利要求37中要求的转基因植物，其特征在于所述过量表达认为SS酶活性水平比处于非转基因的野生型植物的相同组织中的SS酶活性水平高约2-10倍。40.-权利要求38或39中要求的转基因植物，其特征在于其们优选地选自烟草、马铃薯、番茄或稻属植物。41.-权利要求38至40之任一项中要求的转基因植物，其特征在于，另外，它们具有更高的蔗糖、G6P、ADPG和淀粉含量，高于在同样条件下生长的对应的野生型植物的相同组织或器官中观察到的结果。42.-权利要求40中要求的转基因植物，其叶片具有的蔗糖、G6P、ADPG和淀粉含量、以及直链淀粉/支链淀粉比例，高于在对应的野生型植物的叶片中观察到的结果。43.-权利要求40中要求的转基因植物，其根、块茎和/或种子具有的蔗糖、G6P、ADPG和淀粉含量、以及直链淀粉/支链淀粉比例，高于在对应的野生型植物的相同组织或器官中观察到的结果。全文摘要本发明涉及一种用于大量可溶性重组的SS在其活性形式的有效生产的方法，其通过在一种大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株内表达编码SS的基因。所应用的表达载体使得这样生产的重组SS具有组氨酸尾，从而有助于其快速纯化。另外，本发明描述了SS基因的突变版本的序列，其编码适于产生ADPG的SS异构体。利用“野生型”和“突变型”版本的重组体SS，本发明还描述了一种有效用于生产ADPG和UDPG的方法。本发明进一步描述了将SS用于生产测定蔗糖的测试试剂盒的应用。最后，本发明描述了一种获得转基因植物的方法，所述转基因植物组成性地过量表达或在其储藏器官或叶片中过量表达SS基因，并且由于SS的高ADPG合成活性，该转基因植物具有高浓度的(在叶片和储藏组织中)蔗糖、ADPG、G6P和淀粉。文档编号C12Q1/48GK1984994SQ200580004166公开日2007年6月20日申请日期2005年1月27日优先权日2004年2月5日发明者M·E·巴罗哈费尔南德斯,F·J·穆尼奥斯佩雷斯,F·J·波苏埃塔罗梅罗,M·T·莫兰索萨诺,N·阿隆索卡萨胡斯申请人:纳瓦拉公立大学,科学研究高等机关