专利名称:蔗糖磷酸化酶的突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蔗糖磷酸化酶突变体及其应用，特别涉及一种对蔗糖磷酸化酶的改造，使其能够提高对蔗糖降解的活性。
背景技术：
蔗糖作为植物中通过光合作用产生的糖类物质，是一种含量丰富的生物质，全球蔗糖的年产量超过了 5亿吨。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖通过1，2糖苷键组成的二糖，该二糖分解而成的单糖长期以来作为发酵工业中的碳源而被利用，特别是水解发酵产酒精工业的应用。
蔗糖磷酸化酶Sucrose phosphorylase (EC 2. 4. 1. 7)是一类催化蔗糖生成果糖和1-磷酸葡萄糖的酶。1-磷酸葡萄糖跟着被转化成6-磷酸葡萄糖，6-葡萄糖和果糖进入微生物的糖酵解发酵途径得到有机醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化工产品(Van Laere, K. Μ. J., et al. ，2000， Fermentation of Plant Cell Wall Derived Polysaccharides and Their Corresponding 01igosaccharides by Intestinal Bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry,48(5) : 1644-1652.)。
g ItrS^^ WffKi Bifidobacterium species, Streptococcus species，Leuconostoc species and Pseudomonas这些菌中纯化或是克隆、表达这些酶并进行功能鉴定。Broek等人对来自Bifidobacterium adolescentis DSM20083的蔗
(van den Brock, L. Α. , et al. ,2004, Physico-chemical and transglucosyIation properties of recombinant sucrose phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis DSM20083. Appl Microbiol Biotechnol，65 (2) 219-27.) JALeuconostoc mesenteroides B-1149 中 Lee 等人克隆和表达了一个蔗糖磷酸化酶 Spase (Lee，J. -H.，et al.，2006，Molecular cloning of a gene encoding the sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides B_1149and the expression in Escherichia coli. Enzyme and Microbial Technology,39 (4) :612_620.) ；Sugimoto 等人克隆和鉴定了一个来自Streptococcus mutens的蔗糖磷酸化酶(Sugimoto，K.， et al.,2007, Novel transglucosylating reaction of sucrose phosphorylase to carboxylic compounds such as benzoic acid. J Biosci Bioeng，104 (1) :22_9·)； Lee等人从Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742中克隆了一个蔗糖磷酸化酶基因， 并在大肠杆菌中进行表达(Lee, J. H.，et al.，2008，Cloning and expression of the sucrose phosphorylase gene from Leuconostoc mesenteroides in Escherichia coli. Biotechnol Lett,30 (4) :749_54.)。
蔗糖水解酶类(蔗糖水解酶、蔗糖磷酸化酶等)是降解蔗糖代谢途径的第一个酶， 也是微生物蔗糖代谢途径中的关键酶之一，是决定蔗糖发酵时间的最主要的因素之一。因此寻找新的蔗糖水解酶于构建新的更适合工业化生产各种化工产品的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的转化效率和水解速度，从而缩短发酵生产时间，对于降低直接发酵甘蔗汁生产各种化工产品的生产成本具有十分重要的意义。
蔗 糖磷酸化酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families) (Davies G.，Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3 :853_859 ；Henrissat B. , Bairoch A. 1996.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316 =695-696) 根据碳水化合物活性酶数据库(http//www. cazy.org/fam/acc_GH.html)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有112 个家族。蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶类家族13。
美国密苏里州孟山都公司公开了有关蔗糖磷酸化酶的中国专利申请号 96193014公开号1180380发明名称植物中蔗糖磷酸化酶的表达，发明人G. F.巴尔莱； J. W.德韦尔德；G.M.基肖雷；M.L.维尔登，文摘通过用一种基因的转化作用向植物引入蔗糖磷酸化酶活性，因为这种酶提高蔗糖水解速度，产生提高的淀粉，油和蛋白质水平。优选的基因来自变异链球菌。出人意料地实现在马铃薯块茎中转化以表达该基因，减小擦伤变色敏感性和提高淀粉在块茎中分布的均勻度。主权利要求
一种产生转基因植物的方法，包括下面步骤(a)向植物细胞基因组中插入重组双链DNA分子，该分子包括(i)在靶植物组织细胞中起作用的启动子，(ii)引起编码蔗糖磷酸化酶的RNA序列产生的结构DNA 序列，(iii)在植物细胞中起作用，引起转录中止和向RNA序列3'末端加入聚腺苷酸化核苷酸的3'非翻译DNA序列；(b)获得转化的植物细胞；和(c)从所述转化过的植物细胞中再生出一种基因工程转化的植物，其基因组包含步骤(a)所述重组双链DNA分子。优先权项US 1995-2-1008/386，860PCT项进入国家阶段日1997年9月30日，国际申请号PCT/ US96/01959国际申请日1996年2月8日，国际公布日1996年8月15日，国际公布号 Μ^βΛΑΘΤΘΖΟ ^-ΙΙ-ΖΘ。
上述公开文献报道的是变异链球菌在马铃薯块茎中转化以表达该基因，得到基因工程转化的植物。
本发明人在教学和科研中，对蔗糖磷酸化酶研究的过程中，发现磷酸蔗糖酶蔗糖的降解可以进行改造，经过实验室试验，提出了一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用的课题，并于2008年申请了中国专利，申请号200810073985，
公开日2009/12/23公告日公开号101608185，发明名称一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用，发明人杜丽琴；黄日波；韦宇拓，申请人广西大学，申请人地址广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学路100号，文摘一种编码蔗糖磷酸化酶的基因spgx，含有 SEQ ID NO :1的核苷酸序列或其功能等同变异体。它是通过对一个磷酸蔗糖酶进行DNA分子改造而得到。所述基因所编码的蛋白质具有水解蔗糖生成1-磷酸葡萄糖和果糖的功能， 但是缺失了逆向反应，不能把1-磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同时也缺失了对各种单糖的转糖苷作用。获得的新的基因可用于构建高效降解利用蔗糖的宿主菌，在蔗糖的降解中具有广泛的用途。主权利要求
一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ IDNO :1核苷酸序列或其功能等同变异体。但是该专利申请虽然公开了基因的表达以及缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶水解蔗糖的酶活，但没有给出缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶基因的效果，仪器测量的结果也没有给出。
发明内容
本发明的目的是通过对蔗糖磷酸化酶的改造，使之获得新的蔗糖磷酸化酶突变体，这个突变体酶可用于构建高效降解利用蔗糖的宿主菌，突变体酶的特殊在于水解蔗糖活性提高2. 1倍，该突变体酶可用于蔗糖的降解。
以上所述的新的蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V(SEQ ID NO :1)，其是通过分子改造蔗糖磷酸化酶基因unspase (GenBank序列号FJ472846)而得到的，具体是通过在unspase 分子上加入一段人工设计的核苷酸序列同时突变478位的氨基酸(由赖氨酸Lys突变成缬氨酸Val)，改造得到一个新的蔗糖磷酸化酶突变体。与原酶(Unspase)相比，新的蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V的酶活提高2. 1倍。
SEQ ID NO 1的蛋白质是蔗糖磷酸化酶突变体Spgx_478V，由501个氨基酸组成。
序列表具体如下
SEQ ID NO. 1
(1)序列特征
a.长度501氨基酸
b.类型多肽
c.链型单链
d.几何结构立体
(2)分子类型蛋白质
(3)序列描述
Met Lys Asn Lys Val Gln Leu lie Ala Tyr Val Asp Arg lie Ser
151015
Gly Gly Gly Phe Arg Lys Leu His Ala Pro Leu Thr Gly Pro Leu
16202530
Ala Glu lie Phe Gly Gly Ala His Leu Leu Pro Phe Phe Thr Pro
31354045
lie Asp Gly Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ser Asp His Thr Gln
46505560
Val Asp Pro Arg Leu Gly Thr Trp Asp Asp Val Arg lie Leu Gly
61657075
Gly Ala lie Glu Leu Val Ala Asp Leu lie Val Asn His Val Ser
76808590
Ser Ser Ser Pro Gln Phe lie Asp Tyr Ser Lys Lys Gly Ser Asp
9195100105
Ser Leu Tyr Ala Gly Met Phe Leu Thr Tyr Asp Arg Val Phe Pro
106110115120
Glu Gly Ala Arg Glu Ala Asp lie Leu Arg lie Tyr Arg Pro Arg
121125130135
Pro Thr Leu Pro Phe Ser Pro Val Thr Leu Ser Ser Arg Glu Arg[0041]136140145150
Lys Leu LeuTrp Thr ThrPhe Asn Pro GluGln Val Asp lie Asp
151155160165
Val Arg HisPro Glu AlaGlu Ala Tyr LeuHis Ser lie Leu Lys
166170175180
Lys Phe GlnAla Ala Glylie Arg Met lieArg Leu Asp Ala Val
181185190195
Gly Tyr Ala lie Lys LysPro Gly Ala SerCys Phe Met lie Pro
196200205210
Glu Thr PheAsp Phe lieAla Glu Leu ThrGlu Lys Ala Arg Ala
211215220225
Leu Gly lieGlu Val LeuVal Glu lie HisSer His Tyr Arg Lys
226230235240
Gln lie Glulie Ala ArgGln Val Asp TrpVal Tyr Asp Phe Ala
241245250255
Leu Pro ProLeu Val LeuHis Ala Leu PheAla Ser Asp Pro His
256260265270
Pro Leu Ala Gln Trp LeuSer lie Ser ProArg Asn Ala Val Thr
271275280285
Val Leu AspThr His AspGly lie Gly Vallie Asp Val Gly Ala
286290295300
Asp Ala GluGly Asn ProGly Leu Leu SerPro Ala Ala lie Asp
301305310315
Ser Leu ValGlu Thr lieHis Ser Arg SerGln Gly Gln Ser Arg
316320325330
Glu Ala ThrGly Ala AlaAla Asn Asn LeuAsp Leu Tyr Gln Val
330335340345
Asn Cys ThrPhe Leu AspAla Leu Gly GlyArg Glu Pro Asp Tyr
346350355360
Leu lie Ala Arg Ala LeuGln Phe Phe AlaPro Gly lie Pro Gln
361365370375
Val Tyr TyrVal Gly LeuLeu Gly Gly ThrAsn Asp Met Asp Leu
376380385390
Leu Gly Arg Ser Gly ValGly Arg Asp lieAsn Arg His Tyr Tyr
391395400405
Thr Asp Ala Glu lie AspAla Ala Leu AlaArg Pro Leu Val Arg
406410415420
Thr Leu lieAla Leu lieArg Leu Arg AsnThr His Pro Ala Phe
421425430435[0080]Ala Gly Glu Phe Asp Val Ser Val Pro Ala Ala Thr Gln lie Arg
436440445450
Leu Arg Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr Phe Glu
451455460465
His Trp lie Glu Leu His Val Asp Leu Ser lie Pro Val Ala Ser
466470475480
lie Thr Gly Thr Gly lie His Pro lie Thr lie Pro Gly Ala Ala
481485490495
Asp Ala Gly Ala Pro Ser0
496500
由上述可见，上述SEQ ID NO :1蔗糖磷酸化酶突变体的蛋白质478位的氨基酸发生了突变一由赖氨酸Lys突变成缬氨酸Val，虽然这个简单的氨基酸改变，却是本发明人经过很多次实验，从引物的设计到基因的表达等都进行了研究，并采用了很多科学手段和仪器才能够测量和重现的结果，属于非显而易见性。
以上的新的蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V(SEQ ID NO 1)的具体制备方法包括 unspase基因的克隆、蔗糖水解酶突变体基因的获得、蔗糖磷酸化酶突变体基因spgx-478V 的获得、蔗糖磷酸化酶突变体基因spgx-478V的表达和表达产物的纯化及蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V水解蔗糖酶活的测定步骤。
具体方案如下
材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)、载体、基因突变试剂盒、Ni-NTA蛋白质组氨酸纯化介质、内切酶、修饰酶。
l)unspase基因的克隆
用正向引物
5，-AGACAATTGATGCACCACCACCACCACCACAAAAATAAGGTTCAGCTTATTGCC-3，(包含一个 MunI酶切位点和一个6xHis标签在5，末端)和反向引物，5，_CACAAGCTTCGATGGAGCGCCGGCA TCGGC-3，(包含一个Hindi11酶切位点在5，端)进行PCR扩增。扩增产物用MunI和Hindi11 进行双酶切，然后连接到PSE380表达载体中，获得的重组质粒命名为pSE-imspase。
2)蔗糖磷酸化酶突变体基因spgx-478V的获得
spgx-478V基因是根据unspase基因序列信息通过在正向引物中加入一段核苷酸序列(GCGGCGAAACCAGCCAGGCCACGCTGACGTTCG)和将编码赖氨酸的AAG人为地突变成编码缬氨酸的GTG来进行改造。以1)中构建的pSE-imspase为模板，使用正向引物5’_CGCGGC GAAACCAGCCAGGCCACGCTGACGTTCGAACACTGGATTGAGCTGCATGTGGACTTGTCCATTCCAGTGGCT-3'禾P 反向引物 5，-GAACGTCAGCGTGGCCTGGCTGGTTTCGCCGCGCCAGCGAAGCCGGATTTG-3’ )进行 PCR， PCR反应程序第一步95°C 2分钟；第二步进行30个循环，循环为98°C 10秒，48°C 15秒， 720C 6分钟；第三步72°C 10分钟。PCR产物使用IyL Dpn I在37°C酶切一个小时，然后转化XLlO-Gold感受态细胞(CaCl2化学法转化)。转化产物克隆送交大连宝生物公司进行 DNA测序分析确定正确的转化子。
3)蔗糖磷酸化酶突变体基因spgx-478V的表达和表达产物的纯化
将含有质粒pSE-spgX-478V的重组大肠杆菌XLl-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉素(ΙΟΟμ g/mL)的LB培养基中，37°C振荡培养，待OD6tltl为0. 6时，加入IPTG (终浓度为 0. 5mmol/L)、L-三梨醇(终浓度为100mmol/L)和甜菜碱(终浓度为2. 5mmol/L)，20°C诱导 20小时。11000转离心3min，收集菌体，用4mL裂解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬菌体，超声波破胞9min。12000转离心lOmin，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4ml上清液加入ImL 50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇 60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加Iml冲洗缓冲液(50mmo VLNaH2PO4, 300mmol/ L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物 。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脱蛋白质。 收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。
4)蔗糖磷酸化酶突变体SpgX-478V水解蔗糖酶活的测定
蔗糖磷酸化酶突变体Spgx_478V水解蔗糖反应取5 μ L蔗糖磷酸化酶Spgx_478V 纯化物，与(w/v)蔗糖溶液(50mmol/L磷酸缓冲液(pH 7. 0))在500 μ L的反应体系中 37°C作用30分钟。反应时间到后，在100°C加热10分钟终止反应。蔗糖的水解能力用高效液相色谱法(HPLC)进行检测。HPLC检测的结果显示在使用相同酶量的酶情况下，蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V的水解蔗糖活性比突变前的蔗糖磷酸化酶Unspase提高2. 1倍。 这样，微生物水解蔗糖的速度将提高20%。
HPLC条件仪器AgilentllOO色谱仪；色谱柱氨基柱；流动相乙腈水 (70 30)；流速1. OmL/min ；检测器RID (折光检测器)。
由上述可见，SEQ ID NO 1是蔗糖磷酸化酶突变体Spgx，由501个氨基酸组成， 与本发明人原先的中国专利申请公开号101608185，发明名称一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用，不同的地方是根据unspase基因序列信息通过在正向引物中加入一段核苷酸序列(GCGGCGAAACCAGCCAGGCCACG CTGACGTTCG)和将478位编码赖氨酸的AAG人为地突变成编码缬氨酸的GTG同时进行改造而获得的。这个新的蔗糖磷酸化酶突变体和原酶相比具有水解蔗糖的活性获得提高，蔗糖的水解能力用高效液相色谱法 (HPLC)进行检测。HPLC检测的结果显示在使用相同酶量的酶情况下，蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V的水解蔗糖活性比突变前的蔗糖磷酸化酶Unspase提高2. 1倍。这样，微生物水解蔗糖的速度将提高20%。
图1是蔗糖磷酸化酶突变体SpgX-478V纯化物的SDS-PAGE图。
图2是突变前蔗糖磷酸化酶Unspase的水解蔗糖活性的H PLC图。
图3是蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V的水解蔗糖活性的HPLC图。
从图1 了解到，蔗糖磷酸化酶突变体Spgx-478V纯化物的分子量为55kDa。
从图2以及图3 了解到，蔗糖磷酸化酶Unspase的蔗糖水解产物果糖的峰面积只有1. 47336e5 (见图2和以下表1)，而蔗糖磷酸化酶突变体SpgX_478V的蔗糖水解产物果糖的峰面积为3. 13619e5,是蔗糖磷酸化酶Unspase中果糖峰面积的2. 1倍(见图3和表2)。
这表明蔗糖磷酸化酶突变体SpgX-478V的酶活力是蔗糖磷酸化酶Unspase的酶活力的2. 1倍。[0111]表1
权利要求
1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于-^iunspase分子上加入一段人工设计的核苷酸序列同时突变478位的氨基酸一由赖氨酸Lys突变成缬氨酸Val，改造得到一个新的蔗糖磷酸化酶突变体，蔗糖磷酸化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种宿主细胞，其是含有权利要求
1所述的蔗糖磷酸化酶突变体的原核细胞或真核细胞。
3.权利要求
1所述的蔗糖磷酸化酶突变体在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用。
专利摘要
本发明涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体，其特征是在unspase分子上加入一段人工设计的核苷酸序列同时突变478位的氨基酸-由赖氨酸Lys突变成缬氨酸Val，改造得到一个新的蔗糖磷酸化酶突变体，这个突变体酶相对于突变前的酶具有更高的水解蔗糖能力，比原酶Unspase的酶活提高2.1倍。
文档编号C12P19/02GKCN102021152 B发布类型授权 专利申请号CN 201010506913
公开日2012年1月11日 申请日期2010年10月14日
发明者庞浩, 杜丽琴, 胡媛媛, 陆坚, 韦宇拓, 黄日波 申请人:广西大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan