一种多肽及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种多肽及其应用。所涉及的多肽的氨基酸序列为：ypyygkllqpkylqpllavq。本发明的多肽通过血脑屏障进入星形胶质细胞，干扰内源性NDRG2与Na+/K+?ATPaseβ1的相互作用，抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸，提高脑细胞外液谷氨酸浓度。为中枢神经系统谷氨酸代谢相关研究提供一种工具肽段，并可作为精神分裂症和嗜睡症等与脑中谷氨酸含量不足相关的中枢神经系统疾病的治疗靶点选择。
【专利说明】
一种多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多肽及其在医学和药学研究中的应 用。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸是中枢神经系统最重要、含量最高的兴奋性神经递质。由于细胞外液缺乏 代谢谷氨酸的酶，突触前膜释放的谷氨酸主要通过周围的星形胶质细胞摄取。星形胶质细 胞主要以Na+/K +-ATPase依赖的方式摄取突触间隙的谷氨酸。很多中枢神经系统疾病，如精 神分裂症和嗜睡症等与脑中谷氨酸含量不足有关。
【发明内容】
[0003] NDRG2(Human N-myc downstream regulated gene 2)基因在脑、心脏、骨骼肌等 组织中表达含量很高。在哺乳动物脑中，NDRG2主要表达于星形胶质细胞。
[0004] 发明人研究发现星形胶质细胞中，NDRG2可以与Na VK+-ATPasem亚基相互作用，并 抑制NaVK+-ATPasem亚基的降解，从而调控NaVK+-ATPase依赖的谷氨酸摄取。NaVK +-ATPasem是Na+/K+-ATPase的组成性亚基，对于Na+/K+-ATPase全酶发挥正常的生理功能必 不可少。
[0005] 发明人研究发现NaVK+-ATPasem244-263片段是其与NDRG2相互作用的关键片段。外 源性给予该关键片段，可以通过竞争性结合阻断内源性NDRG2与Na+/K +-ATPasem的相互作 用，抑制星形胶质细胞对谷氨酸的摄取能力，提高脑细胞外液中的谷氨酸浓度和中枢神经 系统的兴奋性。发明人研究发现，多肽β?244-263 : ypyygkl lqpkylcipl Iavq具有相关活性。
[0006] 为此本发明目的之一提供一种多肽，该多肽的氨基酸序列为：
[0007] ypyygkllqpkylqpllavq。
[0008] 本发明目的之二提供上述多肽干扰内源性NaVK+-ATPasem与NDRG2结合的应用。
[0009] 本发明目的之三提供上述多肽干扰星形胶质细胞摄取脑中突触间隙的谷氨酸的 应用。
[0010] 本发明目的之四提供了上述多肽用于制备治疗精神分裂症和嗜睡症药物的应用。
[0011] 考虑到大于6个氨基酸的多肽一般不能穿过血脑屏障，难以在脑内达到有效的蛋 白浓度。
[0012] 本发明目的之五提供了一种融合肽，该融合肽包括穿膜肽和上述多肽β1244-263 : ypyygkl lqpky Iqpl Iavq，所述穿膜肽为 TAT、VP22、AntP、Po Iyarginine 或 Poly lysine等，可 携带与其融合的肽段穿透血脑屏障并进入细胞膜。
[0013] 进一步，本发明目的之六提供了一种融合肽，该融合肽的氨基酸序列为：
[0014] YGRKKRRQRRRypyygk11qpkyIqp11avq 〇
[0015] 本发明目的之七提供了上述融合肽干扰内源性Na+/K+-ATPasem与NDRG2结合的应 用。
[0016] 本发明目的之八提供上述融合肽干扰星形胶质细胞摄取脑中突触间隙的谷氨酸 的应用。
[0017] 本发明目的之九提供了上述融合肽用于制备治疗精神分裂症和嗜睡症药物的应 用。
[0018] 本发明的多肽通过血脑屏障进入星形胶质细胞，干扰内源性NDRG2与NaVK+-ATPasem的相互作用，抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸，提高脑细胞外液谷氨酸浓度。为中枢 神经系统谷氨酸代谢相关研究提供一种工具肽段，并可作为精神分裂症和嗜睡症等与脑中 谷氨酸含量不足相关的中枢神经系统疾病的治疗靶点选择。
【附图说明】
[0019] 图1:高效液相色谱检测TAT-W244-263融合肽纯度大于99% ;
[0020]图2:体外培养的星形胶质细胞中NDRG2可以与NaVK+-ATPasem亚基相互作用； [0021] 图3:将NaVK+-ATPasem亚基逐步截短并利用免疫共沉淀筛选出其与NDRG2相互作 用的位点位于NaVK +-ATPasem亚基244-304肽段中；
[0022] 图4:将NaVK+-ATPasem亚基244-304肽段进一步截短并连接TAT穿膜肽段:ΤΑΤ-β 1244-263，ΤΑΤ-βΙ 264-283，ΤΑΤ-βΙ 284-304 ,在体外培养的星形胶质细胞中利用免疫共沉淀证实 ΤΑΤ-β1244-263可以干扰内源性NDRG2与NaVK+-ATPasem亚基相互作用；
[0023]图5:使用绿色荧光素 FITC标记的谷氨酸(FITC-Glu)检测星形胶质细胞对于谷氨 酸的再摄取，发现ΤΑΤ-β1244-263处理后与对照肽段处理组相比，谷氨酸摄取明显减少；
[0024]图6:小鼠锁骨下静脉注射ΤΑΤ-β1244-263后，分别提取小鼠皮层和纹状体组织蛋白， 利用免疫共沉淀证实ΤΑΤ-β1244-263可以干扰内源性NDRG2与NaVK+-ATPasem亚基相互作用； [0025]图7:微透析实验证实，使用ΤΑΤ-β1244-263处理后小鼠脑外液谷氨酸含量明显升高。
【具体实施方式】
[0026]以下实验中所选用穿膜肽为ΤΑΤ，携带与其融合的肽段穿透血脑屏障并进入细胞 膜，实现该功能的穿膜肽还有评22、4拉？、？〇173坪;[11；[116或?017178；[116等。
[0027] 一、构建多肽：
[0028] 发明人前期研究发现在体外培养的星形胶质细胞中NDRG2可以与NaVK+-ATPasem 亚基相互作用（图2 )，并抑制Na+A+-ATPasem亚基的降解。通过逐步截短NaVK+-ATPasem 亚基，筛选并发现NaVK+-ATPasem第244-304片段中，包含两种蛋白相互作用的关键位点 (图3)。为进一步明确这61个氨基酸构成的肽段中与NDRG2相互作用的最重要的肽段，发明 人将244-304肽段进一步截短，分别构建了 ： β?244-263、β?264-283和β?284-304 ;
[0029] 二、构建融合肽
[0030] 构建:ΤΑΤ-β?244-263、ΤΑΤ-β?264-283和ΤΑΤ-β?284-304,使三个肽段均具有穿透血脑屏障 进入脑内的能力。
[0031] 以ΤΑΤ-β?244-263融合肽为例，其制备方法如下：
[0032] (A)称取Ig氯树脂于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡；
[0033] (B)2小时后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；
[0034] (C)称取182mg Fmoc-Asn(trt)-〇H(根据树脂取代度计算）于IOml的离心管中，加 入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀lmin，待溶液澄清后加入到反应器中， 然后将反应器置于30°C的摇床中反应；
[0035] (D)2小时后，用IOML的甲醇封头（甲醇:DIEA: DCM= 1:1:2)半小时，然后用DMF洗涤 四次，抽干待用；
[0036] (E)向反应器中加入20ML的20 %哌啶（哌啶/DMF = 1: 4)，放在脱色摇床上摇晃 20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干；
[0037] (F)取少量树脂用茚三酮法检测（检A(茚三酮）、检B(吡啶）各两滴，100°C反应 Imin)，树脂有颜色，说明脱保护成功；
[0038] (G)称取一定量的Fmoc-Ser(tbu)-〇H和HOBT于IOml的离心管中，加入5ml的DMF将 其溶解，然后加入〇.5ml的DIC振荡摇匀lmin，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器 置于30°C的摇床中反应；
[0039] (H) 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测（检A、检B各两滴，10 0 °C反应 Imin )，若树脂为无色，说明反应完全，若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；
[0040] (I)待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20 % 哌啶(哌啶/DMF=I :4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱 完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去；
[0041] (J)按照步骤(G)-(I)依次接上剩余氨基酸；
[0042] (K)脱去最后一个氨基酸Y的保护后，用切割试剂切割下肽链冻干，送纯化用高效 液相色谱进行纯化分离；
[0043] (L)待纯化制备检测纯度大于99%可进行使用；
[0044] (M)_20°C保存制备好的粉剂，使用时准确称量，溶解于生理盐水中，离体实验浓度 为20μΜ，在体实验浓度为10mg/kg。
[0045]给小鼠锁骨下静脉注射ΤΑΤ-β1244-263融合肽段，2小时后利用微透析系统收集小鼠 脑细胞外液，并通过HPLC检测脑细胞外液中谷氨酸的浓度，结果表明ΤΑΤ-β1244-263融合肽段 能显著增加小鼠脑细胞外液中谷氨酸的含量。
[0046] 三、体外实验
[0047] 实验所用材料:ΤΑΤ-β?244-263、ΤΑΤ-β1264-283、ΤΑΤ-β?284-304三种肽段、体外培养2周的 小鼠皮层星形胶质细胞、绿色荧光素 FITC标记的谷氨酸。
[0048] 实验过程：
[0049] 在细胞水平利用免疫共沉淀的方法证实:体外培养的原代星形胶质细胞分别用终 浓度20μΜ ΤΑΤ-β?244-263、ΤΑΤ-β?264-283、ΤΑΤ-β?284-304三种肽段处理2小时，完成免疫共沉淀实 验。结果表明ΤΑΤ-β?244-263处理组内源性NDRG2与NaVK +-ATPasem亚基相互作用几乎被完全 阻断（图4)。而ΤΑΤ-β1264-283和ΤΑΤ-β?284-304处理组没有明显的阻断效应。
[0050] 将制备好的TAT-m244-263融合肽段加入体外培养2周的星形胶质细胞，终浓度20μ Μ，不同时间点在激光共聚焦活细胞工作站下观察FITC标记的谷氨酸的摄取情况，结果显示 ΤΑΤ-β1244-263融合肽可显著抑制星形胶质细胞对培养液中外源谷氨酸的摄取（图5)。
[0051] 四、体内实验
[0052] 实验所用材料:ΤΑΤ-β1244-263融合肽、C57小鼠。
[0053] 实验过程：
[0054]在体实验通过给小鼠锁骨下静脉注射TAT-m244-263肽段后，2小时后分别取皮层及 纹状体组织提取蛋白，采用免疫共沉淀方法进行检测，进一步证实:经过TAT-m244-263处理 后，内源性NDRG2与NaVK +-ATPasem亚基相互作用明显减弱（图6)。
[0055] 体内实验证实，ΤΑΤ_β?244-263肽段可与NDRG2结合并干扰内源性NaVK+-ATPasem亚 基与NDRG2结合，从而干扰内源性NaVK+-ATPasem亚基的作用，影响了NaVK+-ATPase全酶 的正常功能，使星形胶质细胞无法维持Na +跨膜浓度梯度，谷氨酸摄取能力明显降低。ΤΑΤ-β 1244-263肽段静脉注射2h后，采用微透析技术，获得小鼠纹状体脑区的细胞外液，通过HPLC法 检测细胞外液中的谷氨酸含量，结果表明小鼠脑中谷氨酸浓度显著提高（图7)。
【主权项】
1. 一种多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如SEQ NO 1所示。2. 权利要求1所述多肽干扰内源性Na+/K+-ATPaSem与NDRG2结合的应用。3. 权利要求1所述多肽干扰星形胶质细胞摄取脑中突触间隙的谷氨酸的应用。4. 权利要求1所述多肽用于制备治疗精神分裂症或嗜睡症药物的应用。5. -种融合肽，其特征在于，该融合肽包括穿膜肽和权利要求1所述多肽，所述穿膜肽 为TAT、VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine。6. -种融合肽，其特征在于，该融合肽的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。7. 权利要求5所述融合肽干扰内源性Na+/K+-ATPaSem与NDRG2结合的应用。8. 权利要求5所述融合肽干扰星形胶质细胞摄取脑中突触间隙的谷氨酸的应用。9. 权利要求5所述融合肽用于制备治疗精神分裂症和嗜睡症药物的应用。
【文档编号】A61P25/18GK105861462SQ201610207801
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】熊利泽, 李燕, 尹安琪, 郭航
【申请人】中国人民解放军第四军医大学